LPE è una scozzese Senior Fellow clinica e riconosce il sostegno dell&#39;Ufficio Chief Scientist (SCD/03). Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust Progetto Sovvenzione LPE (089.930). NARG è stato finanziato da un programma Wellcome Trust Grant (080.088) e la sovvenzione di attrezzature (075.470) (per DeltaVision), e da un FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010-260338-Allfun). Vorremmo ringraziare l&#39;Università di Aberdeen impianto di imaging, in particolare Kevin MacKenzie, per il supporto e consigli utili.

1. C. albicans crescita e Condizioni <ol><li> Preparare SC-Ura piastre di agar con l&#39;aggiunta di 6,9 g di base di lievito senza amminoacidi azoto, 1 ml di NaOH 1 M, 10 ml 1% (w / v) di sale hemisulphate adenina e 20 g di agar tecnica (precedentemente descritto in 11). Portare a volume di 900 ml con acqua distillata H 2 O. Autoclave, lasciare raffreddare agar, ma non abbastanza per solidificare, e quindi si aggiungono 50 ml di soluzione salina al 40% di D-glucosio e 50 ml sterile 4% SC-Ura dropout in condizioni asettiche. Mescolare, versare in piastre di Petri e lasciare piastre di agar raffreddare e solidificare. Piastre di agar Conservare a 5 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Streak C. albicans sierotipo A ceppo CAI4 + CIp10 dalle scorte glicerolo conservati a -80 ° C su SC-Ura piastra di agar. </li><li> Incubare la piastra a 30 ° C fino a formare colonie e conservare a 5 ° C. </li><li> Cultura un singolo C. albicans colonia in 5 ml SC-Ura medio (ricetta come in 1.1, ma senza agar tecnico) e incubare una notte a 30° C, 200 rpm per generare fase stazionaria C. albicans. </li></ol> 2. C. albicans colorazione Uso isotiocianato di fluoresceina (FITC) <ol><li> Aggiungere 10 microlitri C. cultura albicans overnight a 990 microlitri di PBS (pH 7,4) ed eseguire una conta cellulare utilizzando un emocitometro. </li><li> Per facilitare la visualizzazione di C. albicans durante saggi di fagocitosi, macchia 1 × 10 8 C. albicans usando 1 mg / ml FITC in 0,05 M tampone carbonato-bicarbonato (pH 9,6) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Per rimuovere FITC non legato, lavare C. albicans in 1 ml 1 x PBS, centrifugare a 3000 xg per 5 min, rimuovere surnatante e risospendere pellet in 1 ml 1 x PBS. Ripetere 3 volte. </li><li> Risospendere pellet a 1 x 10 6 cellule / mL in 1 x PBS. </li></ol> 3. Preparazione della linea cellulare di macrofagi J774.1 mouse <ol><li> Mantenere J774.1 macrofagi nel 75 cm 2 tessutobeute di coltura in DMEM supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina a 37 ° C con 5% di CO 2. La preparazione di macrofagi primari è descritto altrove in dettaglio 12, 13. </li><li> Raschiare J774.1 cellule dal pallone di coltura tissutale e trasferire in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 600 g per 5 min per ottenere un pellet di cellule. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 10 ml di pre-riscaldato terreno DMEM integrato. Contare le celle utilizzando un emocitometro e la piastra 1 × 10 6 J774.1 macrofagi in 2 ml di terreno DMEM integrato in un 35 mm vetro piatto a base di imaging. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Prima di imaging, sostituire DMEM integrato con 2 ml di pre-riscaldato integrato CO 2-media indipendenti (con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FCS), 200 U / ml di penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina) contenente 1 mM LysoTracker Red ND-99.