Questo materiale si basa su un lavoro sostenuto dal National Science Foundation sotto Grant No. 0842736.

Introduzione alla configurazione di GFS Novel La GFS è costituito da diversi componenti essenziali: un microscopio ottico normale, una montatura equatoriale, una telecamera e un computer [Figura 1]. La tenuta del flusso delle cellule da camera che contiene il campione è anche indispensabile secondo il disegno GFS. Il microscopio a luce è montato sulla montatura equatoriale in modo che il campo può essere ruotato in diversi orientamenti nello spazio. Questa capacità consente al vettore di gravità statica da sfruttare in modo che i campioni possono essere dinamicamente orientato in relazione al vettore così la forza di gravità può dare piconewton raggio carichi di forza ai campioni. La fotocamera sostituisce lente oculare del microscopio ottico in modo che possa registrare i cambiamenti nell&#39;orientamento del campione. Questi dati grezzi è digitalizzato e manipolato dal computer di interpretare i dati in forza effettiva e misure di distanza. La tenuta di flusso-camera è stata progettata per consentire a tutti i gradi di libertà nello spazio senza perdita di campione. Nella camera trova la molecola campione che è legato vicino a una capolinea di un &quot;ancorato&quot; perla che è incollata alla superficie della camera. Il capolinea opposto è legato ad un &quot;mobile&quot; perla che è libero dalla superficie della camera. E &#39;questo cellulare tallone, libero nel tampone che possono essere attuate dai forza gravitazionale scandagliando la molecola legato a così carichi di forza bassa [Figura 2]. Il campione appare semplicemente come un paio di microsfere al microscopio, anche se ci vuole una certa esperienza a discernere il bene coppie utilizzabile accoppiato con il loro attaccamento ad una molecola da coppie in cui entrambi i talloni sono seduti sulla superficie del flusso-camera. Una modifica al sistema è l&#39;aggiunta di una piattaforma galleggiante che tiene il GFS ed è sospeso da molle. In questa configurazione, una volta che il campione è stato ruotato in una posizione dove la forza gravitazionale può agire sul campione, la piattaforma e tutti i suoi componenti possono essere caduto contro la costante della molla. Vicino a caduta libera, la forza che agisce sul tallone mobile è prossimo allo zero e alla massima estensione delle molle &#39;, la forza gravitazionale è moltiplicato per ben due volte. In questo modo, un graduato forza / distanza risposta può essere tracciata per misurare il comportamento di una singola molecola a carichi di forza diversi. 1. Microsfere di preparazione <ol><li> Immergere circa 10 mg di perline di vetro o silice nel 0,04% 3-amminopropiltrietossisilano (taglio con acetone) per due minuti. </li><li> Risciacquare con due cambi di acqua bidistillata e centrifugare a pellet a 2000 xg per 5 minuti. Gettare il surnatante. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone di accoppiamento (0,01 M piridina tagliato con acqua bidistillata e aggiustare il pH a 6,0), e agitare questa miscela vigorosamente. Centrifuga come sopra descritto. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Per torta umida di perline, aggiungere 2 ml di soluzione gluteraldehyde 5% (taglio gluteraldehyde con buffer di accoppiamento). Agitare vigorosamente. </li><li> Sotto una cappa, ruotare tallone miscela / gluteraldehyde per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Centrifuga come sopra e aspirare il surnatante. </li><li> Lavare le perline in 5 ml di buffer di accoppiamento agitando vigorosamente e centrifugare e aspirare il surnatante. Ripetere questa operazione altre tre volte. </li><li> Aggiungere circa 15 ml di anticorpi desiderata per perline e agitare vigorosamente. Le sfere dovrebbero essere ruotato per 16-24 ore. </li><li> Sotto il cofano, aggiungere 5 ml di soluzione quenching 1 M glicina (taglio glicina con doppio acqua distillata e aggiustare il pH a 7,0). Agitare vigorosamente questa miscela e ruotare per 30 minuti. </li><li> Centrifuga e aspirare il surnatante. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone di lavaggio (0,01 M Tris, pH 7,0, sodio azide allo 0,1%, 0,1% di BSA, 0,15 M di NaCl, e 0.001 M EDTA). Agitare vigorosamente questo, centrifuga e aspirare il surnatante. Ripetere questa operazione tre volte. </li><li> Cambia il buffer a basso sale tampone (0,1 M KCl; imidazolo 0,02 M, 5 mM MgCl 2; regolare a pH 7,0). Ripetete tre volte. </li></ol> 2. Esempio di attaccamento al Microsfere <ol><li> Prendete una piccola quantità di perle di preparato (circa 2 microlitri di ogni torta di perline tuttavia, se c&#39;è una discrepanza di diametro tra i lotti, è vantaggioso utilizzare intorno ad un rapporto 8:1 di grandi perle di piccole dimensioni) e aggiungerli alla una provetta con il tampone. Ridurre la concentrazione delle proteine ​​a circa 5 micron, utilizzando il tampone. Preparare almeno un volume totale di 400 microlitri tra cui il buffer, la proteina, e le perle. </li><li> Ruota intorno a questa miscela a 1 RPM per 3 ore (se la proteina è agitato troppo, sarà aggregato e diventano inutili). </li></ol> 3. Far scorrere Camera di preparazione <ol><li> Cappotto un vetrino da microscopio di spessore con 0,01% nitrocellulosa (in acetato di amile). Lasciate che questa diapositiva asciugare per circa 10 minuti. </li><li> Con una fresa di vetro affilato, tagliate coperchio scorrevole in modo da fare una camera. Ciò richiede quattro strisce di vetro. </li><li> Utilizzare il fattoORY bordo del vetro e rastrello che attraverso una macchia di grasso per vuoto su entrambi i lati del bordo. </li><li> Strisce di grasso stampa patinata sulla nitrocellulosa secca coperto diapositiva per creare una casella sulla superficie del vetrino. </li><li> Pipettare circa 2 ml di miscela tallone / proteine ​​toccando pipetter sulla superficie di vetro all&#39;interno della scatola. </li><li> Aggiungere circa 20-400 ml di buffer di sale basso a seconda di come la camera è grande. </li><li> Premere un slittamento di copertura sulla parte superiore della scatola che è già ricoperto