Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni alla disfunzione erettile dal S. James McDonnell Foundation Award Program 21 ° secolo, e Innovator Award nuovo un direttore NIH. GAB è stato sostenuto in parte da una borsa di studio post-dottorato presso l&#39;Istituto di Medicina Rigenerativa della California.

1. Analisi della qualità controllo del campione di RNA con 2100 Bioanalyzer Prima di iniziare, <ol><li> Denaturare la scala ed i campioni a 70 ° C per 10 min. Freddo immediatamente in ghiaccio. </li><li> Pulire gli elettrodi strumento con RNaseZAP per 1 minuto, seguita da RNase-free acqua per 10 sec. Lasciare gli elettrodi asciugare all&#39;aria. </li><li> Preparare la matrice del gel da pipeting 550 microlitri della matrice del gel in un filtro rotativo fornito con il kit. Centrifugare a 1.500 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente. Aliquota del filtrato gel in 65 microlitri aliquote e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Per preparare la stazione di chip di priming, <ol class="lalpha"><li> Inserire una siringa da 1 ml con la clip e all&#39;adattatore luer lock. </li><li> Regolare la piastra di base alla posizione C svitando la vite sotto la base, sollevando il piatto e riavvitare la vite. </li><li> Regolare la clip siringa per la prima posizione. </li></ol></li><li> Equilibrare il concentrato tintura a temperatura ambiente. Vortex per 10 sec. Aggiungere 1 ml di tintura di un&#39;aliquota di 65 ml di gel filtrato. Vortex bene e centrifugare a 13.000 RCF per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare entro un giorno. Quando si è pronti per eseguire i vostri campioni, </li><li> Posizione di un chip sulla stazione di adescamento. In questo protocollo che stiamo usando RNA 6000 chip nano. Per caricare il gel, <ol class="lalpha"><li> Pipettare 9 ml di gel colorante-mix nel pozzo contrassegnati con un bianco &quot;G&quot; su uno sfondo nero. Assicurati che il tuo suggerimento è posizionato al fondo del pozzo. </li><li> Posizionare lo stantuffo della siringa a 1 ml. Chiudere la stazione di adescamento. Assicurarsi che click-serrature. </li><li> Premere il pistone verso il basso lentamente ma costantemente fino a quando non è in possesso della clip. </li><li> Attendere 30 sec. Rilasciare il fermaglio. </li><li> Lasciate che il pistone salire da solo. Dopo che smette di muoversi, attendere qualche secondo e tirare lo stantuffo per la posizione 1 ml. Aprire la stazione di adescamento. </li></ol></li><li> Pipettare 9 ml di gel colorante-mix in ciascuna delle 2 pozzi marcata &quot;G&quot;. </li><li> Pipettare 5 ml di marker in ciascuno dei 12 pozzetti del campione e nella scala bene. </li><li> Pipettare 1 ml di scala in scaletta preparata bene. </li><li> Pipettare 1 ml di ciascun campione nei pozzetti del campione. </li><li> Pipettare 1 ml di marker in ogni campione non utilizzate bene. </li><li> Vortex il chip per 1 min a 2.400 giri al minuto. </li><li> Per eseguire il chip, <ol class="lalpha"><li> Avviare il software di Expert 2100. </li><li> La posizione del chip e chiudere il coperchio. Se lo strumento è on-line, verrà mostrata un&#39;icona se il coperchio è aperto o chiuso e che tipo di chip è inserito. Assicurarsi che la porta sia selezionata. </li><li> Eseguire il test entro 5 minuti di caricare i campioni per evitare l&#39;evaporazione. </li></ol></li></ol> 2. Amplificazione ed etichettatura Per preparare per l&#39;analisi microarray, campioni di RNA sono amplificati ed etichettato, di solito in una reazione basata su RNA polimerasi di T7 3. Doppia elica del DNA è generata da trascrizione inversa. cDNA viene utilizzato in un reazione di trascrizione in vitro per generare ciò che è noto come cRNA. Questa reazione avviene in presenza di ribonucleotidi etichettati, producendo quantità microgrammi di RNA marcato per l&#39;ibridazione di array. La scelta di amplificazione / etichettatura metodi dipende dalla piattaforma microarray successive per essere utilizzato. In questa sezione, si descrive la generazione di fluorescente utilizzando RNA di Agilent rapida kit etichettatura Amp. <ol><li> Pipettare 50 ng a 5 mg di RNA in una provetta da 1,5 ml. Il volume non deve superare i 8,3 microlitri. Se necessario, concentrare il campione di RNA mediante centrifugazione sotto vuoto o di precipitazione con alcool. </li><li> Aggiungere 1,2 l di fondo T7. </li><li> Portare ad un volume finale di 11,5 microlitri con RNase-free acqua. </li><li> Incubare a 65 ° C per 10 minuti per denaturare l&#39;RNA. È consigliabile utilizzare un termociclatore con un coperchio caldo per evitare la condensa nella parte superiore del tubo. </li><li> Durante l&#39;incubazione 10 min, Buffer caldo Strand 5X prima a 80 ° C per 5 min. Vortex e spin giù. Tenere a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 10 minuti, raffreddare rapidamente i campioni di RNA denaturato sul ghiaccio. </li><li> Preparare l&#39;impasto cDNA master. Per reazione, aggiungere il seguente: <ol class="lalpha"><li> 4 microlitri tampone 5X First Strand </li><li> 2 microlitri 0,1 M DTT </li><li> 1 ml 10 mM dNTP </li><li> 1 ml MMLV-RT enzima </li><li> Fuori 0,5 microlitri RNAsi. </li></ol></li><li> Miscelare i componenti mediante inversione della provetta 4 volte. Non vortice. Spin down per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 8,5 ml di master mix per ogni campione. Mescolare pipeting su e giù. </li><li> Incubare per 2 ore a 40 ° C, seguita da 10 minuti a 65 ° C. È consigliabile utilizzare un