Il meccanismo associato alla fagocitosi nell'infezione da Leishmania rimane poco compreso. Qui descriviamo i metodi per valutare i primi stati di cura durante l'interazione Leishmania con le cellule ospiti. Questa tecnica si presenta come il principale vantaggio, consentendo lo studio di diversi stati di fagocitosi Leishmania e la partecipazione di diverse proteine.
Vale la pena notare che questa tecnica può anche essere estesa ad altri tipi di studi, tra cui l'infezione da batteri, lieviti o l'inghiottimento da parte di altri tipi di cellule. Le persone che provano questa tecnica dovrebbero prendersi cura del tempo di esposizione delle cellule alla soluzione Nucleofector. Inoltre, suggeriamo di iniziare a testare la trasfezione utilizzando un massimo di due plasmidi.
A dimostrare la procedura sarà Amanda Reboucas, dottoranda del nostro laboratorio. Per cominciare, seminare 0,2 milioni di cellule THP-1 o macrofagi derivati da monociti umani in 500 microlitri RPMI per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti con vetrini da 13 millimetri. Incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica, lavare le celle due volte con soluzione salina allo 0,9% e incubare le cellule in un mezzo RPMI completo.
Aggiungere specie di Leishmania in fase stazionaria alle cellule a un parassita 10 è a un rapporto di cellule ospiti, e quindi, centrifugare a 720 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver incubato le cellule a quattro gradi Celsius per cinque minuti, lavare le cellule due volte con soluzione salina allo 0,9% per rimuovere eventuali promastigoti non internalizzati. Incubare le cellule in RPMI Medium integrato a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi fissare le cellule con il 4% di PFA per 15 minuti.
Quindi, montare i coprivetrini utilizzando il supporto di montaggio preferito. Quindi, contare almeno 400 cellule in campi casuali al microscopio a fluorescenza. Per studiare la biogenesi fotovoltaica indotta da Leishmania, iniziare a trasfettare le cellule THP-1 con plasmide seminando 15 milioni di cellule THP-1 in flaconi di coltura tissutale di 75 centimetri quadrati contenenti 10 millilitri di mezzo RPMI completo integrato con 100 nanogrammi per millilitro di PMA e 50 micromolari a mercaptoetanolo per 48 ore.
Quindi, lavare le cellule una volta in soluzione salina allo 0,9% e staccare le cellule usando una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica. Quindi, centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, risospendere le celle THP-1 in un millilitro di RPMI Medium ed eseguire i conteggi in una camera Neubauer.
Centrifugare nuovamente le cellule a 250 g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere 2 milioni di cellule in 100 microlitri di soluzione di Nucleofector e incubare con 0,5 microgrammi di rivestimento plasmidico per la proteina di interesse, marcata con una proteina fluorescente. Trasferire la sospensione contenente cellule THP-1 e acido nucleico nella cuvetta del nucleofector.
Quindi, trasfettare le cellule usando il programma Nucleofector Y uno. Recuperare le cellule trasfettate e seminare in 500 microlitri di RPMI Medium su 24 pozzetti con vetrini da 13 millimetri. Incubare le cellule e completare RPMI Medium a 37 gradi Celsius per 0,5, 2, 4, 6, 12 e 24 ore.
Lasciare i vetrini da 13 millimetri a temperatura ambiente e proteggerli dalla luce almeno 30 minuti prima dell'acquisizione. Pulire i vetrini di copertura con un fazzoletto assorbente. Quindi, aggiungi una goccia di olio ad immersione all'obiettivo, quindi aggiungi la diapositiva.
Spostate l'obiettivo verso l'alto finché l'olio non tocca la diapositiva. Osservare e regolare la messa a fuoco sul microscopio e scegliere l'opzione obiettivo 63x con olio. Apri il programma LIQA e regola i laser nelle lunghezze d'onda 488, 552 e 405.
Selezionare la risoluzione dell'immagine come 1024 x 1024. Dopo aver fatto clic sul pulsante live, impostare lo Z-stack e premere l'opzione di inizio. Attendere l'acquisizione dell'immagine e quindi selezionare l'opzione, proiezione massima, negli strumenti.
Salva l'esperimento ed esporta le immagini in formato TIFF in un computer. I risultati hanno mostrato che sia Leishmania Braziliensis LCL, sia Leishmania Braziliensis DL, si legano in modo simile ai macrofagi. Inoltre, non sono state osservate differenze per quanto riguarda la fagocitosi Leishmania Braziliensis LCL e Leishmania Braziliensis DL da parte delle cellule ospiti.
Il reclutamento di CL3 nel vacuolo parassitoforico, o PV, indotto da Leishmania Braziliensis LCL o Leishmania Braziliensis DL, è stato confrontato nelle cellule infette. Dopo quattro ore di infezione, sono state osservate percentuali simili di PV decorati con LC3 nei macrofagi infetti da Leishmania Braziliensis LCL e Leishmania Braziliensis DL. Pertanto, i risultati hanno mostrato che Leishmania Braziliensis LCL e Leishmania Braziliensis DL interagiscono in modo simile con i macrofagi durante il legame, la fagocitosi e la biogenesi dei PV per quanto riguarda il reclutamento di LC3.
Immagini microscopiche rappresentative hanno dimostrato un'efficiente trasfezione delle cellule THP-1 con plasmidi PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP. Le persone che provano questo protocollo devono prestare attenzione all'incubazione della temperatura e proteggere i campioni di microscopio dalla luce, tutti i tipi. La modulazione dell'espressione delle proteine identificate che precipitano la fagocitosi della Leishmania dimostrerà l'importanza di tali proteine nell'esito dell'infezione da Leishmania.
Possiamo estendere questa tecnica a diversi tipi di studi patologici e meccanismi associati alla creazione di parassiti e all'identificazione del bersaglio per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