</li></ol> 4. Cella in diretta Video Microscopia Assay fagocitosi <ol><li> La scelta del microscopio dipenderà ciò che è disponibile localmente, ma la configurazione microscopio dovrà prevedere una fase invertita, una camera ambientale riscaldata a 37 ° C e di eccitazione / emissione filtri per le macchie scelti (FITC e TRITC). </li><li> Acceso il riscaldamento microscopio prima dell&#39;esperimento e consentire un tempo sufficiente per la camera di controllo ambientale riscaldare a 37 ° C. Il tempo impiegato per la temperatura della camera di stabilizzare varia per diverse configurazioni microscopio. </li><li> Accendere il microscopio e il computer, e caricare il software di imaging. Montare il piatto di imaging sul palco microscopio e regolare la messa a fuoco per trovare le J774.1 macrofagi. Ottimizzare l&#39;aspetto delle immagini TRITC e DIC regolando la percentuale di luce trasmessa e tempi di esposizione. </li><li> Rimuovere il piatto di imaging e aggiungere 3 × 10 6 FITC-tinto C. albicans a tlui servire. Registrare il tempo che C. albicans è aggiunto al piatto. Ritorna il piatto sul palco e ottimizzare l&#39;aspetto delle immagini FITC, se necessario. Impostare un elenco punti se necessario. </li><li> Iniziare immagini quando tutti i punti sono a fuoco e i canali sono ottimizzati. Cattura FITC, immagini e TRITC DIC ogni minuto per 6 ore. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).</li><li>Keppler-Ross, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+yeast+by+murine+macrophages+requires+mannan+but+not+glucan.">Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan.</a> Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).</li><li>Vijayan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mincle+polarizes+human+monocyte+and+neutrophil+responses+to+Candida+albicans.">Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans.</a> Immunol. Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+specific+assessment+of+Candida+albicans+phagocytosis+by+macrophages+identifies+cell+wall+composition+and+morphogenesis+as+key+determinants.">Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants.</a> PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).</li><li>Klaas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialoadhesin+Promotes+Rapid+Proinflammatory+and+Type+I+Interferon+Responses+to+a+Sialylated+Pathogen,+Campylobacter+jejuni.">Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni.</a> J. Immunol. , (2012).</li><li>Lewis, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+infection+inhibits+macrophage+cell+division+and+proliferation.">Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Bain, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal Genet. Biol. , (2012).</li><li>Mora-Montes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+macrophages+and+cell+wall+oligosaccharides+of+Candida+albicans.">Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).</li><li>McPhillips, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+apoptotic+cell+phagocytosis+by+macrophages.">Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages.</a> Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).</li><li>Erwig, L. -. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. NG è un destinatario di sovvenzioni senza restrizioni per la ricerca di base da Gilead Sciences. LE lavora come consulente per GSK nello sviluppo di farmaci iniziale.