di grasso vuoto per terminare la camera stagna e tamponata. </li><li> Lasciate scorrere sedersi in un luogo pianeggiante così le perle hanno il tempo per ancorarsi alla nitrocellulosa. </li></ol> 4. GFS Acquisizione Dati <ol><li> Scivolo montare sul palco GFS </li><li> Monitorare quello che la macchina GFS è la registrazione e la ricerca di legittimo &quot;coppie di perline,&quot; in cui il microsfere piccolo è attaccato vicino all&#39;equatore del microsfere di grandi dimensioni. </li><li> Quando una coppia potenziale tallone viene trovato, passare attraverso la profondità di campo per determinare se il &quot;mobile&quot; tallone non è appoggiata sulla superficie del vetrino. </li><li> Una volta che una coppia adatta viene identificato, si noti l&#39;angolo mobili è lontano dal tallone d max (d max = distanza massima tra i centroidi delle microsfere accoppiato). Spostare il campo in grado di acquisire video. </li><li> L&#39;angolo di corsa del GFS dovrebbe essere sufficiente per registrare d min, d max e min d che possa rendere necessario 25-90 gradi a seconda della lunghezza della molecola. </li><li> RECORD come la coppia viaggia da d a d min max e torna a d min. </li><li> E &#39;una buona idea di girare anche un film dello sfondo in modo che possa essere sottratta in seguito per l&#39;analisi. </li><li> Se si esegue una goccia GFS, spostare la portata indietro d max e registrare la caduta di almeno 60 fotogrammi al secondo. La parte critica è l&#39;oscillazione prima, ma i tempi di lunga può anche essere utilizzato per lo studio dinamico. </li></ol> 5. GFS Analisi dei dati <ol><li> Trasforma il video prima in immagine digitale &quot;thresholded&quot; ed eseguire macro in ImageJ per determinare la posizione centroide di ogni perlina in ogni fotogramma del video. Questo è anche per il video goccia. </li><li> Dump X, Y e dati zona da ImageJ in Excel e tracciare i punti. </li><li> Se una coppia proprio tallone è stata acquisita da video, una gobba evidente nel grafico è indicativo delle perle di essere a loro più vicino (d min) e al vertice del grafico è la posizione di d max. </li><li> Utilizzando questi dati, il raggio di ciascuna microsfera deve essere determinato con precisione in ImageJ e tutte queste informazioni è messo nell&#39;equazione nidificate: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5 g = [d min 2 r + b 2 - (r a + r b) 2] 0,5 r = b sin β c = max d - r A - G (D = distanza tra centroidi; g = forza di gravità; α = l&#39;angolo in gradi parallelo alla lente dell&#39;obiettivo; r b = raggio di mobili tallone, r a = raggio di ancorate tallone; β = angolo di attacco fuori l&#39;asse del l&#39;equatore del ancorati tallone. </li><li> Utilizzando il raggio dotati del cellulare tallone che dà anche il suo volume, e data la densità del tallone, la forza il tallone mobili impartisce sulla molecola può essere calcolato in piconewtons dopo la galleggiabilità del solvente viene sottratto. Questo metodo misura la forza sulla molecola legato in piconewtons e calcola la lunghezza assoluta molecola tra gli allegati degli anticorpi in nanometri. F = V (db) a (F = forza, V = volume, d = densità del microsfere di vetro, a = accelerazione dovuta alla gravità, b = la densità dell&#39;acqua spostata). </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Se la preparazione tallone è fatto correttamente, ci saranno minimo aggregazione perla anche se ci possono ancora essere un gruppo occasionale tallone. Quando viene visto attraverso la portata, ci dovrebbe essere una distribuzione ragionevole di perline se accoppiati o meno nella camera. E &#39;importante ridurre al minimo le vibrazioni quanto più possibile, per fare questo sia un tavolo d&#39;aria, urti speciale assorbente piedi per un treppiede che contiene un montaggio EQ, o il sistema che utilizza sorgenti possono essere utilizzati per l&#39;isolamento delle vibrazioni. Un altro suggerimento utile riguardante la camera stagna flusso è di lasciarlo riposare per circa cinque minuti su un tavolo di livello dopo che è stato completamente costruito. Questo consente a qualsiasi perle più distaccato a stare a galla attraverso i buffer e resto nello strato di nitrocellulosa. Se la diapositiva sono stati invece montati direttamente dopo il completamento, l&#39;investigatore dovrebbe continuamente fare i conti con perline letteralmente volando attraverso il campo di vista, e se questo accade durante l&#39;acquisizione video che possono danneggiare °e sperimentare. Se questo è fatto correttamente, il volo tallone è significativamente ridotta al minimo e risultati video più pulito. Quando una coppia potenziale tallone è identificato dall&#39;operatore GFS, è utile per dirla con una rotazione preliminare per monitorare il comportamento della coppia. Raramente, il grande tallone non è saldamente fissata alla diapositiva. In questo caso, non serve ad utilizzare la coppia, perché è fondamentale che il più grande tallone rimanere ancorata in una posizione fissa per tutta la durata dell&#39;acquisizione. Se la coppia è stabile e non presenta &quot;ancorato rotolo perla&quot;, quindi è adatto per la sperimentazione. Un grafico delle distanze di separazione tallone contro il cambiamento in angolo relativo alla forza di gravità può essere utilizzato per valutare i dati acquisiti. Un risultato di buon rappresentante avrebbe mostrato separazione, adagiata su un altopiano e come il tallone mobili si libera il tallone ancorato a causa della influenza della gravità, il grafico mostrerà più separazione. Questo continua fino a quando un bel picco è raggiunto che si chiama d max e la curva inizia a tornare di nuovo verso il basso la linea di base d min [Figura 1]. In condizioni ideali, questa firma è simmetrico. Un non-rappresentativo risultato avrebbe mostrato un grafico con i modelli incoherent mostrando non distinte d min-max d-d modello min; o sarebbe mostrano separazioni che sono ordini di grandezza troppo alto per una singola molecola indicating forse c&#39;era un pezzo di polvere tra le perline, o forse che il tallone del mobile è stato semplicemente non collegato