Questo metodo presenta un modo per creare impalcature derivate da tessuto nativo che possono essere utilizzate per la rigenerazione della cartilagine. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i componenti della cartilagine nativa sono conservati nelle impalcature che possono promuovere la formazione e la rigenerazione della cartilagine in vitro e in vivo. Sebbene questo metodo utilizzi cartilagine da giunti soffocanti equini, può essere utilizzata anche cartilagine da qualsiasi altra articolazione.
Per iniziare, ottenere un'articolazione cadaverica intatta per l'isolamento della cartilagine e rimuovere il grasso in eccesso della pelle e il tessuto muscolare come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Successivamente, definire la posizione in cui il giunto si articola eseguendo l'inflessione dell'estensione del giunto. Fare un'incisione orizzontale per raggiungere la cavità articolare.
Successivamente, fare un'incisione verticale per aprire l'area del giunto. La cavità articolare è riempita con liquido sinoviale che probabilmente gocciola dalla cavità quando si esegue una corretta incisione. Continuare ad aprire completamente l'articolazione rimuovendo grasso eccessivo, muscoli e tendini e tagliando i tendini che tengono insieme l'articolazione.
Ispezionare attentamente la cartilagine per eventuali danni macroscopici. Se la cartilagine articolare non ha un aspetto liscio più lucido o se sono presenti prove, vesciche, fenditure o difetti, scartare la cartilagine e ricominciare. Utilizzare un bisturi sterile per rimuovere la cartilagine dall'osso.
Tagliare fino all'osso subcondrale per rimuovere la cartilagine della zona profonda. Raccogliere le fette di cartilagine rimosse in tubi da 50 millilitri contenenti soluzione di lavaggio della cartilagine precedentemente preparata. Durante la lavorazione, gocciolare regolarmente la soluzione di lavaggio della cartilagine sulla cartilagine per evitare che la cartilagine si asciughi.
Dopo aver raccolto la cartilagine da tutte le aree di interesse, agganciare congelare le fette di cartilagine in azoto liquido per cinque minuti. Quindi trasferire le fette di cartilagine in tubi da 50 millilitri e posizionare immediatamente le fette congelate in un essiccatore. Liofilizzare le fette di cartilagine per 24 ore con l'essiccatore a congelamento.
Al termine, conservare le fette di cartilagine liofilizzato in un luogo asciutto a temperatura ambiente. Per la lavorazione manuale, prerischire un mortaio e pestello con azoto liquido, quindi posizionare le fette di cartilagine liofilizzate nella malta e immergerle e azoto liquido. Macinare direttamente i campioni a mano per circa 45 minuti fino a quando non sono sufficientemente polverizzati.
In alternativa, per macinare automaticamente i campioni utilizzando una fresatrice, iniziare preraffreddando il vano di rettifica della fresatrice aggiungendo azoto liquido. Quindi aggiungere le fette di cartilagine liofilizzate e fresare il campione alla sua velocità preimpostata per alcuni secondi fino a un minuto. Assicurarsi che tutte le particelle siano macinate e che nessuna particella rimanga nella parte inferiore del compartimento di rettifica.
Infine, seguire la tecnica di decellularizzazione descritta nel protocollo di testo di accompagnamento prima di formare impalcature. Trasferire le particelle di cartilagine con una piccola etichetta su uno stampo cilindrico in plastica. Premere tutte le bolle d'aria per evitare cavità nell'impalcatura e riempire completamente lo stampo.
Per evitare cavità nelle impalcature, assicurarsi che le bolle d'aria vengano premute durante il riempimento dello stampo con particelle di cartilagine. Dopo la formazione, congelare lo stampo per 10 minuti a meno 20 gradi Celsius. Quindi liofilizzare le impalcature della cartilagine all'interno dello stampo per 24 ore in un essiccatore di congelamento.
Dopo la lofilizzazione, rimuovere con cura l'impalcatura dallo stampo. Posizionare l'impalcatura sotto una luce UV a lunghezza d'onda di 365 nanometri e collegarla durante la notte. Formare dischi di impalcature tagliando le impalcature sterilizzate in tre fette spesse millimetri.
Quindi trasferire le impalcature in pozzi separatiS di una piastra a sei pozza. Aggiungere un millilitro di Chondrocyte Expansion Medium sopra le impalcature e consentire loro di reidratarsi per 30 minuti. Mentre le impalcature reidratano, preparare le celle e la pipetta 50 microliter della sospensione cellulare preparata sopra l'impalcatura pre imbevuta.
Quindi incubare l'impalcatura per un'ora a 37 gradi Celsius. Quando si usano i condrociti, assicurarsi che non siano stati espansi oltre il primo passaggio al fine di ridurre al minimo il numero di cellule differenziate. Dopo un'ora, riportare la piastra sul cappuccio della coltura e capovolta con cura l'impalcatura.
Pipettare i restanti 50 microlitri di sospensione cellulare sull'impalcatura e incubare per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere tre millilitri di mezzo ai pozzi con impalcature. Evitare di pipeggiare il mezzo direttamente sulle impalcature e maneggiare delicatamente la piastra di coltura per evitare il distacco delle cellule.
Riportare la piastra all'incubatore e alla cella di coltura cedette impalcature a 37 gradi Celsius. Una combinazione di colorazione istorica e quantificazione del DNA sono stati utilizzati per dimostrare che i metodi presentati in questo articolo si traducono in una sufficiente decellularizzazione dell'impalcatura della cartilagine. Si è scoperto che le impalcature risultanti non contenevano cellule insieme a livelli non rilevabili di DNA.
Mancano anche di glicosaminoglicani e sono ricchi di collagene II.Qui, la formazione di neomatrici si osserva sull'impalcatura ceduta con cellule staminali mesenchimali che sono state coltivate per quattro settimane. La formazione di glicosaminoglicani è abbondante dopo quattro settimane. Dopo aver tentato questa procedura, è importante esaminare se la decellularizzazione ha avuto esito positivo, prima di utilizzarla in qualsiasi applicazione.
Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi biochimiche come l'analizzatore western blot al fine di rispondere a domande specifiche sulla presenza di altri componenti come i fattori di crescita. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare strategie per la rigenerazione della cartilagine utilizzando tessuti decellularizzati da fonti allogeneiche e sineriche. Devono sempre essere prese precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti.