Qui il metodo per l&#39;utilizzo di live-cell video microscopia a studiare fagocitosi dei macrofagi è descritto. Microscopia video offre molteplici livelli di informazioni per l&#39;analisi. Un vantaggio fondamentale è che i dati di assorbimento può essere generato (da un singolo esperimento) per ogni punto temporale durante tutto il periodo di osservazione 6 ore. Ancora più importante, il metodo descritto consente analisi differenziale delle singole fasi di fagocitosi. Abbiamo, per esempio, mostrato che le variazioni assorbimento complessivo di C. glicosilazione albicans e mutanti morfogenesi da linee cellulari macrofagiche e macrofagi primari può essere una conseguenza di cambiamenti nella migrazione dei macrofagi verso cellule bersaglio o tasso di immersione una volta contatto cellula-cellula è stabilito 7. Ci sono una serie di trappole da evitare lo svolgimento questi esperimenti. Primo, è molto importante assicurare condizioni ambientali stabili durante la procedura sperimentaleDure. Ciò si ottiene in una camera ambientale che viene impostato alle condizioni sperimentali diverse ore prima di iniziare l&#39;esperimento. La qualità video è altamente dipendente sofisticati moduli che utilizzano laser a infrarossi per mantenere automaticamente il campione z-posizione indipendentemente cambiamenti meccanici o termici eliminando così la necessità di correzioni fuoco manuale. Data la natura estesa degli esperimenti, è importante limitare l&#39;esposizione della luce laser e associati effetti photobleaching e fotoconversione, che può essere minimizzata utilizzando marcatori altamente fluorescenti, che facilitano i tempi di esposizione. Il protocollo di colorazione FITC qui descritto è veloce e affidabile. Come FITC è molto luminoso e stabile macchia, tempi di esposizione bassi sono necessari e questo rende ideale FITC per lunghi filmati time-lapse. Tuttavia, abbiamo abitualmente utilizzano una varietà di macchie bersaglio diverse, comprese Calcofluoro bianco e coloranti PKH nonché organismi etichetta. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La maggior parte del nostro lavoro pubblicato è condotta utilizzando un ampio campo ottico, ma l&#39;esposizione può essere ulteriormente ridotta utilizzando un microscopio confocale disco che gira nelle nostre mani e questo è essenziale per la microscopia time-lapse video 3D. Durante questo studio, le immagini sono state catturate ad intervalli di 1 minuto per un saggio di fagocitosi 6 ore. L&#39;intervallo tra le immagini può essere regolata a seconda del processo in esame. Per esempio, l&#39;intervallo può essere diminuita quando indagando rapidi processi quali il traffico vescicolare. L&#39;intervallo di tempo minimo sarà limitato dalle specifiche microscopio e della fotocamera. Ci sono alcune considerazioni da tenere a mente durante la regolazione delle temporizzazioni. In primo luogo, riducendo l&#39;intervallo tra le istantanee significa meno punti possono essere esposte e la dimensione del file crescerà considerevolmente. Al contrario, aumentando l&#39;intervallo di immagine troppo farà il film perde continuità. Questo approccio può essere applicatoin linea di principio per studiare altri agenti patogeni e l&#39;assorbimento di morire cellule ospiti. Per esempio, abbiamo recentemente dimostrato che i macrofagi di midollo osseo derivate da sialoadhesin-carente topo esibiscono notevolmente ridotto vincolante e fagocitosi di sialylated Campylobacter jejuni 8. Tuttavia, le dimensioni di destinazione è un fattore determinante per la fattibilità, come analisi di immagine diventa sempre più difficile con una riduzione delle dimensioni delle cellule bersaglio. Sofisticato software di analisi delle immagini è essenziale per l&#39;analisi rapida microscopia video, e questo dovrebbe essere accompagnato da un adeguato sostegno bioinformatica per facilitare la generazione di algoritmi per studiare la migrazione delle cellule singole e popolazioni di cellule intere 7. Live-cell video microscopia in combinazione con software sofisticati di analisi di immagine per il minuto per minuto l&#39;analisi della migrazione e dei singoli macrofagi-C.albicans interazioni, fornisce una visione unica della complessità di C. fagocitosi albicans da macrophages. C&#39;è un enorme potenziale di espandere questi metodi per studiare altri patogeni e fagociti (cellule dendritiche, i neutrofili) e di sviluppare microscopia video 3D a immagini interazioni cellula-cellula in modo più approfondito o su più superfici fisiologiche come strati di cellule epiteliali ed endoteliali. Questa tecnica fa parte della nuova generazione di strumenti per lo studio di interazioni ospite-patogeno e contribuirà a generare dettagliate informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Lievito base di azoto senza amminoacidi </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Sigma </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> Hemisulphate sale Adenina </td><td> Sigma </td><td> A3159-25G </td></tr><tr><td> Agar tecnico (n. 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-Ura dropout </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> Sigma </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> Carbonato di sodio </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> Bicarbonato di sodio </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </td&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Life Technologies </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35 millimetri di vetro piatti </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

