Questo lavoro è stato sostenuto dal Cancer Coalition Georgia grant-R9028.

Fondamento logico Sfruttando l&#39;uso di Thermo Scientific Dharmacon oligos, da 50 a 80-mers, qui vi presentiamo una procedura, basata su un test di correzione gene, con la quale oligo possibile trasferire le informazioni genetiche del DNA genomico di cellule di lievito, a seguito di ricottura al DNA bersaglio cromosomico. Successo targeting per oligo è segnato dalla comparsa di colonie di lievito visualizzare il fenotipo atteso. Se la modifica desiderata genetica avviene in una o più ribonucleotidi incorporato nella sequenza oligo, l&#39;informazione genetica fluisce direttamente dal tratto RNA al DNA cromosomico obiettivo, quindi, un RNA / DNA forme ibride, a livello dei cromosomi durante il processo di targeting. La ribonucleotide / s di un comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo può servire come modello per gene targeting mediante sintesi di riparazione del DNA o possono essere incorporati nel DNA e fungono da modello durante la replicazione del DNA. In questi esperimenti si usa il lievito / Saccharomyces cerevisiae / sistema modello eucariotico, tuttavia, un approccio simile può essere applicato anche in altri organismi o di tipi di cellule. In questo video, usiamo un Thermo Scientific Dharmacon oligo progettato con omologia di un locus genomico obiettivo lievito e contenente uno ribonucleotide nel mezzo per correggere una mutazione del gene bersaglio. Dopo la trasformazione con l&#39;RNA contiene oligo, osserviamo la correzione del sito mirato ad una certa frequenza, che indica che il tratto di RNA di oligo potrebbero essere inserite nel DNA cromosomico e servire da modello per la sintesi del DNA durante la replicazione del DNA. L&#39;informazione genetica effettuata all&#39;interno del tratto RNA è stabilmente trasmesso alle generazioni seguenti cellulari. Qui sono descritte le fasi di trasformazione di lieviti dal comitato scientifico Thermo Dharmacon RNA contenenti oligo e l&#39;approccio per rilevare il trasferimento di informazioni RNA in DNA cromosomico. A. Progettazione del RNA contenenti oligo utilizzati in questo esperimento Abbiamo progettato un RNA che contiene oligo per correggere un difetto genetico nel lievito S. Saccharomyces DNA cromosomico a livello del locus trp5. Il ceppo di lievito utilizzato nel protocollo contiene un gene mutante trp5 con due-base cancellazione e una mutazione nonsense (Figura 1A). Tale ceppo di lievito è un mutante auxotrophic triptofano e non formano colonie su supporti senza triptofano. La sequenza di DNA del gene TRP5 è disponibile presso il Genome Database cerevisiae (http://www.yeastgenome.org/). L&#39;RNA contenenti Thermo Scientific Dharmacon oligo utilizzati in questo protocollo è un 65-mer con un 2-base di inserimento del DNA, progettata per correggere la mutazione cancellazione e uno ribonucleotide progettato per correggere la mutazione nonsense dell&#39;allele trp5 (Figura 1A). La sequenza dei oligo è concepito come segue: 5&#39;-AAAAGGGTTTTGATGAAGCTGTCG-CG-GATCCCACATTCTG-RG-GAAGACTTCAAATCCTTGTATTCT. Questo oligo è sintetizzato da Thermo Scientific Dharmacon (Lafayette, CO) a 200 nM scala, ed è dissalati, deprotetto e utilizzati senza purificazione PAGINA. B. Preparazione del RNA contenenti Oligo per la trasformazione del lievito (modificato da Storici et al., 2007 1) <ol><li> Pulire i materiali che verranno utilizzati per l&#39;esperimento compresi i tubi oligo, pipette, vortice, rack, area sperimentale e guanti indossati dallo sperimentatore con la soluzione di decontaminazione da RNasi per rimuovere il potenziale contaminazione RNasi prima inizia tutto. Utilizzare acqua priva di RNasi, reagenti chimici, tubi e puntali in tutte le fasi. Ogni passo in questo esperimento dovrebbe essere RNasi-free. </li><li> Risospendere il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligo ricevuto da parte della società a 250 pmoli / soluzione madre microlitri con RNase-free vortice d&#39;acqua e vigorosamente per dissolvere il pellet. Conservare a -80 ° C. </li><li> Immediatamente prima della trasformazione, il disgelo RNA contenenti oligo su ghiaccio e diluire a 50 pmoli / mL con acqua RNase-free in RNasi-free tubi. Ogni trasformazione richiede 1 nmole del RNA contenenti oligonucleotidi. </li><li> Denaturare una quantità scelta del RNA contenenti oligonucleotidi sul 100 ° blocco di calore C per 2 minuti per eliminare le strutture secondarie di oligo. </li><li> Immediatamente dopo denaturazione posto il tubo sul ghiaccio. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione. </li><li> Come controllo nell&#39;esperimento un DNA sola corrispondente oligo viene utilizzato. Questo oligo è scongelato da -20 ° C e preparate per la trasformazione come l&#39;RNA contenenti oligo, come descritto sopra. </li></ol> C. Trasformazione di cellule di lievito con l&#39;RNA contenenti Oligo <ol><li> Inoculare 5 ml di liquido ricco YPD con il trp5 cellule di lievito mutanti e crescere a 30 ° C durante la notte (vedi Materiali). </li><li> Trasferire 1,5 ml della cultura durante la notte in 50 ml di YPD mezzo liquido. </li><li> Incubare cellule di 30 ° C shaker (225 rpm) per 4 ore. </li><li> Preparare Soluzione 1Soluzione 2 e immediatamente prima della trasformazione in RNasi-free tubi (vedi Materiali). </li><li> Trasferire la coltura cellulare ad una da 50 ml RNasi-free tubo e far girare a 3000 giri, corrispondenti a 1562 g, per 2 minuti. Il pellet della precipitazione cellula è di ca. 0,3 centimetri 3. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e lavare con 50 ml di acqua RNase-free e far girare a 3000 rpm per 2 minuti. </li><li> Ripetere il passaggio 6 per 5 volte per sbarazzarsi del terreno di coltura e RNasi che potrebbero essere presenti nel terreno il più possibile. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 5 ml di soluzione 1 e far girare a 3000 rpm per 2 minuti. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 250 microlitri di Soluzione 1. Questa quantità di cellule sufficiente per 7-8 trasformazioni. </li><li> Aliquota 50 ml di sospensione di cellule in RNasi-free microprovette, aggiungere 20 ml di RNA contenenti soluzione di oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di DNA unica soluzione oligo di lavoro (1 nmole), o 20 ml di acqua sterile senza oligo per il controllo negativo. Poi aggiungere 300 ml di soluzione di 2 per ogni reazione di trasformazione. Non c&#39;è bisogno di aggiungere DNA spermatico salmone nel processo di trasformazione, come l&#39;atto oligo come vettore se stessi. </li><li> Energicamente per miscelare i componenti in maniera omogenea. </li><li> Incubare reazioni di trasformazione a 30 ° C per 30 minuti in uno shaker. </li><li> Shock termico a 42 ° C per 15 minuti. </li><li> Spin down celle a 5000 giri, corrispondenti a 2236 g, per 4 min. </li><li> Rimuovere le cellule surnatante e risospendere in 100 ml di acqua sterile. </li><li> Prelevare un &#39;aliquota di questa sospensione cellulare e diluirlo con acqua sterile per 100.000 volte e cellule piastra su un piatto YPD con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 2 giorni. </li><li> Piastra di tutte le cellule risospese da ogni reazione trasformazione su una piastra di Petri di terreno completo sintetico solido senza triptofano (SC-Trp) con ca. 15 perle di vetro sterile e incubare a 30 ° C per 4-5 giorni (Figura 2). </li></ol> D. Analisi della correzione genica del RNA contenenti Oligo <ol><li> Contare il numero di colonie cresciute sul terreno selettivo (Figura 2) e sul medio YPD per calcolare la frequenza di correzione del gene per la RNA contenenti oligo, il DNA solo oligo e per il no-oligo di controllo. Confrontare il numero ottenuto. Tasso di regressione spontanea del trp5 alleli con i due-base cancellazione e la mutazione nonsense è inferiore a 09/10 nel ceppo di lievito utilizzato, quindi ci aspettiamo nessuna formazione di colonie sul terreno selettivo in assenza di oligonucleotidi vengono aggiunti alle cellule. </li><li> Streak eseguire diversi scelto a caso trasformante colonie su terreno YPD ricevere gli isolati singola colonia. Aspettare due giorni per la crescita colonia, poi prendere diverse (almeno 5) singole colonie e fare patch su YPD e sul terreno selettivo. </li><li> Progettare un paio di primer per amplificare la regione (250-1,000 bp) destinatari del RNA contenenti oligo da colonia PCR (Figura 1B). La procedura per la colonia PCR è la seguente (modificato da Storici e Resnick, 2006 2). <ol><li> Risospendere le cellule (circa 1 mm3) tratto dalla singole patch in 50 ml di acqua e aggiungere 1 unità di liticasi. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti, seguita da incubazione in un blocco di calore a 100 ° C per 5 minuti per rompere le cellule e il DNA genomico rilascio in soluzione. </li><li> Condizioni di PCR: La reazione di PCR comprende 10 microlitri della soluzione del risospensione delle cellule, 50 pmoli ciascuno dei primers forward e reverse, 1 ml di 10 mM dNTPs, 1 unità di Taq polimerasi, 5 ml di tampone 10x e viene regolata con acqua sterile ad una volume finale di 50 microlitri. Il programma di PCR è di 3 minuti a 95 ° C, 30 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 1 min a 72 ° C, un tempo l&#39;estensione finale di 7 minuti a 72 ° C, poi i campioni sono tenute a 4 ° C. Un tempo l&#39;estensione di 1 min / kb si assume per questa reazione. </li><li> A seguito di PCR, campioni vengono analizzati su un gel 1% o 2% (a seconda della dimensione prevista del prodotto PCR) agarosio per l&#39;osservazione del prodotto della PCR (Figura 3). </li></ol></li><li> Se l&#39;informazione genetica trasferito dal RNA contenenti oligo genera un nuovo sito di restrizione della regione bersaglio lievito genomica (Figura 1B), è possibile verificare il corretto trasferimento di informazioni da digerire il prodotto di PCR con l&#39;enzima di restrizione appropriato. Se nessun sito di restrizione è generato dal RNA contenenti oligo, passare al punto 6. Digest prodotti PCR utilizzando uno specifico enzima di restrizione. La reazione di digestione comprende 6 ml di prodotto PCR, tampone, BSA (potrebbe non essere necessario per alcuni enzimi, vedere le istruzioni per l&#39;enzima utilizzato), 0,5 l di enzima di restrizione, e l&#39;acqua sterile a 15 microlitri. I campioni sono incubati per 1 ora a temperatura specifica per l&#39;enzima utilizzato. </li><li> Eseguire un campione non digerito assieme ai campioni digeriti sulla stessa riga di un gel di agarosio al 2% perosservare la modificazione genetica trasferiti dal tratto RNA del RNA contenenti oligo (Figura 3). </li><li> Purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR e prepararli per il sequenziamento del DNA. Sottoporre i campioni per il sequenziamento con il primer stesso utilizzato per amplificare il prodotto. </li><li> Analizzare i risultati sequenziamento del DNA utilizzando un software che permette l&#39;allineamento di sequenze multiple con una sequenza di riferimento scelto (Figura 4). </li></ol> E. Trattamento alcalini del RNA contenenti oligo (Figura 5) <ol><li> Per ogni reazione, aggiungere 1 nmole (4 l di 250 pmoli / soluzione madre microlitri) di RNA contenenti oligo, o DNA-oligo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 4 ml di 1 M NaOH per idrolisi, o in alternativa aggiungere 4 microlitri H 2 O come controllo negativo, e incubare a 65 ° C a bagnomaria per 1 ora Poi passare dal bagno d&#39;acqua in ghiaccio. </li><li> Neutralizzare con 2 ml di HCl 1,2 M, 4 ml di 1 ml M Tris-HCl, e 4 di H 2 O, o, in alternativa 6 ml di H 2 O e 4 ml di 1 M Tris-HCl per il controllo negativo. Tenere sul ghiaccio fino trasformazione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica del gene difettoso trp5 e dell&#39;allele TRP5 corretto dalla RNA contenenti oligo. A) Il trp5 gene mutante contiene un 2-base di cancellazione (triangoli neri) e 1-base di mutazioni nonsense (asterisco). Il singolo filamento di RNA contenenti oligo con 2-base di inserimento (anello blu) e 1-RNA sostituzione di base (rettangolo rosso), generando un Van91 ho sito enzima di restrizione (indicato da staffa) si trasforma in cellule di lievito per correggere i difetti genetici del gene trp5. B) Dopo il TRP5 gene è riparato dal RNA contenenti oligo (basi corrette sono indicate come rettangoli blu), il sito Van91 mi viene generato nel gene TRP5. Un frammento di 278 bp tra cui un solo sito di restrizione Van91 io in TRP5 PCR gene è amplificato da una coppia di primer (P1 e P2). Il 177 bp e 101 bp frammenti generati dopo la digestione del P1 e P2 prodotto di PCR da Van91 io sono mostrati. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risultato della trasformazione con l&#39;RNA contiene oligo. A) Le cellule di lievito trasformate senza oligo non fanno colonia sul SC-Trp media, vedi le tavole ab. B) Piastre cg colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del RNA contenenti oligo. C) Piastre hl colonie di lievito dimostrano crescente SC-Trp dopo che le cellule si trasformano con 1 nmole del corrispondente DNA solo oligo di controllo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Rilevazione di trasferimento delle informazioni genetiche dal RNA al DNA che contiene oligo lievito cromosomiche tramite digestione restrizione del prodotto della PCR amplificando la regione di destinazione genomica. Elettroforesi su gel 2% agarosio di campioni PCR amplificati da P1 e P2 e digerito con Van91 io enzima di restrizione. Corsie 1, 8 e 15, scala del DNA con dimensioni di 100, 200, 300, 400 e 500 bp indicata sulla sinistra, corsia 2, prodotto di PCR del locus trp5 amplificato dal DNA genomico del ceppo mutante trp5, corsia 3, PCR prodotto amplificato dal DNA genomico derivato da una colonia Trp + destinatari del DNA solo oligo; corsia 4-7, prodotti della PCR amplificati dal DNA genomico derivato da Trp + colonie destinatari del RNA contenenti oligo; corsia 9 a 14, Van91 ho la digestione di restrizione dei prodotti di PCR di corsie 2 a 7. La presenza del prodotto di PCR non tagliato bande nelle corsie 10-14 può essere spiegata dalla digestione parziale Van91 I al locus TRP5 (CCACATTCTGG). Considerando che il sito di taglio per Van91 I (CCANNNN NTGG) può avere più sequenze, il sito ha generato in TRP5 non può essere l&#39;obiettivo ottimale per l&#39;enzima. Infatti, dopo il sequenziamento del DNA di tutti i prodotti sopra PCR si rileva alcun cambiamento supplementari rispetto a quelle svolte dal oligos (vedi figura 4). I 278 bp banda PCR amplificato da primer P1 e P2 e le bande digestione prodotto Van91 io di 177 bp e 101 bp sono indicati dalle frecce sulla destra. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2152/2152fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig4tmb.jpg" border="0" alt="Figura 4Thumb" /></a> Figura 4. Sequenziamento del DNA, i risultati mostrano correzione genica mediante RNA contenenti oligo. A) elettroferogramma DNA della regione genomica bersaglio l&#39;RNA contenenti oligo. Il G nella sequenza del DNA (scatola blu) deriva dal rG sul RNA contenenti oligo. Anche in scatola è l&#39;inserimento delle basi CG. Risultati di sequenziamento da tutti gli altri prodotti di PCR sono anche CLEar come questo, con segnali fluorescenti ben al di sopra lo sfondo. B) Le sequenze della regione TRP5 del + trasformanti Trp destinatari del DNA solo oligo (T1) e l&#39;RNA contenenti oligo (T2-T5) corrispondenza nella sequenza consenso sulla parte superiore e sono confrontati con quello della trp5 cellule mutanti prima di targeting dal oligos (DNA genomico, colorata in rosso). La riparazione RNA contenenti oligo sul fondo ha due-base di inserimento del DNA e una base (G) sostituzione di RNA marcato in rosso. Le regioni in scatola blu con tonalità gialle mostrano che l&#39;RNA contenenti oligo così come il DNA sola oligo proprio corretto la mutazione cancellazione e la mutazione nonsense in tutti i campioni testati. Le linee tratteggiate segnano la posizione del RNA contenenti sequenze oligo. <img src="/files/ftp_upload/2152/2152fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Trattamento alcalino impedisce di correzione genica mediante RNA contenenti oligo. La frequenza di trasformazione dal RNA contenenti oligo (R) viene mostrato nella barra rossa e che dal DNA oligo-only (D) viene mostrato nella barra blu. Le barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media per 3 trasformazioni indipendenti per ogni oligo. Il DNA di solo oligo visualizza frequenza simile trasformazione senza e con trattamento di NaOH. Diversamente, la frequenza trasformazione dal RNA contenenti oligo scende a 0 dopo il trattamento con NaOH. Pertanto, la preparazione con l&#39;RNA contiene oligo non è contaminato con DNA oligo-solo, quindi, la frequenza di trasformazione osservata è specifico per l&#39;RNA contiene oligo.

