Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Lars Philipsen aiuto per ottimizzare il film intravitale, il Dr. Jonathan Lindquist per leggere attentamente il manoscritto, e tutti i membri del laboratorio Gunzer per utili discussioni e commenti durante lo sviluppo del metodo. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) a MG

1. Infezione <ol><li> Conidi Gonfiore della muffa Aspergillus fumigatus (ceppo ATCC 46645) sono generati da pre-incubazione in RPMI 1640 (Biochrom AG, Berlino, Germania) arricchito con 5% FCS (v / v). 2x10 7 riposo conidi sono risospesi in 5 ml di mezzo e incubato in un 6-pozzetti di coltura tissutale (TPP AG; Trasadingen, Svizzera, catalogo # 92006) per 7 ore a 37 ° C. </li><li> Dopo il periodo di gonfiore, le spore sono fluorescente aggiungendo 10 ml di soluzione calcofluor fondo bianco (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Germania, catalogo # F3543, [25 mg / ml] in DMSO) per ogni Aspergillus contiene bene in 6-bene piastra, raggiungendo una concentrazione finale calcofluor di 50 mg / ml RPMI. A seguito di miscelazione gentile, le spore vengono incubate per altri 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Nella fase successiva, le spore vengono raccolte mediante filtrazione attraverso una cella di 70 micron filtro (BD Biosciences, Heidelberg, Germania). Dopo il lavaggio, una volta con 10 ml di PBS (centrifugare a 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente) il pellet è risospeso in 2 ml di PBS e il numero totale di conidi gonfie determinata contando con una camera di Neubauer. Infine la sospensione di spore è filato giù al 900xg per 5 minuti a temperatura ambiente, il supernatante viene accuratamente rimosso e il pellet risospeso alla concentrazione finale della 1x107 spore per 100 l di PBS. </li><li> Per l&#39;infezione, 100 ml di soluzione di spore è applicata intratracheally in topi di sesso femminile (C57/BL6, 8-10 settimane, Harlan, Germania). Se neutrofili devono essere osservate pure, l&#39;uso di Lys-EGFP topi, portando EGFP sotto il promotore lisozima 1 è consigliata. Inizia l&#39;anestesia l&#39;animale con una sola iniezione ip di 150 microlitri Ketamin / Rompun soluzione (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Germania (Ketamin) e Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germania (Rompun), 1 ml Ketamin [50 mg / ml] + 0,5 ml Rompun [2%] + 3,5 ml di NaCl sterile [0.9%]). 5 minuti più tardi il mouse anestetizzato può essere fissato con un elastico per i suoi denti alla rampa (cioè una superficie inclinata) per facilitare l&#39;intubazione (supplementare figura 1). Utilizzando pinze, la lingua è tirata da un lato e un 22G catetere venoso a permanenza (B. Braun AG, Melsungen, Germania, Vasofix Braunüle) può essere delicatamente inserito nella trachea sotto illuminazione permanente con una lampada a collo d&#39;oca. L&#39;inserimento di successo del catetere è verificata osservando il movimento regolare del torace dell&#39;animale con la frequenza del ventilatore meccanico. Quando l&#39;intubazione di successo è stato confermato, 100 microlitri della sospensione di spore si applica con un 100 microlitri micropipetta. Questo volume deve essere inalato con l&#39;animale, senza alcun aiuto supplementare in 1-2 s. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all&#39;interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione l&#39;animale infetto per 2 minuti con un respiratore piccolo animale (Minivent, Hugo Sachs, marzo-Hugstetten, Germania) al tasso di 250 respiri al minuto e un volume inalazione di 300 microlitri per ogni respiro (supplementare figura 2). Dopo gli animali infezione sono tornati alle loro gabbia e osservato ogni 5 minuti fino ambulatoriale di nuovo. I topi non mostrano alcuna evidenza di dolore o disagio durante il periodo di incubazione successivo. </li></ol> 2. Preparazione del polmone <ol><li> 7 ore dopo l&#39;infezione con le spore, l&#39;animale è eutanasia da una dose eccessiva di isoflurano (Baxter GmbH, Unterschleiβheim, Germania) fino a quando i movimenti e la respirazione hanno smesso per più di 30 secondi. Questo viene poi seguita da toracotomia come metodo secondario per assicurare la morte clinica e consentire la visualizzazione e l&#39;accesso della trachea e polmoni. Poi il petto è aperta con cura per esporre i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Poi