Liquidazione fagocitaria dei patogeni fungini e microrganismi più in generale, può essere considerato costituito da quattro fasi distinte: (i) la migrazione dei fagociti al sito in cui si trovano i patogeni; (ii) riconoscimento di pattern molecolari associati al patogeno (PAMPs) tramite modello recettori di riconoscimento (PRR), (iii) immersione di microrganismi legati alla membrana cellulare dei fagociti, e (iv) il trattamento delle cellule inghiottito all&#39;interno fagosomi maturazione e la digestione della particella ingerito. Studi che valutano la fagocitosi in toto sono informativi 1, 2, 3, 4, 5, ma sono limitati nel senso che normalmente non rompere il processo di migrazione in giù, immersione e maturazione phagosome, che può essere pregiudicato differenziale. Inoltre, tali studi valutare assorbimento come un singolo evento, piuttosto che come un processo continuo dinamico. Abbiamo recentemente sviluppato avanzate dal vivo di cellule tecnologie di imaging, e hanno unito questi con genetico analisi funzionale di entrambicellule del patogeno e host per creare una piattaforma interdisciplinare per l&#39;analisi della funzione delle cellule immunitarie innate e patogenesi fungina. Questi studi hanno rivelato nuovi aspetti della fagocitosi, che potevano essere osservati con sistematica analisi temporale delle interazioni molecolari e cellulari tra i fagociti umani e agenti patogeni fungini e microrganismi infettivi più in generale. Per esempio, abbiamo cominciato a definire la seguente: (a) i componenti della superficie cellulare per ogni fase del processo di riconoscimento, immersione e l&#39;uccisione delle cellule fungine 1, 6, 7, 8, (b) come geometria della superficie influenza l&#39;efficienza di assorbimento macrofagi e uccisione di lievito e cellule ifali 7, e (c) come engulfment conduce ad alterazioni del ciclo cellulare e il comportamento di macrofagi 9, 10. In contrasto istantanee singole punto temporale, live-cell video microscopia permette un&#39;ampia varietà di cellule ospiti e patogeni da studiare come cosequenze continua che in periodi di tempo lunghi, fornendo informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici, tra cui la migrazione cellulare, la replica e il traffico vescicolare. Qui si descrive in dettaglio come preparare host e cellule fungine, e per eseguire l&#39;esperimento di video microscopia. Questi metodi possono fornire ad un utente-guida per gli studi futuri con altri fagociti e microrganismi.