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	<li>Storici, F., Bebenek, K., Kunkel, T. A., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-templated+DNA+repair.">RNA-templated DNA repair.</a> Nature. 447, 338-3341 (2007).</li><li>Storici, F., Resnick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+delitto+perfetto+approach+to+in+vivo+site-directed+mutagenesis+and+chromosome+rearrangements+with+synthetic+oligonucleotides+in+yeast.">The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast.</a> Methods Enzymol. 409, 329-345 (2006).</li><li>Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+DNA+modifications+and+RNA-templated+DNA+repair.">RNA-mediated DNA modifications and RNA-templated DNA repair.</a> Curr Opin Mol Ther. 10, 224-230 (2008).</li><li>Cerritelli, S. M., Crouch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonuclease+H:+the+enzymes+in+eukaryotes.">Ribonuclease H: the enzymes in eukaryotes.</a> FEBS J. 276, 1494-1505 (2009).</li></ol>

La produzione video per questo articolo è stato sponsorizzato da Thermo Fisher Scientific, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questa pubblicazione.

Il fatto che l&#39;RNA in grado di trasferire informazioni genetiche direttamente al DNA genomico è stato scoperto nelle cellule sfruttando l&#39;uso di RNA sintetici contenenti oligonucleotidi (oligo Dharmacon sintetizzato) 1. E &#39;stata la prova di principio che le cellule possono utilizzare contenenti molecole di RNA o RNA solo sequenze come modelli per la sintesi del DNA. L&#39;uso di RNA contenenti oligonucleotidi non solo ha portato alla dimostrazione che le informazioni genetiche possono essere trasferiti direttamente da RNA a DNA genomico, senza la necessità di una trascrizione inversa di copie di DNA intermedio, ma anche per la prova che l&#39;RNA può essere utilizzato come modello nella omologhi la riparazione di un danno al DNA 1,3. L&#39;oligo può essere fatto di RNA-only o contengono solo un singolo ribonucleotide incorporato in una sequenza di DNA, come nell&#39;esempio che abbiamo presentato qui. L&#39;RNA contenenti oligo ha un ribonucleotide incorporato progettato per correggere la mutazione nonsense nella genomica trp5 allele difettoso. Il trasferimento di informazioni genetiche dal ribonucleotide al DNA genomico è rivelato da un cambiamento nel fenotipo (cellule che crescono sulle medie manca triptofano) delle cellule bersaglio. La frequenza del gene correzione ottenuta con l&#39;RNA contenenti oligo è misurata e confrontata con quella di un DNA controllo con solo oligo. Con il dosaggio di correzione genica in contesti differenti delle cellule, dove si mutano i geni del lievito diversi, siamo in grado di rilevare quale fattore / s influenzano specificatamente mira dalla RNA contenenti oligonucleotidi. Quindi, possiamo svelare i meccanismi come le cellule regolano la stabilità del DNA / RNA ibridi. Con la semplice progettazione di diverse varianti del RNA contenenti oligonucleotidi possiamo determinare la probabilità per un tratto particolare di RNA a servire come modello di modificazione del DNA e siamo in grado di determinare la stabilità di specifiche sequenze di RNA in DNA incorporato. Inoltre, siamo in grado di identificare quali sono i preferiti in substrati in vivo per i fattori che interagiscono con l&#39;RNA / ibridi DNA. Mentre diversi studi in vitro, utilizzando principalmente breve RNA contenenti oligonucleotidi, sono stati condotti per caratterizzare la funzione di fattori in grado di riconoscere l&#39;RNA in un ibrido con il DNA, come ad esempio gli enzimi RNasi H 4, le funzioni in vivo di RNasi H e come l&#39;identità di altre proteine ​​che potrebbero influenzare DNA / RNA ibrido stabilità rimangono per lo più sconosciuti. La possibilità di utilizzare l&#39;RNA contenenti oligonucleotidi di lunghezza significativa (50 a 80-mers) e di ottima qualità (come il Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi) ha aperto la strada ad esaminare una vasta gamma di processi molecolari direttamente in vivo nel cellule di interesse. Come mostrato in questa trasformazione video, utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi richiede essenzialmente a pochi passi ulteriori rispetto alla trasformazione utilizzando molecole di DNA, per impedirne la degradazione per RNasi. Così, la trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi non si limita al sistema di lievito, ma può essere applicato a qualsiasi organismo o tipo cellulare in cui la trasformazione dal DNA oligo è competente. In conclusione, il targeting di cellule RNA contenenti oligonucleotidi offre la possibilità di generare ibridi RNA / DNA e ribonucleotidi incorporati nel DNA in vivo nelle cellule. La stabilità, la funzione e le conseguenze di queste generati in vivo di RNA / ibridi DNA può essere analizzato e caratterizzato, potenzialmente alla scoperta dei meccanismi di riparazione del DNA sconosciuto e rivelare nuove strategie per il gene targeting.