a tutti. Il processo di trovare la coppia, tiro esso, l&#39;elaborazione, e l&#39;analisi ha molte lacune fermare dove sono abbattuti improprio coppie tallone fuori. Quindi, se si arriva alla fine di tutto il processo e si dispone di una lunghezza molecola che è coerente con i risultati precedenti, si può essere molto fiducioso che la coppia originaria tallone è rappresentativo e possono essere inclusi nei risultati. In una giornata buona, circa la metà della ripresa tallone coppie possono essere prese attraverso di diventare un punto legittima dati. Per esempio, la lunghezza della bobina a spirale della miosina tra MF20 e MF30 anticorpi, si sa sulla base di EM dati e AFM, i dati di avvicinarsi 100 nm 2,7,8,9. Se il risultato è più volte questa lunghezza, il campione si è aggregato. I risultati presentati qui sono da standard esperimenti di rotazione GFS e dimostrare una distanza di 96 nm ± 5 nm, [Figura 2] che concorda a stretto contatto con le misure delle MF30 (che si lega a N-terminale della miosina subfragment-2) e MF20 (che si lega alla meromyosin luce) sulla distanza di separazione anticorpi miosina deduce dai valori di letteratura [Figura 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. GFS configurazione. Parti principali del GFS sono etichettati. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema di principio GFS. Lato sinistro mostra baricentro mobili tallone ad una distanza minima dal baricentro del tallone ancorata. Come GFS viene ruotato, mobile tallone allinea con vettore di gravità che è anche parallela con l&#39;asse della molecola legato. In questa posizione, la distanza tra i centroidi delle perline mobili e fissi è al massimo. In alto a destra mostra una fetta rappresentante di un film GFS. In basso a destra è un&#39;immagine della rotazione GFS subendo. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3 risultato Rappresentante mostrando min d sulla sinistra del grafico;. D max a una separazione relativa di 17,78 micron, e un ritorno al min d intorno alla linea di base di circa 17,75 micron di separazione relativa tra le perle. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Rappresentante risultato dell&#39;esperimento di rotazione GFS mostrano distanza tra MF20 e MF30 anticorpi mediamente 96 nm. Questo rappresenta la durata approssimativa di S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Miosina II dimero utilizzato per mostrare eventuali allegati da utilizzare con il GFS tra anticorpi e / o gli allegati di actina. Possibilità di attacco differenti per le diverse strategie consente GFS per misurare le diverse regioni, o di applicare forza perpendicolare o parallela al dominio asta del dimero miosina.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Durante la conversione di un filmato a una rappresentazione digitale thresholded, è fondamentale per l&#39;immagine thresholded a mantenere la stessa area in ogni fotogramma del video. Perché le perle di una coppia cordone si muovono indipendentemente l&#39;uno dall&#39;altro, la sua deriva nelle aree thresholded può anche causare le distanze relative tra i centroidi delle perline alla deriva e introdurre errori significativi. Il controllo della zona ha ridotto la soglia di errore di cinque volte nelle misure da 26 n...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>3-Aminopropyltriethoxysilane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Poly Sciences</td>
<td>919-30-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>A18P-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>110-86-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutaraldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>G7776</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Research Organics</td>
<td>BP381-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>9682T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium azide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amresco</td>
<td>71289</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>AMR-0332-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S7653</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MSI</td>
<td>E9884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>60443</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N-N Dimethyl Formamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracted from Large New </td>
<td>D4254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rabbit skeletal myosin II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zealand White Rabbits (7-8)</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF30 antibody (9-10)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental Studies </td>
<td>MF30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MF20 antibody (6)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hybridoma Bank</td>
<td>MF20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lab microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boreal</td>
<td>WW57905M00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Equatorial mount</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Celestron</td>
<td>CG-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital video cam</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony</td>
<td>XCDV60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caliper release</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cabelas</td>
<td>IA-415482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compression spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co.</td>
<td>723</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Extension spring</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jones Spring Co. </td>
<td>770</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NIH</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fire-i drivers &amp; application </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Unibrain</td>
<td>3.80</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Excel</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microsoft</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

