Questo è il primo protocollo per purificare e coltura simultaneamente ed efficientemente i motoneuroni oculari e spinali primari dai topi embrionali. Consente lo studio dei meccanismi alla base della malattia dei motoneuroni. Questo protocollo aggiunge un nuovo componente di coltura oculomotoria in vitro ai sistemi esistenti e fornisce colture di motoneuroni spinali pure e di età abbinate all'età per il confronto.
Nella sclerosi laterale amiotrofica, i motoneuroni spinali degenerano mentre i neuroni oculomotori sono relativamente risparmiati. Il confronto di queste culture potrebbe fornire informazioni sul meccanismo e sulla terapia delle malattie. Questo metodo faciliterà gli studi sui meccanismi alla base dello sviluppo dei motoneuroni, delle malattie e della vulnerabilità selettiva.
Il nostro sistema di coltura consente la caratterizzazione della morfologia dei motoneuroni, della biologia molecolare e dell'elettrofisiologia. Per coloro che sono nuovi a questa tecnica, consigliamo molta pratica. La dissezione può essere tecnicamente impegnativa e possono essere necessari più dissettori per ottenere neuroni sufficienti per la coltura primaria.
Inizia raccogliendo embrioni positivi isolotto1 FEG da un topo incinta circa 11,5 giorni dopo la fecondazione. Spruzzare accuratamente l'addome con etanolo e rimuovere l'utero con forbici sterili a microdisezione e forcette per medicazione del pollice. Lavare brevemente l'utero in PBS sterile.
Quindi trasferirlo nella piastra di dissezione riempita con PBS sterile pre-refrigerato. Sotto la luce intensa del microscopio, rimuovere con cura gli embrioni dall'utero usando forbici a microdissezione, pinze per medicazione del pollice e pinzette Dumont 5. Quindi utilizzare un mini cucchiaio forato Moria sterile per trasferire ogni embrione in un pozzo separato di una piastra da 24 po 'piena di mezzo di ibernazione pre-refrigerato E a bassa fluorescenza integrato con 1X V27.
Mantenendo la piastra sul ghiaccio, trasferire un embrione su una piastra di dissezione sterile e coprirlo completamente con la soluzione salina bilanciata o l'HBSS sterile di Hank. Utilizzare una pinzetta per rimuovere la faccia dell'embrione e la coda senza danneggiare il cervello medio. Quindi posizionare l'embrione incline con gli arti a cavallo e la coda rivolta verso la parte anteriore del microscopio.
Utilizzare le pinzette per aprire il tetto del quarto ventricolo per generare una piccola apertura. Utilizzare questa apertura per agganciare le pinzette nello spazio creato tra il quarto ventricolo e il suo tetto. Sezionare lungo la superficie dorsale dell'embrione rostrale fino alla corteccia e laterale alla piastra del pavimento e alla colonna motoria.
Quindi aprire il tessuto sezionato in modo aperto per rivelare i nuclei positivi GFP CN3 e CN4. Separare accuratamente il midbrain ventrale dall'embrione e rimuovere il tessuto meningeo con una pinzetta e un coltello a microdisezione. Sezionare i nuclei bilaterali GFP positivi CN3 e CN4 lontano dalla piastra del pavimento e da altri tessuti circostanti positivi alla GFP, facendo attenzione a evitare di toccare o danneggiare i neuroni.
Se si raccolgono nuclei CN3 e CN4 separati, tagliare lungo il midbrain di questi due nuclei e utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto ventrale del cervello sezionato con HBSS minimo. Posizionarlo in un tubo di microcentrifugo da 1,7 millilitri etichettato riempito con mezzo di dissezione e conservare il tubo sul ghiaccio fino alla dissociazione. Continuare a estrarre le midbraine ventrali da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo fino a quando il numero totale non soddisfa i requisiti sperimentali.
Per sezionare il midollo spinale ventrale, mantenere l'embrione incline con la testa rivolta verso la parte anteriore del microscopio. Tienilo con un paio di pinzette e inserisci la punta dell'altra coppia nella parte caudale non aperta del quarto ventricolo. Aprire dorsalmente il resto del cervello posteriore e del midollo spinale su tutta l'estensione rostrocaudale dell'embrione.