Qui vi mostriamo i risultati rappresentativi per C. assorbimento albicans da una linea cellulare murina di macrofago J774.1 durante un live-6 hr cella esperimento di video microscopia. Figura 1 è un rappresentante live-cell film microscopia video, che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. Live-cell microscopia video consente interiorizzazione di C. albicans da visualizzare senza la necessità di macchiare Candida esterno. Tuttavia, durante questi esperimenti, C. albicans è stato colorato con il colorante sensibile al pH FITC (verde), che viene spenta durante acidificazione dei fagosomi macrofagi, e facilita la conferma che Candida è stata internalizzata (Figura 1). Per la visualizzazione di un ulteriore aiuto ingerito C. albicans, macrofagi sono state colorate con il colorante fluorescente rosso LysoTracker rosso DND-99, che scomparti macchie acide e serve come non specifico marcatore di maturazione phagosome.La figura 2 è un fermo immagine dal vivo a cellule esperimento di video microscopia e illustra la variazione del numero di C. albicans ingerito dalle singole J774.1 macrofagi. In questo esperimento, l&#39;82% dei macrofagi J774.1 inghiottito almeno un C. cella albicans alla fine del saggio fagocitosi 6 ore. In figura 3, il numero di internalizzato C. cellule albicans per macrofagi viene segnalato. Il numero medio di C. albicans assunte per macrofagi è 3.4, ma è interessante notare i macrofagi possono ingerire fino a 16 cellule fungine. figura 4 è una sequenza di immagini fisse da un rappresentante in tempo reale delle cellule esperimento di video microscopia che mostra un macrofago phagocytosing C. cellule albicans, crescita ifa con il macrofago e lisi infine macrofagi. Figura 4 illustra che videomicroscopia consente l&#39;analisi dei seguenti eventi engulfment di cellule bersaglio, cioè dati può essere generato per il killing dei macrofagi da C. albicans ife in relazione al numero e morfogenesi di cellule bersaglio ingeriti, e come uccisione macrofagi riguarda maturazione phagosome che può essere studiata in tempo reale. Figura 1. Live-cell film microscopia video che mostra la fagocitosi di C. albicans di macrofagi murini J774.1. I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso ND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Macrofagi e C. albicans sono state co-coltivate per un periodo di 6 ore a 37 ° C in completa CO 2-media indipendenti. Le immagini sono state catturate a intervalli di 1 min per 6 ore. Macrofagi può essere visto istituisce contatto cellula-cellula con C. albicans, che è seguito da assorbimento di C. albicans in fagosomi macrofagi. Le frecce indicano C. albicans prima immersione da J774.1 macrofagi. Questo video mostra anche che la fluorescenza FITC è QuEnched immersione seguito di C. albicans. Barra della scala, 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare filmati</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentativa live-cella video microscopia fermo immagine che mostra variazioni nel numero di C.albicans fagocitati dai macrofagi singoli. I macrofagi (tinto con LysoTracker rosso ND-99) sono stati co-coltura con FITC-tinto C. albicans (verde). C&#39;è una variazione nel numero di C. inghiottito albicans (un numero accanto a una freccia indica il numero di C. albicans inghiottito), in C. albicans morfologia (cioè versi lievito ifa). Scala bar, 20 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> Figura 3. Grafico mostra il numero di C. albicans ingerito per J774.1 macrofago murino alla fine del test di fagocitosi 6 ore. I dati rappresentano due esperimenti indipendenti. Un totale di 100 macrofagi sono stati contati da 3 campi di ogni esperimento, per un totale di 600 macrofagi individuali. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> Figura 4. Una serie di immagini da un rappresentante live-cell esperimento di video microscopia mostra un macrofago (M) e C. albicans (C), prima e durante il riconoscimento (A, B), e durante e dopo l&#39;assorbimento (C, D). C. albicans ife continuano a crescere nel macrofago (E, F), che può provocare la lisi dei macrofagi (G). Macrofagi altri vengono reclutati al sito di rottura e tentare di ingerire il rilascio C. albicans (H). I macrofagi sono colorati con il rosso colorante fluorescente LysoTracker rosso DND-99, e C. albicans sono colorati con FITC (verde). Si noti che la colorazione FITC si spegne seguendo C. assorbimento albicans da J774.1 macrofagi (C). Scala bar, 10 micron.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia video<em&gt; Candida albicans</emFagocitosi&gt; da parte dei macrofagi. Questi metodi consentono stadio-specifica analisi di migrazione di macrofagi, il riconoscimento, immersione e la maturazione phagosome e rivelare nuovi aspetti della fagocitosi.

Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

live-cell-video-microscopy-of-fungal-pathogen-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K Views.  University of Aberdeen. Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia video Candida albicans da parte dei macrofagi. Questi metodi consentono stadio-specifica analisi di migrazione di macrofagi, il riconoscimento, immersione e la maturazione phagosome e rivelare nuovi aspetti della fagocitosi.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Visualizzazione delle risposte tossina batterica provocata con diretta microscopia a fluorescenza cellulare

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Imaging cellulare dal vivo di Alphaherpes Virus Trasporti anterograda e Diffusione

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Valutare l&#39;attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotermico di amplificazione (lampada) Assays Loop-mediata per rilevamento delle specie-specifica<em&gt; Eimeria</em&gt; Che infettano Polli

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Trasformazione Biolistic di una fluorescente Tagged Gene nel Opportunistic Fungal patogeni<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica