Questo lavoro è finanziato da una sovvenzione RO1 dal NIH (NINDS).

1. Virus preparazione iniettabile <ol><li> rAAVs sono stati acquistati dal produttore raccomanda commerciale, ma possono anche essere prodotta nel proprio laboratorio proprio (vedi discussione sotto). La soluzione del virus è tipicamente prodotta in un titolo di ~ 1x10 12 copie per millilitro genoma (GC / ml) e può essere utilizzato a pieno titolo a manipolare un gran numero di cellule. In alternativa, possono essere diluiti per produrre il livello desiderato di etichettatura sparse. La diluizione appropriata deve essere determinata dall&#39;utente, ma una diluizione 1:10 si raccomanda di iniziare. </li><li> Disgelo virus sul ghiaccio immediatamente prima dell&#39;uso. Trasferire il desiderato pre-diluizione volume di soluzione antivirus in un piccolo (~ 250μl) tubo PCR. Diluire la soluzione antivirus con un volume adeguato di DPBS sterile in una cappa di coltura di tessuti. Conservare soluzione diluita virus sul ghiaccio fino a quando non è necessario. </li></ol> NOTA: la gestione di tutti i virus devono essere svolte secondo un protocollo di biosicurezza approvati dal vostro istituto 2. Siringa di carico e attrezzature di assemblaggio <ol><li> Collegare l&#39;ago di carico alla siringa di vetro e di elaborare la soluzione virus dal tubo di PCR tirando delicatamente lo stantuffo. Tirare lo stantuffo fino a una bolla d&#39;aria molto piccolo può essere visto nella siringa, questo indica che tutta la soluzione è nella siringa e non è lasciata in carico l&#39;ago. In alternativa, una piccola quantità di colorante inerte può essere aggiunto alla soluzione per renderlo visibile. NOTA: Un piccolo tubo PCR dovrebbe essere usato come l&#39;ago di carico non è in genere abbastanza a lungo per raggiungere il fondo della maggior parte degli altri tubi. </li><li> Rimuovere l&#39;ago di carico e posizionare la siringa sul blocco siringa di una pompa a siringa, fissandolo con il fermo della siringa. </li><li> Inserire delicatamente un&#39;estremità del tubo connettivo nella siringa, inserire l&#39;altra estremità nella porta aghi. Inserire l&#39;ago per l&#39;iniezione nel supporto ago. La fine dell&#39;ago iniezione deve rivolgersi direttamente alla fine della parte interna tubi connettivo del titolare ago. </li><li> Premere lentamente lo stantuffo per spingere manualmente la soluzione attraverso il tubo connettivo. Spingere fino a quando una piccola goccia di soluzione è visibile sulla punta dell&#39;ago iniezione. </li><li> Con attenzione la posizione del pistone accanto al blocco spintore e fissarlo in posizione con la staffa blocco spintore. </li><li> Impostare i parametri di iniezione: velocità di iniezione deve essere di circa 8μl/min (~ 130nl / s), volume di iniezione è di solito 1-2ul, selezionare il diametro appropriata siringa per le dimensioni della siringa in uso (vedi il manuale di pompa a siringa per le linee guida). </li><li> Impostare il piano di cottura a ~ 38 ° C e coprire con un tovagliolo di carta o altro sottile barriera per proteggere i cuccioli durante la fase di recupero. </li></ol> 3. Procedura di iniezione e il recupero dei cuccioli <ol><li> Preparare P0 e P1 cuccioli di topo per iniezione sottoponendoli a freddo anestesia da un protocollo IACUC approvato. Inumidire un paio di asciugamani di carta con acqua e posto sul ghiaccio. Mettere il numero desiderato di cuccioli (4-5) sul tovagliolo di carta (tenerli ben separati) e delicatamente piegare i tovaglioli di carta sopra i cuccioli in modo che siano coperti da un tovagliolo di carta umido. Posizionare delicatamente una piccola quantità di ghiaccio tritato in cima alla tovaglioli di carta e incubare i cuccioli per circa 5 minuti. I cuccioli possono essere tenuti in ghiaccio per un massimo di 15 minuti e recuperare bene dopo. </li><li> Dopo che il cucciolo è sufficientemente anestetizzati, è posto su un blocco di montaggio (si usa un blocco di polistirolo che normalmente contiene 15ml tubi) e la posizione che per i migliori l&#39;accesso al sito di iniezione. Per la corteccia è più facile gettare le piatta animale sul ventre, mentre per il cervelletto è utile per posizionare il cucciolo la testa oltre il bordo del blocco di fornire un migliore accesso alla parte posteriore del cranio. Il cucciolo può essere fissato in posizione con un cerotto, se lo si desidera. </li><li> Tenere il cucciolo la testa in posizione con una mano mentre l&#39;ago viene inserito manualmente attraverso il cranio al sito desiderato con l&#39;altra mano. E &#39;utile