termociclatore con un coperchio riscaldato. </li><li> Trasferire i tubi in ghiaccio per 5 min. </li><li> Preparare la master mix trascrizione. Per reazione, aggiungere il seguente: <ol class="lalpha"><li> 15,3 microlitri acqua priva di nucleasi </li><li> 20 lTrascrizione buffer di 4X </li><li> 6 microlitri 0,1 M DTT </li><li> 8 NTP microlitri </li><li> 6,4 microlitri PEG 50% (PEG dovrebbe essere preriscaldata a 40 ° C e in agitazione per garantire la risospensione) </li><li> 0,5 microlitri RNasi Out </li><li> 0,6 microlitri pirofosfatasi inorganici </li><li> 0,8 microlitri T7 RNA polimerasi </li><li> 2,4 microlitri Cy3 o Cy5 CTP </li></ol></li><li> In breve giro i campioni per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. </li><li> Aggiungere 60 ml di Master Mix Trascrizione per campione. </li><li> Incubare a 40 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 20 ml di acqua RNase-free. </li><li> Purificare l&#39;cRNA etichettati in modo da rimuovere nucleotidi prive di personalità giuridica. Si consiglia di utilizzare le colonne Qiagen RNeasy mini. </li><li> Quantificare il cRNA etichettati. È consigliabile utilizzare una NanoDrop2000 spettrofotometro in modalità di misurazione Microarray. Accertarsi di selezionare l&#39;RNA-40 come il tipo di campione. </li><li> Record concentrazione del campione, il rendimento (calcolato come la concentrazione moltiplicato per il volume) e l&#39;attività specifica (calcolato a 1000 moltiplicato per la razione di concentrazione di colorante sulla concentrazione cRNA). Per l&#39;ibridazione microarray, è necessario per ottenere una resa di almeno 825 ng e un&#39;attività specifica di almeno 8 pmol / mg. </li></ol> 3. Microarray di ibridazione <ol><li> Accendere la stazione di ibridazione e impostare a 65 ° C almeno 2 ore prima di ibridazione comincia. </li><li> Per preparare il campione di ibridazione, mescolare le seguenti in un tubo da 1,5 ml: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3-cRNA (questo di solito è il tuo campione &quot;trattati&quot;) </li><li> 825 ng Cy5-cRNA (questo di solito è il tuo campione &quot;di riferimento&quot;) </li><li> 11 microlitri agente 10X blocco. </li><li> Aggiungi RNasi-free acqua ad un volume finale di 52,8 microlitri </li><li> Aggiungere 2,2 microlitri di buffer frammentazione. </li></ol></li><li> Vortex a bassa velocità per mescolare. </li><li> Incubare a 60 ° C per esattamente 30 minuti. Questo è il passo frammentazione cRNA, che genera frammenti etichettati per l&#39;ibridazione di array. E &#39;molto importante per incubare esattamente come descritto. Si consiglia l&#39;uso di un termociclatore con un coperchio riscaldato. E &#39;molto importante per incubare esattamente come descritto per generare sonde della lunghezza media corretta. Frammentazione eccessiva o insufficiente si tradurrà in falsi negativi e falsi positivi. </li><li> Aggiungere 55 ml di buffer di ibridazione 2X per fermare la frammentazione. Mescolare pipettando, prestando particolare attenzione a non introdurre bolle. </li><li> Centrifugare per 1 minuto alla massima velocità per raccogliere il contenuto sul fondo della provetta. Se le bolle sono osservati, centrifuga più tempo per rimuoverli. </li><li> Posizionare la provetta in ghiaccio, al riparo dalla luce. Caricare il campione sulla matrice il più presto possibile. </li><li> Per caricare l&#39;array, prima preparare la camera di ibridazione. Questo protocollo descrive l&#39;uso di array Agilent 4x44K con la Roche-NimbleGen sistema di ibridazione e camere mixer A4. <ol class="lalpha"><li> Posizionare un vetrino microarray nel fianco codice a barre di montaggio / smontaggio strumento, in primo luogo. </li><li> Aprire un mixer A4 ed esporre l&#39;adesivo. Tenendo l&#39;array e il montaggio / smontaggio strumento per evitare qualsiasi movimento, posizionare il mixer A4 sulla diapositiva, a partire in fondo. Assicurarsi che sia correttamente allineato allo strumento. Bastone del miscelatore tutta la diapositiva array. </li><li> Tirare a partire dalla fine del mixer per rimuovere il vetrino / gruppo miscelatore. </li><li> Utilizzando lo strumento ragli, premere lungo tutta la guarnizione adesiva per assicurarsi che sia saldamente incollato alla theslide. Piccole bolle d&#39;aria intrappolate tra l&#39;adesivo e la diapositiva può essere visto su uno sfondo scuro. Prendere tempo per rimuovere queste bolle con lo strumento ragliare. L&#39;array è ora pronto per essere caricato. </li></ol></li><li> Utilizzare una pipetta positivo spostamento di carico 100 l di campione ibridazione. Spingere la punta saldamente all&#39;interno del foro porta, poi dispensare lentamente e dolcemente in modo che l&#39;aria non è intrappolata nella zona di array. Non tentare mai di succhiare il campione backup. Una volta che l&#39;intero campione è stato erogato, mantenere la punta sul buco porta senza rilasciare lo stantuffo. Quando il campione copre l&#39;intera matrice e liquido comincia a venire fuori alla porta di sfiato, rimuovere velocemente la pipetta. Rilasciare solo il pistone una volta che la punta è lontano dalla diapositiva. </li><li> Tamponare delicatamente il liquido in eccesso a entrambe le porte. Assicurati di non trarre esempio dalla camera stessa. </li><li> Coprire i fori porta con adesivi utilizzando una pinzetta. </li><li> Mettere il vetrino della stazione ibridazione, e controllare che i fori della vescica sono correttamente posizionato sopra l&#39;O-ring. Questo assicurerà corretta miscelazione durante ibridazione. </li><li> Chiudere il coperchio e far scorrere il coperchio della stazione. Impostare la stazione di miscelazione modalità B. </li><li> Ibridare l&#39;array a 65 ° C per 17 ore. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio 2, aggiungendo Triton X-102 ad una concentrazione finale di 0,005%. Mantenere a 37 ° C durante la notte. </li></ol> 4. Microarray lavaggio <ol><li> Aggiungi Triton X-102 di tampone di lavaggio da 1 a una concentrazione finale di 0,005%. Conservare a Temperatura ambientee. </li><li> Quando l&#39;ibridazione è finito, riempire un bicchiere piatto &quot;A&quot; con il tampone di lavaggio 1. Il piatto dovrebbe essere abbastanza grande per tenere il montaggio / smontaggio strumento e consentire alcune manovre pure. Tutti i lavaggi dovrebbe essere fatto in vetro. Evitare piatti di plastica, in quanto tendono a percolare composti nel fondo di alta dell&#39;array. </li><li> Mettere un rack scivolo e una ancoretta in una colorazione piatto &quot;B&quot;. Riempire con tampone di lavaggio 1, facendo attenzione che copre il rack. Mettere su un piatto mescolate a temperatura ambiente. </li><li> Mettere un ancoretta su un piatto colorazione vuota &quot;C&quot; e posto su un piatto mescolare. </li><li> Rimuovere l&#39;array e metterlo nel montaggio / smontaggio utensili. Immergere tutta l&#39;assemblea nel piatto &quot;A&quot;. </li><li> Tenendo premuto il montaggio / smontaggio utensili e il vetrino da lati opposti con una mano, con cura staccare il mixer A4. Fai attenzione a non graffiare la superficie dell&#39;array. </li><li> Rapidamente posto il vetrino nel rack in colorazione piatto &quot;B&quot;. D&#39;ora in poi, l&#39;esposizione all&#39;aria deve essere ridotto al minimo in quanto il Cy5 colorante è sensibile all&#39;ozono. Non lavare più di 8 array per volta. </li><li> Lavare mescolando per 1 minuto a velocità media. </li><li> Compila colorazione piatto &quot;C&quot; con pre-riscaldato tampone di lavaggio 2. Trasferire i vetrini e lavare per 1 minuto. </li><li> Molto lentamente rimuovere il rack diapositiva colorazione piatto &quot;C&quot; per ridurre al minimo le goccioline lasciato sul vetrino. </li><li> Asciugare il vetrino facendo girare per 2 minuti. Se una centrifuga compatibile non è disponibile, centrifugare il vetrino in un tubo da 50 ml conica o colpo di gas argon su di esso. </li><li> Collocare i vetrini in 50 ml di tubo conico e riempirlo con gas argon. Scansione immediatamente per evitare la perdita di segnale. Si consiglia di utilizzare lo scanner GenePix 4000B da Molecular Devices. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Buona qualità dei campioni di RNA totale dovrebbe produrre solo due picchi principali quando viene eseguito in un Bioanalyzer per il controllo qualità, corrispondenti ai 2 principali specie di RNA ribosomiale. Alcuni degradazione dell&#39;RNA mostrerà come uno striscio prima del primo picco di RNA ribosomiale. Pesantemente degradato, l&#39;RNA di bassa qualità mostrerà un picco largo o una serie di picchi a tempi di ritenzione bassa, mentre i 2 picchi di RNA ribosomiale sarà di intensità molto bassa o non identificabili a tutti. Per gli esempi dell&#39;output 2100 Bioanalyzer, vedi figura 1. L&#39;Esperto 2100 software calcola un numero di integrità di RNA, o RIN, come misura quantitativa della qualità RNA. Campioni di alta qualità, con valori RIN superiore a 9, sono ovviamente migliori per le applicazioni di microarray. Tuttavia, abbiamo usato i campioni con valori di RIN più basso 5,2 nella generazione dei dati di microarray di qualità ragionevole. Array di buona qualità dovrebbe produrre segnale alto a valori relativamente bassi PMT. Nel nostro esperimento, la maggior parte delle trascrizioni sono tenuti ad essere presenti a livelli simili nel campione sperimentale e di riferimento; massiccia, i cambiamenti nell&#39;espressione genica diffusa probabilmente prive di qualsiasi significato biologico. Pertanto, la maggior parte del vettore dovrebbe apparire giallo piuttosto che verde o rosso. Segnali di buona qualità deve essere in una gamma dinamica in modo che il segnale istogrammi si sovrappongono completamente. Ad esempio, vedere figura 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esempio di quattro campioni di RNA isolato da tessuti umani tumore al cervello. RNA è stato isolato utilizzando il protocollo presentato in 3.1.1. Qualità del campione è stata valutata utilizzando il 2100 Bioanalyzer su un chip 6000 RNA come descritto al punto 3.1.3. I campioni sono rappresentativi di 4 distinte qualità RNA: A, ottime RNA (RIN&gt; 9); B, parzialmente degradate RNA (RIN 5-6, nota il picco significativamente più basso per rRNA 28S), C, altamente degradata RNA (RIN &lt; 3); D, quasi completamente degradato l&#39;RNA (RIN = 2). Abbiamo utilizzato con successo i campioni con caratteristiche simili o migliori di quelle B (RIN&gt; 5.2) per le applicazioni di microarray a valle. Punte di freccia solide e aprire indicano la posizione del 18S e 28S rRNA specie, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esempi di immagini array e grafici a dispersione. A, anteprima scivolo, con indicazione della quattro array nel formato 4X44K Agilent; B, la scansione ad alta risoluzione di una delle zone array, nota che nessuno dei due segnali (rosso o verde) è predominante, C, grafico a dispersione dell&#39;immagine in B, si noti che i segnali si sovrappongono completamente e non superiore a 1x10 -6 caratteristiche sono ad intensità saturando.