demonstrating the uses of the novel gravitational force spectrometer to stretch and measure fibrous proteins

Lo studio della struttura macromolecolare è diventato fondamentale per il chiarimento dei meccanismi molecolari e funzione. Ci sono diversi bioinstruments limitato, ma importante, in grado di testare la dipendenza forza delle caratteristiche strutturali di proteine. Scala è stata un parametro che limita la quantità accuratamente i ricercatori possono scrutare il mondo nanomeccaniche di molecole, come gli acidi nucleici, enzimi e proteine ​​motrici che eseguono sostiene la vita di lavoro. Microscopia a forza atomica (AFM) è ben sintonizzato per determinare le strutture native delle proteine ​​fibrose con una risoluzione distanza alla pari con microscopia elettronica. Tuttavia, in studi AFM vigore, le forze sono in genere molto più alto di una singola molecola che si verifichino 1, 2. Trappole ottiche (OT) sono molto bravi a determinare la distanza relativa tra le perle intrappolati e possono impartire piccole forze 3. Tuttavia, essi non producono accurata lunghezze assolute delle molecole oggetto di studio. Simulazione molecolare fornire informazioni di supporto a tali esperimenti, ma sono limitate nella capacità di gestire le stesse grandi dimensioni molecolari, tempi lunghi, e convincere alcuni ricercatori, in assenza di altre prove 2, 4. La forza gravitazionale spettrometro (GFS), riempie una nicchia critico nell&#39;arsenale di un investigatore, fornendo una combinazione unica di capacità. Questo strumento è in grado di generare forze di solito con il 98% o maggiore precisione della gamma femtonewton alla gamma nanonewton. Le misure di distanza attualmente sono in grado di risolvere la lunghezza assoluta molecolare fino a cinque nanometri, e relative distanze di perline paio di separazione con una precisione simile a una trappola ottica. Inoltre, il GFS può determinare stretching o srotolare in cui la forza è vicino all&#39;equilibrio o fornire una forza graduata a giustapporre contro qualsiasi cambiamento strutturale misurata. E &#39;anche possibile determinare il numero di residui di aminoacidi sono coinvolti in eventi di srotolare sotto carichi fisiologici forza 2. A differenza di altri metodi dove si trova la forza di calibrazione estesa che deve precedere qualsiasi test, il GFS non richiede alcuna calibrazione tale forza 5. Integrando i punti di forza di altri metodi, il GFS colmerà le lacune nella comprensione dei nanomeccanica delle proteine ​​vitali e di altre macromolecole.

