Enucleare gli occhi di un topo soppresso, marcando il lato temporale a scopo di orientamento. Rimuovere la camera anteriore. Quindi rimuovere il cristallino e il vitreo e posizionare le conchiglie oculari in paraformaldeide per 30 minuti.
Lavare le conchiglie oculari con PBS per 30 minuti. Sostituzione della soluzione tre volte. Quindi, lavare con Triton X-100 allo 0,5% per 30 minuti.
Incubare le conchiglie oculari nel tampone bloccante per due ore a temperatura ambiente. Dopo l'immunocolorazione, isolare le retine dalle conchiglie oculari utilizzando un microscopio. Dividi le retine in quattro foglie e montale in piano con lo strato di cellule gangliari retiniche rivolto verso l'alto.
Assicurarsi che il segno sul lato temporale rimanga attaccato per l'orientamento. Coprire le retine con il mezzo di montaggio. Posizionare i vetrini di copertura.
E sigilla i vetrini con lo smalto. Accendere il microscopio confocale e, in modalità Localizzazione, individuare l'area di interesse utilizzando l'oculare. Passa alla modalità di acquisizione e imposta i riquadri in modo che coprano l'intera retina, insieme alle sezioni Z-Stack per tutti i livelli di informazioni.
Visualizza almeno 25 tessere su tutta la retina per ottenere un volume totale. Proietta le fette Z-Stack per generare immagini bidimensionali di microscopia confocale sul viso. Il fibrogramma composito vis-OCT viene confrontato con la corrispondente immagine confocale della retina piatta immunocolorata con TuJ1 per gli assoni RGC.
I vasi sanguigni mostrano strutture ramificate distinguibili che possono essere abbinate ai vasi sanguigni marcati ICAM-2 sull'immagine confocale. Il confronto fianco a fianco tra microscopia confocale ex vivo e in vivo vis-OCT ha rivelato reti identiche di fasci assoniali RGC e vascolarizzazione retinica circostante.