<ol>
	<li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+Decade+Later:+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types,+Brain+Function+and+Disease.">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li><li>Barisone, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , (2010).</li><li>Gelder, R. N. V. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Profili di espressione con DNA microarray fornisce un metodo semplice per identificare i geni differenzialmente espressi tra due campioni biologici. Esperimenti di successo profili di espressione richiedono campioni di RNA di alta qualità, etichettatura robusto e ibridazione. Nella nostra esperienza, gli array commerciale e kit di etichettatura di Agilent fornire dati di alta qualità ad un costo ragionevole. Mentre Agilent offre anche la loro ibridazione propri e dei macchinari di scansione, siamo favorevoli al sistema di ibridazione da Roche-NimbleGen e la GenePix 4000B scanner microarray da Molecular Devices. Si noti che la Roche-NimbleGen unità di ibridazione è stato precedentemente noto come il sistema di ibridazione MAUI. Dopo la recente acquisizione aziendale da Roche, i mixer A4 sono stati interrotti. A partire dal momento in cui scriviamo, possono ancora essere trovati attraverso altri venditori come diagnostica KREATECH ( <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> , questo sito offre anche un comodo strumento di compatibilità array), ma a lungo termine la disponibilità di magazzino è incerta. Sistemi di ibridazione altri sono disponibili (ad esempio, da Agilent), ma se mixer compatibili è disponibile per l&#39;array in uso, si consiglia il sistema di Roche-NimbleGen per la sua qualità e riproducibilità.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2943CA</td>
<td>Includes chip priming station, vortexer, software and laptop computer</td>
</tr>
<tr>
<td>2100 Bioanalyzer electrophoresis set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G2947CA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNA 6000 Nano kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5067-1511</td>
<td>includes size ladder, marker, gel matrix, dye, electrode cleaners, spin filters and nanochips</td>
</tr>
<tr>
<td>RNase Zap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Applied Biosystems &#x2013; Ambion</td>
<td>AM9780M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Quick Amp labeling kit, two-color</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5190-0444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNeasy mini kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-542</td>
<td>Includes Blocking agent, Fragmentation buffer and Hybridization buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>Gene Expression Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>5188-5327</td>
<td>Includes Wash Buffers 1 and 2 and Triton X-102</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization Station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05223652001</td>
<td>4-slide model</td>
</tr>
<tr>
<td>Hybridization System Accesory Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Nimblegen</td>
<td>05327695001</td>
<td>Contains verification assembly for testing mixing, replacement O-rings, disassembly tool, forceps and brayer</td>
</tr>
<tr>
<td>A4 mixer hybridization chambers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whole Human Genome (4x44) Oligo Microarray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent Technologies</td>
<td>G4112F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary pistons for positive displacement pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gilson</td>
<td>F148415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nimblegen</td>
<td>05223636001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microarray fluorescent scanner, Axon GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix Pro 6.0 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna microarrays: sample quality control, array hybridization and scanning