un altro 22G catetere venoso a permanenza viene inserito nella trachea a partire dalla epiglottide esposti. Attraverso questo tubulo i polmoni sono pieni di 1 ml preriscaldata fusione agarosio bassa (2% w / v, Promega, Mannheim, Germania) con un 1 ml Omnifix siringa (B. Braun). Non appena i polmoni sono pieni della trachea è legato con un breve pezzo di filo per cucire e l&#39;intero animale viene messo in frigorifero a 4 ° C. </li><li> 15 minuti più tardi, quando l&#39;agarosio si è solidificato, il polmone intero è escisse a partire dalla trachea. Utilizzando un paio di forbici taglienti a punta, il lobo del polmone destro è successivamente rimosso, la superficie inferiore è brevemente asciugato su un foglio di carta velina e poi l&#39;intero lobo è incollato al blocco preparazione di un (Campden Instruments, Regno Unito, vibratome 752M Vibroslice ) utilizzando una goccia di adesivo per il fissaggio del tessuto (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germania, Roti-Coll 1). Dopo 1 min il blocco è installato nella camera di taglio del vibratome, che è pieno di pre-raffreddata (4 ° C) PBS. Il vibratome è impostato su un mid-range di vibrazione (5 su 10 max.) E anche la velocità moderata (5 su 10 max.) Tale che una sezione orizzontale delpolmone è prodotta. La metà superiore del organo è poi trasferito in un piccolo piatto di plastica Petri (5 cm di diametro), dove è invertita e fissata con un self-made rondella piatta (1 cm di diametro interno) che è coperto da un insieme di fili di nylon in parallelo, ogni 1 mm l&#39;una dall&#39;altra (supplementare figura 3). Infine il piatto di Petri è riempito con 10 ml di PBS supplementato con 10 ml di colorante DNA Sytox Arancio [5 mm] (Invitrogen, Germania), con conseguente concentrazione finale di tintura di 5 micron. </li></ol> 3. 2-fotone microscopia laser <ol><li> La piastra di Petri contenente il campione del polmone viene poi installato sotto il microscopio obiettivo in modo che il buffer può essere riscaldato a 37 ° C da un sensore di temperatura controllata riscaldamento (supplementare figura 4). 2-fotone microscopia viene poi effettuata sulla superficie di taglio tutto utilizzando un microscopio Zeiss LSM 710 NLO su un palco eretto Axio Examiner dotata di un obiettivo 20xNA1.0 acqua immersione (Zeiss, Jena, Germania). Per l&#39;imaging, diverse aree lungo la sezione vengono sottoposti a scansione fino a 400 micron di profondità con una lunghezza d&#39;onda di 800 nm illuminazione rilevazione verde (530 nm) e rosso (580 nm) fluorescenza, così come la generazione di seconda armonica (SHG)-segnale e il blu calcofluor fluorescenza (emissione a 400-470 nm) con rilevatori esterni non descanned (NDD). Oltre 2-D immagini e filmati lasso di tempo (1 immagine ogni 5-10 secondi), singoli o ripetitivi 3-dimensionale pile foto può essere successivamente reso come rendering voxel o singole immagini messa a fuoco estesa o 4-D di dati (3D nel tempo) con differenti pacchetti software. Questa configurazione permette l&#39;osservazione microscopica del comportamento cellulare in un ambiente quasi intatto, che, in quanto costituisce la porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni aerodispersi, è di enorme rilevanza immunologica. Motilità cellulare, fagocitosi e la produzione endogena NET da parte dei neutrofili dopo l&#39;infezione con la muffa Aspergillus fumigatus può essere facilmente studiato in queste condizioni in situ. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Se fatto correttamente l&#39;imaging genererà 2 - o 3-colore diapositive o filmati. Anche se la colorazione è fatto in una procedura di post-elaborazione ed è quindi liberamente adattabile, generalmente selezionare uno schema di colorazione che riflette il colore naturale del colorante / segnale, che viene rilevato nel canale relativo. Così, i coloranti Sytox sono rappresentati in rosso, il fungo così come il segnale SHG è mostrato in blu e, se presente, EGFP-etichettati cellule sono colorate in verde. Nel primo esempio (Fig. 1) il segnale SHG blu raffigura le fibre di un tessuto non infetto del polmone e il segnale rosso Sytox è prodotto da nuclei di cellule del polmone residenti taglio aperto dal vibratome. Nel secondo esempio (Fig. 2) un polmone infetto viene mostrato, dove entrambi, strutture alveolari così come masse fungine, appaiono in blu, mentre i nuclei e reti sono macchiate di rosso. Il terzo esempio (Fig. 3) è da un Lys-EGFP animale transgenico dove oltre alle strutture blu e rosso i neutrofili verde può anche essere visto. La migrazione dei neutrofili e la loro fagocitosi dei singoli elementi fungini in sequenze lasso di tempo viene mostrato nel film supplementare. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. L&#39;aspetto di un non-infetti fetta di polmone in 2 colori 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone è stato preparato da un non-infetti C57/BL6 mouse e ripreso come descritto nel protocollo. Qui presentate sono il segnale SHG della struttura del tessuto alveolare (A), il segnale Sytox dei nuclei cellulari taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C). L&#39;area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare il tessuto fibroso alla base del polmone fetta rispetto alla organizzazione chiaramente all&#39;interno della respirazione alveolare-attiva aree del polmone di cui sopra. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La comparsa di una fetta del polmone di un animale infetto tipo Aspergillus selvatici in 2-color 2-fotone microscopia. Una fetta del polmone da un mouse C57/BL6 infettato 7 ore prima con A. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (A), il segnale di Sytox NET DNA così come i nuclei delle cellule taglio aperto durante la preparazione della fetta del polmone (B), e una sovrapposizione dei due canali (C) . L&#39;area in scatola (C) è visto ampliato (D). Si prega di notare, le aree ben distinte delle masse fungine, alveoli, e NET-strutture sono contrassegnate con le lettere F, A e N, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. La comparsa di una fetta di un polmone infetto Aspergillus Lys-EGFP animale in 3-color 2-fotone microscopia. Una fetta di un polmone Lys-EGFP topo infettato 7 ore prima conA. fumigatus è stato preparato e immaginato come descritto nel protocollo. Indicato è la struttura combinata fungine e SHG del tessuto alveolare (blu), il segnale Sytox dei nuclei delle cellule e NET (rosso), così come pure numerosi neutrofili (verde). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="Figura 4" /> Supplementare figura 1. Fissazione del mouse per l&#39;intubazione. Sotto Ketamin / Rompun anestesia l&#39;animale è fissato con un elastico al suo denti al fine di facilitare l&#39;intubazione con un catetere venoso 22G interiore. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="Figura 5" /> Supplementare figura 2. Ventilazione meccanica del mouse. Il mouse intubato è stato infettato da un Qualora l&#39;applicazione delle 1x10 7 spore risospesi in 100 l di PBS. Una migliore distribuzione delle particelle di funghi all&#39;interno del polmone è ottenuto meccanicamente ventilazione il mouse infettato da un respiratore piccolo animale. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="Figura 6" /> Supplementare figura 3. Fissazione del lobo del polmone. Dopo la preparazione del lobo del polmone destro l&#39;organo è fissato in una capsula di Petri con l&#39;uso di una rondella di laboratorio fatte piatto che è coperto da un insieme di fili di nylon paralleli. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="Figura 6" /> Supplementare figura 4. 2-fotone configurazione imaging. La piastra di Petri contenente il lobo destro del polmone è installato su una stuoia di riscaldamento sotto il 2-fotone microscopio dopo l&#39;aggiunta del colorante DNA Sytox Orange. Supplementare film:. Neutrofili migrazione e phagocytosing elementi fungine da Aspergillus nei polmoni infettati visto dal lasso di tempo 2-fotone microscopia di una fetta di vita del polmone 7 ore dopo l&#39;infezione con il fungo neutrofili sono verdi, elementi fungini e SHG sono blu, e nuclei delle cellule come così come NET-strutture sono rappresentate in rosso. Il tempo reale di questo esperimento viene mostrato in basso a destra. La barra di scala rappresenta 50 micron. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1 - supplemental.mpg">Clicca qui per guardare il video</a>

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In tempo reale 2-fotone microscopia in vivo o in organi intatti ha assunto un&#39;importanza profonda negli studi che fare con la fisiologia delle cellule immunitarie negli ultimi 10 anni. E &#39;con questa tecnica che eventi importanti come le dinamiche di attivazione delle cellule T all&#39;interno dei linfonodi prima divenne visibile 2-4. Più di recente, i ricercatori hanno anche iniziato ad analizzare specifiche funzioni cellulari, come i primi passi nella generazione di cellule effettrici nei tessuti linfatici utilizzando questo approccio 5. Tuttavia, anche se un certo numero di nuovi concetti biologici sono stati rivelati con questo metodo, ci sono ancora sfide e questioni importanti per i quali non esistono studi di visualizzazione intravitale sono stati pubblicati finora. In particolare questo vale per i polmoni dei mammiferi. L&#39;aspetto interessante di questo organo, come porta di ingresso per una varietà di agenti patogeni nell&#39;aria, la rende una delle superfici più cruciale in cui i processi immunologici hanno luogo nel corpo dei mammiferi. Con ogni respiro nel corso della vita intera, particelle indesiderate vengono inalate, alcune delle quali hanno il potenziale di indurre in pericolo di vita infezioni 6. E si spiega da sé che in un sito sensibile e in via di estinzione una fitta rete di meccanismi di difesa deve essere presente esibendo tutto il repertorio di risposte immunitarie. D&#39;altra parte è molto importante che la lotta contro i patogeni immunologico indotto potenziale in un posto così &quot;sporco&quot; è strettamente controllato. Reazioni esagerate del sistema immunitario sopportare un elevato rischio di danneggiare il proprio corpo in maniera massiccia da ferire i tessuti degli organi dopo la stimolazione di azioni non specifica delle cellule immunitarie 7,8. Alla luce di questi pensieri sarebbe estremamente interessante ed utile avere la possibilità di studiare il comportamento delle cellule nei polmoni dei mammiferi in vere condizioni in vivo. Tuttavia, il fatto che un tale sistema finora non è stato attuato con successo in modo chiaro i punti per le enormi difficoltà che devono essere risolti nella creazione di un protocollo di lavoro. La sfida più impegnativa è probabilmente la stabilità fuoco. Il polmone come organo responsabile per la respirazione è in movimento costante in tutte e tre le direzioni dello spazio per realizzare l&#39;inalazione. Questa sola circostanza provoca gravi problemi di immagine e può essere considerato un intravitale imager &quot;incubo&quot;. Già un leggero movimento a qualsiasi dimensione nello spazio ha un effetto enorme sul deterioramento della vista microscopico, che deve essere stabile con precisione micrometrica al fine di generare immagini significative 9. Dato il suo accento intrinsecamente stretto locale 10, 2-fotone microscopia è ancora più sensibile alle instabilità focale, come una lussazione di una certa struttura della gamma di appena pochi micrometri nella direzione Z è equivalente a una completa perdita di messa a fuoco e così un esperimento fallito. Il protocollo presentato in questo studio per l&#39;osservazione delle cellule immunitarie all&#39;interno del polmone murino non è ancora in applicazione in vivo, ma una buona approssimazione la situazione in un polmone funzionalmente integro 11. Approcci ex vivo dei linfociti immagini, ad esempio in linfa espiantati nodi, hanno dimostrato di produrre risultati equivalenti a vere osservazioni in vivo in 12 e quindi sono molto importanti 5. Le osservazioni in situ a fette polmone, che sono possibili solo con il nostro approccio, si svolgono in un polmone infetto poco dopo l&#39;escissione. L&#39;integrità 3D durante il processo di taglio è garantita dalla matrice di agarosio, un passo essenziale per consentire un processo controllato con precisione il taglio del polmone. Anche se è necessario raffreddare il polmone espiantati per un breve periodo per consentire una solidificazione della matrice di agarosio, è possibile tornare a condizioni quasi fisiologiche per le cellule e rewarming dopo il taglio del tessuto. Questo è chiaramente dimostrato dai nostri dati, che dimostrano che in queste condizioni neutrofili sono molto attivi e mostrano il loro pieno potenziale come fagociti agile, che sono necessari per la liquidazione effettiva di una infezione da Aspergillus fumigatus. Pattugliano il tessuto polmonare passando attraverso le barriere epiteliali per raggiungere le parti interne degli alveoli e inoltre si occupano attivamente spore fungine 11. Un risultato chiave di questo lavoro è stato la comparsa di strutture simili neutrofili