A. La trasformazione dei reagenti e dei media (modificato da Storici e Resnick, 2006 <ol><li> YPD (Lievito peptone destrosio): Per 1 L, 10 g di estratto di lievito, 20 g di soia peptone, 20 g di destrosio. Aggiungere 15 g di agar per fare YPD terreni solidi. Autoclave prima dell&#39;uso. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Soluzione 1: 0,1 M di acetato di litio. Preparare immediatamente prima della trasformazione. Soluzione 1 è una soluzione di lavoro, così è preparata direttamente dalla polvere. Nessuna soluzione stock è fatto. Mantenere a temperatura ambiente. LIAC aumenta la permeabilità delle cellule di lievito muro al DNA. </li><li> Soluzione 2: 0,1 M di acetato di litio e il 50% del polietilene glicole 4000. Anche la soluzione 2 è una soluzione di lavoro ed è fatta direttamente dalla polvere. Nessuna soluzione stock è preparata. Mantenere a temperatura ambiente. PEG depositi oligo su cellule di lievito. </li><li> RNA contenenti oligonucleotidi (Thermo Scientific Dharmacon), 50-80-mers, dissalato, deprotetto e non depurati. Risospendere a 250 pmoli / mL. Conservare a -80 ° C. </li><li> DNA solo oligo, 50-80-mers, dissalato e non depurati. Risospendere a 50 pmoli / mL. Conservare a -20 ° C. </li><li> SC-Trp (Synthetic multimediale completa mancanza di triptofano) terreni solidi. </li><li> 0,5 centimetri di diametro perle di vetro, sterilizzati in autoclave. </li><li> RNAsi-off: la soluzione di decontaminazione RNAsi. </li><li> DNase / RNase-free, provette sterili. </li><li> DNase / RNase-free, provette sterili conica. </li><li> DNase / RNase-free, sterile puntali aerosol con ZAP: 100-200 ml, 1-100 ml. </li></ol> B. colonia PCR materiali. <ol><li> Primer del DNA, dissalato e non depurati. Sciogliere in acqua sterile a 50 pmoli / mL. Conservare a -20 ° C. </li><li> Taq DNA polimerasi, buffer, dNTP. </li><li> Provette per PCR. </li></ol> C. PCR purificazione. <ol><li> PCR kit di purificazione. </li></ol> D. gel elettroforesi. <ol><li> Agarosio. </li><li> 1 x tampone TBE corsa (45 mM mM Tris-borato e 1 tetraacetate etilendiammina) diluito da TBE 10x. </li><li> Prestained marcatore di peso molecolare. </li><li> DNA loading dye. </li></ol> E. Limitazione digestione. <ol><li> Enzimi di restrizione, buffer 10x, BSA. </li></ol> F. Trattamento alcali per l&#39;RNA contiene oligo. <ol><li> 1 M di NaOH. </li><li> 1,2 M di soluzione di HCl. </li><li> 1 M di Tris-HCl, pH 7,4 soluzione. </li></ol>