Profilo di espressione Microarray del sistema nervoso fornisce un approccio efficace per individuare le attività di geni in diversi stadi di sviluppo, diversi stati fisiologici o patologici, la risposta alla terapia, e, in generale, qualsiasi condizione che viene testato sperimentalmente 1. Profili di espressione dei tessuti neurali richiede l&#39;isolamento di RNA di alta qualità, amplificazione del RNA isolato e ibridazione di DNA microarray. In questo articolo si descrivono i protocolli per gli esperimenti microarray riproducibili dal tessuto cerebrale tumore 2. Inizieremo con l&#39;esecuzione di un&#39;analisi di controllo di qualità di campioni di RNA isolato con Agilent 2100 Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot; tecnologia. Campioni di RNA di alta qualità sono fondamentali per il successo di qualsiasi esperimento microarray, e il 2100 Bioanalyzer fornisce una rapida misurazione quantitativa della qualità del campione. Campioni di RNA vengono poi amplificati ed etichettato eseguendo la trascrizione inversa di ottenere cDNA, seguita da trascrizione in vitro in presenza di nucleotidi etichettati in modo da produrre etichettati cRNA. Di un doppio-colore kit etichettatura, ci etichetta nostro campione sperimentale con Cy3 e un campione di riferimento con Cy5. Entrambi i campioni saranno poi combinati e ibridato ad array di Agilent K 4x44. A due colori array offrono il vantaggio di un confronto diretto tra due campioni di RNA, aumentando così la precisione delle misure, in particolare per le piccole variazioni nei livelli di espressione, perché i due campioni di RNA sono ibridate competitivo ad un singolo microarray. Gli array saranno esaminati a due lunghezze d&#39;onda corrispondenti, e il rapporto tra Cy3 per Cy5 segnale per ciascuna funzione sarà utilizzata come una misura diretta della relativa abbondanza di mRNA corrispondente. Questa analisi identifica i geni che sono differenzialmente espressi in risposta alle condizioni sperimentali in fase di test.