trappole extracellulare (NET) nel Aspergillus organo infetto. NET sono una scoperta molto recente di un nuovo meccanismo di difesa nei neutrofili 13. Tuttavia, sin dalla sua prima descrizione nel 2004, il numero di condizioni fisiologiche o patologiche in modelli animali e nell&#39;uomo dove questo fenomeno è stato osservato che manca o è stato esplosivo aumento 14-16. Curiosamente, sebbene tanto lavoro è stato speso per queste strutture da parte di gruppi così diversi, la maggior parte i rapporti sono ancora ad un livello molto descrittivo e non molto èsa del meccanismo di rilascio NET e la sua regolazione. Con il nostro protocollo siamo stati in grado per la prima volta a mostrare le fibre NET in un polmone infetto. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare l&#39;importanza di neutrofili appena reclutati così come le strutture molecolari funghi per il loro verificarsi o inibizione 11. Questo mostra chiaramente il potenziale del nostro metodo per indagare i singoli passaggi della formazione NET in modo più dettagliato. Si potrebbe pensare ad esempio per utilizzare neutrofili da topi knock-out adatto per osservare la loro capacità di formazione NET negli esperimenti di trasferimento adottivo. Quindi, anche se l&#39;osservazione diretta di immigrazione neutrofili dal sangue periferico non è possibile con questo sistema a causa della mancanza di afflusso di sangue dopo espianto dell&#39;organo, continuiamo a credere che il nostro protocollo è un approccio importante e relativamente facile da gestire che permette l&#39;imaging di passi presto o tardi nella difesa immunitaria contro le infezioni polmonari. Questo è, dunque, un passo importante verso indagare questo fenomeno all&#39;interno del polmone respirazione di animali vivi.

direct observation of phagocytosis and net-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy

Dopo il tratto gastrointestinale, il polmone è il secondo più grande superficie per l&#39;interazione tra il corpo dei vertebrati e l&#39;ambiente. Qui, un efficace scambio di gas deve essere mantenuto, e al tempo stesso evitare il contagio da agenti patogeni multipli che vengono inalati durante la respirazione normale. Per raggiungere questo obiettivo, una serie di strategie di difesa superba combinazione di meccanismi immunitari umorali e cellulari esiste. Una delle misure più efficaci per la difesa acuta del polmone è il reclutamento dei neutrofili, che o fagocitare i patogeni inalati o ucciderli rilasciando sostanze citotossiche. Una recente aggiunta all&#39;arsenale di neutrofili è il loro rilascio esplosivo di DNA extracellulare-NET da cui i batteri o funghi possono essere catturati o inattivato, anche dopo che le cellule rilasciando NET sono morti. Vi presentiamo qui un metodo che permette di osservare direttamente neutrofili, la migrazione all&#39;interno di un polmone recentemente infettati, phagocytosing patogeni fungini e visualizzare i NET estesa che hanno prodotto in tutto il tessuto infetto. Il metodo descrive la preparazione di spesse fette di polmone vitale 7 ore dopo l&#39;infezione endotracheali di topi con conidi della muffa Aspergillus fumigatus e il loro esame da multicolore time-lapse 2-fotone microscopia. Questo approccio permette di studiare direttamente difesa antifungina nel tessuto polmonare nativa e apre così una nuova strada per lo studio dettagliato di immunità polmonare.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l&#39;osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.6K Views.  Otto-von-Guericke University Magdeburg. Mostriamo, come utilizzare 2-fotoni microscopia per l'osservazione delle dinamiche di granulociti neutrofili nei polmoni infettati mentre fagocitare agenti patogeni o di produrre dei neutrofili trappole extracellulare (NET).

Video: Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Lo studio delle interazioni di<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

Misura High Throughput di extracellulare DNA di uscita e quantitativa NET Formazione in neutrofili umani<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-lapse Imaging 3D della fagocitosi dai macrofagi del topo

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

Quantificazione in tempo reale delle specie reattive dell'ossigeno nei neutrofili infettati da Escherichia Coli meningitica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.