Per iniziare, scarica e installa l'ultima versione di Fiji su un computer. Dopo aver scaricato il convert_to_TIFF. py, trascinare e rilasciare lo script su Fiji ed eseguire il codice.
Passare al percorso in cui è archiviato l'esperimento. I file TIFF convertiti vengono creati all'interno della stessa cartella sperimentale. Fai clic su plugin, quindi su 3D Suite e apri le opzioni del gestore 3D.
Nella finestra Gestione 3D, selezionare le caselle di controllo corrispondenti al volume in unità, al valore medio di grigio, al riquadro di delimitazione in pixel, al valore di grigio della deviazione standard, al baricentro in pixel e al baricentro in unità. Spuntare il pulsante Escludi oggetti sui bordi XY ed escludi oggetti sui bordi Z.Quindi, fare clic su OK. Apri l'immagine fluorescente dei linfociti T umani.
Fare clic su Ctrl Maiusc D per duplicare il canale proteico, incluso lo stack. Seleziona la casella di controllo hyper stack. Specificare il numero di canale appropriato all'interno della casella dei canali e rinominarlo di conseguenza.
Per avviare il registratore di macro delle Fiji, vai ai plug-in, quindi alle macro e seleziona registra. Quindi, per aprire il plug-in FindFoci, fare clic in sequenza sui plug-in GDSC, FindFoci e FindFoci GUI. Dal menu a discesa dell'immagine, selezionare l'immagine da analizzare.
Impostare la sfocatura gaussiana su 1,5, il metodo di sfondo su deviazione standard sopra la media, il parametro di sfondo su nove, il metodo di ricerca su frazione di sfondo di picco, il parametro di ricerca su 0,7, il metodo di picco su relativo sopra lo sfondo, il parametro di picco su 0,2 e la dimensione minima su cinque. Imposta i picchi massimi su numeri alti per includere tutti i punti focali nell'immagine. Per migliorare l'identificazione dei fuochi, regolate la sfocatura gaussiana vicino al diametro dei fuochi e aumentate i valori del parametro di sfondo per imporre soglie più rigorose.
Quindi, diminuire i valori del parametro di ricerca per includere le aree più lontane dal picco di fluorescenza e diminuire i valori del parametro di picco per la separazione dei picchi. Eseguire FindFoci e copiare la stringa visualizzata nella finestra del registratore. La stringa contiene i parametri selezionati, escluse le virgolette.
Dopo aver scaricato lo script nuclear_prod_q. py, trascina e rilascia lo script su Fiji e fai clic su Esegui per eseguire il codice. Nel canale del nucleo, inserire il numero corrispondente al canale di DAPI.
Per la sfocatura gaussiana del nucleo, inserire il valore di sigma necessario per sfocare l'immagine per la segmentazione. Quindi, inserire il numero corrispondente al canale della colorazione di interesse per il canale proteico. Nel parametro FindFoci incollare la stringa che rappresenta la registrazione macro dei parametri selezionati.
Selezionare la casella di controllo visuale e fare clic su Sfoglia per selezionare la directory in cui sono memorizzate le immagini. Una volta compilate tutte le caselle, fare clic su OK per continuare l'esecuzione. Dall'elenco ROI nella finestra ROI manager 3D, selezionare il canale dei nuclei e fare clic su ROI in tempo reale per attivare.
Seleziona il ROI appartenente allo stesso nucleo e premi merge. E per i nuclei indesiderati, premere Elimina. Ancora una volta, fai clic su ROI in tempo reale per attivare, selezionare tutto e confermare che tutti i nuclei sono segmentati correttamente.
Dalla cartella di quantificazione, aprire il file TXT con i record dei parametri utilizzati per l'analisi. Apri Google Colab in un browser. Quindi, dal file, selezionare Apri taccuino e caricare le metriche finali delle proteine nucleari.
Script ipynb. Carica tutte le cartelle contenenti i file CSV di ciascun campo immagine in una cartella di preferenza in Google Drive. Nel taccuino, indicare il percorso della cartella in cui sono memorizzate le sottocartelle dei risultati ed eseguire tutte le celle.
Al termine della compilazione del codice, aprire il file del foglio di calcolo finale contenente tutti i dati compilati.