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DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Dimostriamo l&#39;uso di DNA microarray per profili di espressione del sistema nervoso. Noi descriviamo il controllo di qualità RNA, l&#39;etichettatura del campione, e l&#39;ibridazione di array e la scansione.

DNA microarray: Esempio di controllo della qualità, ibridazione e scansione di array

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

37.8K Views.  University of California, Davis. Dimostriamo l'uso di DNA microarray per profili di espressione del sistema nervoso. Noi descriviamo il controllo di qualità RNA, l'etichettatura del campione, e l'ibridazione di array e la scansione.

Video: DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Technical Demonstration of Whole Genome Array Comparative Genomic Hybridization

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1. Recent advances in this technology have enabled high resolution comparison of whole genomes for the identification of genetic alterations in cancer and other genetic diseases 2. The Sub-Megabase Resolution Tiling-set array (or SMRT) array is comprised of a set of approximately thirty thousand overlapping bacterial artificial chromosome (BAC) clones that span the human genome in ~100 kilobase pair (kb) segments 2. These BAC targets are individually synthesized and spotted in duplicate on a single glass slide 2-4. Array CGH is based on the principle of competitive hybridization. Sample and reference DNA are differentially labeled with Cyanine-3 and Cyanine-5 fluorescent dyes, and co-hybridized to the array. After an incubation period the unbound samples are washed from the slide and the array is imaged. A freely available custom software package called SeeGH (www.flintbox.ca) is used to process the large volume of data collected - a single experiment generates 53,892 data points. SeeGH visualizes the log2 signal intensity ratio between the 2 samples at each BAC target which is vertically aligned with chromosomal position 5,6. The SMRT array can detect alterations as small as 50 kb in size 7. The SMRT array can detect a variety of DNA rearrangement events including DNA gains, losses, amplifications and homozygous deletions. A unique advantage of the SMRT array is that one can use DNA isolated from formalin fixed paraffin embedded samples. When combined with the low input requirements of unamplified DNA (25-100ng) this allows profiling of precious samples such as those produced by microdissection 7,8. This is attributed to the large size of each BAC hybridization target that allows the binding of sufficient labeled samples to produce signals for detection. Another advantage of this platform is the tolerance of tissue heterogeneity, decreasing the need for tedious tissue microdissection 8. This video protocol is a step-by-step tutorial from labeling the input DNA through to signal acquisition for the whole genome tiling path SMRT array.

This video is a technical demonstration of the hybridization protocol for whole genome tiling path array CGH, which scans the entire human genome using only 25-100 ng of DNA that can be isolated from a variety of sources, including archival formalin fixed material.

Dimostrazione tecnica di ibridazione Whole Genome Array Comparative Genomic

Array comparative genomic hybridization (array CGH) is a method for detecting gains and losses of DNA segments or gene dosage in the genome 1.  Recent ...

Ricerca

Biologia

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Realizzazione e utilizzo di microarrays microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Array Comparative Genomic Hybridization (CGH Array) per il rilevamento di Genomic Copy Number Varianti

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Do's and Don'ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules. 
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules. 
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.

Do&#039;s and Don&#039;ts of Cryo-electron Microscopy: A Primer on Sample Preparation and High Quality Data Collection for Macromolecular 3D Reconstruction

This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Studiando la proteina del sistema di controllo di qualità di<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso Cellulare Imaging a temperatura controllata

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...