Per iniziare, ottenere le cellule HEK293T che esprimono RapR-Shp2 ed eseguire l'immunoprecipitazione con la proteina G-Sefarosio. Dopo l'immunoprecipitazione, lavare il sefarosio due volte ciascuna con 0,5 millilitri di tampone di lisi, seguito da 0,5 millilitri di tampone di lavaggio. Rimuovere quanto più buffer possibile dopo la centrifuga finale.
Quindi aggiungere 40 microlitri di fosfo-paxillina nella miscela di tampone imidazolo a ciascun campione con o senza una rapamicina micromolare. Muovi delicatamente il tubo e mettilo immediatamente nell'agitatore per 40 minuti a 32 gradi Celsius. Impostare l'agitatore di riscaldamento a 1000 giri al minuto per garantire la piena agitazione del campione.
Per fermare la reazione, aggiungere 40 microlitri di tampone Laemmli 2X a ciascun campione e incubarli a una temperatura compresa tra 95 e 100 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo che i campioni si sono raffreddati, caricare 15 microlitri di ciascun campione su un gel di poliacrilammide SDS con gradiente dal 4 al 15%. Esegui un protocollo Western blot standard utilizzando membrane PVDF.
Infine, tamponare utilizzando l'anticorpo anti-FLAG per rilevare il costrutto RapR-Shp2 e l'anti-fosfo-paxillina per rilevare la paxillina fosforilata nei campioni. Il RapR-Shp2 attivo non ha mostrato fosfo-paxillina, simile al Shp2 costitutivamente attivo, indicando il mantenimento della piena attività. L'inattivo RapR-Shp2 e l'dominante negativo Shp2 hanno mostrato livelli simili di fosfo-paxillina, indicando l'assenza di attività quando inattivi.