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Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Questo è un passo-passo guida che mostra la finalità, il funzionamento ei risultati rappresentante del spettrometro romanzo forza gravitazionale.

Dimostrare l&#39;Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

The study of macromolecular structure has become critical to the elucidation of molecular mechanisms and function. There are several limited, but ...

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.3K Views.  University of North Texas. Questo è un passo-passo guida che mostra la finalità, il funzionamento ei risultati rappresentante del spettrometro romanzo forza gravitazionale.

Video: Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

Axon crescita Stretch: Il meccanotrasduzione di crescita neuronale

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Ricerca

Bioingegneria

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Quantificare le proprietà meccaniche del glicocalice endoteliale con microscopia a forza atomica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ carico di compressione e Correlativo imaging non invasiva del Bone-parodontale legamento-dente Fibrosa comune

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Un nuovo metodo per la localizzazione Reporter perline fluorescenti vicino alla superficie coltura cellulare per la trazione microscopia a forza

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Recupero della fluorescenza dopo Fusione di una Droplet misurare la diffusione bidimensionale di un fosfolipide monostrato

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

Alta velocità sub-GHz spettrometro per l&#39;analisi di Brillouin Scattering

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine ​​fibrose

Dimostrare l'Usi del romanzo Spectrometer forza gravitazionale su Stretch e misura proteine fibrose