generation of rna/dna hybrids in genomic dna by transformation using rna-containing oligonucleotides

Polimeri sintetici breve acido nucleico, oligonucleotidi (oligo), sono gli strumenti più funzionali e diffusa della biologia molecolare. Oligo possono essere prodotti a contenere DNA o RNA desiderato sequenza e possono essere preparati per includere una vasta gamma di base e modifiche zucchero. Inoltre, oligo possono essere progettati per simulare specifiche alterazioni degli acidi nucleici e, quindi, possono servire come strumenti importanti per studiare gli effetti dei danni al DNA e meccanismi di riparazione. Abbiamo scoperto che Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi con una lunghezza compresa tra 50 e 80 nucleotidi può essere particolarmente adatto per studiare, in vivo, le funzioni e le conseguenze di RNA cromosomiche / ibridi DNA e di ribonucleotidi incorporati nel DNA. RNA / DNA ibridi può facilmente formare durante la replicazione del DNA, la riparazione e la trascrizione, tuttavia, molto poco si sa circa la stabilità del DNA / RNA ibridi nelle cellule e in che misura questi ibridi possono compromettere l&#39;integrità genetica delle cellule. Oligo-RNA contenenti, quindi, rappresentare un vettore ideale per introdurre ribonucleotidi nel DNA cromosomico e generare ibridi RNA / DNA di lunghezza scelta e la composizione di base. Qui vi presentiamo il protocollo per l&#39;incorporazione di ribonucleotidi nel genoma del lievito eucariote sistema modello / Saccharomyces cerevisiae /. Eppure, il nostro laboratorio ha utilizzato Thermo Scientific Dharmacon RNA contenenti oligonucleotidi per generare RNA / DNA ibridi a livello cromosomico in sistemi cellulari diversi, dai batteri alle cellule umane.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Questo lavoro mostra come a formare un DNA / RNA ibrido a livello cromosomico e rivelare il trasferimento di informazioni genetiche da RNA a DNA genomico in cellule di lievito.

Generazione di DNA / RNA ibrido nel DNA genomico da trasformazione utilizzando RNA contenenti oligonucleotidi

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

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26.7K Views.  Georgia Institute of Technology. Questo lavoro mostra come a formare un DNA / RNA ibrido a livello cromosomico e rivelare il trasferimento di informazioni genetiche da RNA a DNA genomico in cellule di lievito.

Video: Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

Isolamento del DNA genomico da Tails mouse

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Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign plasmid or ligation product into bacteria. This video protocol describes the traditional method of transformation using commercially available chemically competent bacteria from Genlantis. After a short incubation in ice, a mixture of chemically competent bacteria and DNA is placed at 42&deg;C for 45 seconds (heat shock) and then placed back in ice. SOC media is added and the transformed cells are incubated at 37&deg;C for 30 min with agitation. To be assured of isolating colonies irrespective of transformation efficiency, two quantities of transformed bacteria are plated. This traditional protocol can be used successfully to transform most commercially available competent bacteria. The turbocells from Genlantis can also be used in a novel 3-minute transformation protocol, described in the instruction manual.

Trasformazione del DNA plasmidi in E. coli con il metodo Heat Shock

Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genomica risonanza magnetica - una risorsa pubblica per lo Studio Patterns sequenza all&#39;interno del DNA genomico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Cattura selettiva di 5 hydroxymethylcytosine dal DNA genomico

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generazione di Genomic eliminazioni in linee cellulari di mammiferi via CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...