Tagliare il tessuto dorsale partendo dal quarto ventricolo e lavorando verso il canale centrale del midollo spinale caudale usando le forcep come forbici. Quindi tenere l'embrione con una serie di pinzette e pizzicare il lembo del tessuto dorsale su ciascun lato con l'altra coppia. Rimuovere il midollo spinale ventrale utilizzando il coltello a microdisezione per perforare direttamente sotto la SMN positiva della GFP sollevando il midollo spinale ventrale con movimenti simili a seghe su entrambi i lati.
Tagliare il midollo spinale trasversalmente al limite superiore dell'arto inferiore e rimuovere la porzione lombare cervicale. Tagliare trasversalmente direttamente sopra C1 dove si proietta il primo corno anteriore positivo GFP. Posizionare il lato dorsale del midollo spinale ventrale verso l'alto e tenerlo premendo il tessuto negativo GFP tra le colonne SMN positive del GFP con un paio di pinzette.
Rimuovere il mesenchima, i DRG e il midollo spinale dorsale rimanenti tagliando entrambi i lati della colonna SMN positiva GFP con il coltello a microdisezione. Utilizzare una pipetta P1000 per raccogliere il tessuto del midollo spinale ventrale sezionato con HBSS minimo e posizionarlo in un tubo di microcentrifugo a 1,7 millilitri etichettato riempito con mezzo di dissezione. Conservalo sul ghiaccio fino alla dissociazione e continua a estrarre midollo spinale ventrale da embrioni aggiuntivi nello stesso tubo.
Aggiungere il volume appropriato di soluzione di papaina a ciascuno dei tubi di microcentrifugo con i campioni di tessuto sezionati. Incubare i tubi a 37 gradi Celsius per 30 minuti agitando i tubi ogni 10 minuti con il tocco delle dita. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente ogni sospensione otto volte con una pipetta P200 e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti.
Rimescolare il pellet cellulare con il volume appropriato di soluzione inibitore ovomucoide di albumina pipettando delicatamente su e giù. Ripetere la centrifugazione. Quindi rimuovere con cura il supernatante con una pipetta P1000.
Rimospendare le cellule nel volume appropriato del mezzo di dissezione. Filtrare le sospensioni attraverso un filtro a celle da 70 micrometri. Utilizzare quindi l'ordinamento FACS per isolare le celle positive GFP sezionate da CN3/CN4 e SMN.
Diluire le sospensioni cellulari isolate con il mezzo di coltura del motoneurone pre-riscaldato a 37 gradi Celsius alle densità appropriate e aggiungere 200 microlitri della sospensione a un pozzo di una piastra a 96 pozzetti rivestita con laminina PDL. Cultura i neuroni in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi Celsius e 5% assicurandosi di rinfrescare il mezzo di coltura dei motoneuroni ogni cinque giorni. Quando i neuroni isolati con successo sono stati coltivati in coltura, le colture primarie quasi pure CN3/CN4 e SMN sono state ottenute e mantenute per 14 giorni in vitro.
Le purità delle colture a due giorni in vitro sono state del 93,5% per CN3/CN4 e dell'86,7% per smn se valutate mediante immunocitochimica con il marcatore del motoneurone Islet1 e il marcatore neuronale TUJ1. Le purità si basavano fortemente sull'età degli embrioni e sulla fissazione delle soglie appropriate per i cancelli della GFP durante la FACS. La purezza dei neuroni isolati dagli embrioni E10.5 era paragonabile a quella degli embrioni E11.5.
Tuttavia, la purezza è diminuita significativamente quando sono stati utilizzati embrioni E13.5. Per determinare se il CN3/CN4 primario e le SN hanno mostrato risposte differenziali agli stressanti del reticolo endoplasmatico, le cellule sono state trattate con concentrazioni variabili di acido ciclopiazonico o CPA a due giorni in vitro e fissate tre giorni dopo per l'immunocitochimica per valutare i rapporti di sopravvivenza. Il numero di neuroni vitali in ogni campione è stato conteggiato e sono stati calcolati i rapporti di sopravvivenza.
Le monocolture CN3/CN4 erano significativamente più resistenti al trattamento CPA rispetto alle monocolture SMN. Seguendo questa procedura, molti metodi aggiuntivi possono essere eseguiti per esaminare i motoneuroni. Alcuni esempi includono studi di elettrofisiologia, biologia cellulare, trascrizione o accessibilità alla cromatina.