per tirare la pelle tesa per evitare che si sposti durante l&#39;iniezione. Per la corteccia è utile per fare le iniezioni rispetto a un ben definito punto di riferimento anatomico, come ad esempio la sutura lambda del cranio, in quanto questo sarà di aiuto nella iniezioni futuro. Il cervelletto può essere visto attraverso il cranio, come una sottile striscia di tessuto che si trova direttamente al collicolo caudale. La profondità a cui l&#39;ago deve essere inserito varia leggermente tra i singoli animali e le tensioni e può essere misurata con indicatori predeterminati sul ferro, ma per la corteccia e il cervelletto troviamo che una profondità di circa 0,5 - 1 mm dalla superficie sono generalmente sufficienti. La profondità di inserimento anche per altri siti devono essere determinati sperimentalmente da parte dell&#39;utente finale. NOTA: L&#39;ago deve facilmente penetrare il cranio, se non, non spingere troppo duro come questo può ferire l&#39;animale. Riposizionare l&#39;ago e delicatamente riprovare. </li><li> Iniettare la soluzione di virus. L&#39;iniezione è iniziare aed premendo il pulsante START sulla pompa o deprimente un pedale, a seconda del modello di pressione iniettore utilizzato. In assenza di un pedale si raccomanda di avere un collega assistere premendo il pulsante per minimizzare i movimenti della mano inutili che possono influenzare l&#39;iniezione. </li><li> Dopo il volume selezionato è stato iniettato, tenere l&#39;ago in posizione per qualche secondo e poi rimuovere delicatamente l&#39;ago facendolo scorrere fuori senza problemi. Accertarsi di tenere il cucciolo la testa in atto per minimizzare i movimenti estranei. Dal momento che le attrezzature di iniezione viene pulito e sterilizzato tra esperimenti con etanolo e la ferita è piccola, l&#39;uso di antisettici non è necessaria. </li><li> Collocare il cucciolo sulla piastra coperta con la temperatura impostata a ~ 38 ° C per scaldarlo per il recupero, minuti al 5-10. Durante questo periodo si può continuare l&#39;iniezione altri cuccioli. </li><li> Dopo che tutti i cuccioli hanno recuperato (dovrebbero essere rosa e in movimento) prendere una parte della biancheria da letto a casa e strofinare delicatamente i cuccioli con esso. Ritorno i cuccioli con la madre come un gruppo. </li></ol> NOTA: E &#39;molto importante assicurarsi che i cuccioli sono caldi e esposti a letto a casa prima del loro ritorno alla madre e di ritornare come gruppo. In caso contrario si potrebbero causare nella madre ferire o uccidere i cuccioli. 4. Attrezzature per la pulizia <ol><li> Dopo l&#39;iniezione è completa e cuccioli sono stati restituiti alla loro madre, pulire il setup iniezione pienamente carico la siringa con acetone o etanolo al 70%. Lavare la soluzione attraverso l&#39;iniezione tempi di setup diversi, usando la soluzione fresca ogni volta. Questo rimuoverà qualsiasi soluzione rimanente virus e precipita. L&#39;acetone o etanolo poi evaporare. NOTA: L&#39;acetone è preferito per la pulizia, ma se la vostra installazione utilizza qualsiasi acetone componenti sensibili, come adesivi cianoacrilati, quindi utilizzare etanolo al 70% per questi passaggi. </li><li> Disinfettare l&#39;area di lavoro con i rifiuti candeggina ed eliminare in un apposito contenitore a rischio biologico. </li></ol> 5. Analisi <ol><li> Sacrificare gli animali all&#39;età desiderato utilizzando un metodo IACUC eutanasia approvato. Fissazione perfusione è consigliato per aiutare nella visualizzazione dopo di neuroni infetti, soprattutto negli animali adulti. </li><li> Procedure di immunoistochimica standard può essere utilizzato per amplificare il segnale fluorescente. In breve, 100 micron galleggianti sezioni vibratome sono permeabilizzate con PBS +1% Triton X-100 e bloccato in PBS +1% Triton X-100 +10% siero di capra normale. Le sezioni sono incubate nel bloccare la soluzione con gli anticorpi primari notte a 4 ° C, seguita da ulteriori lavaggio e di blocco. Le sezioni sono poi incubate nel bloccare la soluzione con anticorpi secondari per 2 ore a temperatura ambiente, lavate accuratamente, montato su guide e coperti con mezzi di montaggio anti-sbiadimento. Criosezioni può essere utilizzato anche per visualizzare neuroni marcati, tuttavia la fluorescenza endogena potrebbero andare perse. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Una procedura di iniezione di successo produrrà infezione robusto dei neuroni nella regione del sito d&#39;iniezione, senza danni ai tessuti osservabili o altri effetti nocivi sull&#39;animale. Come illustrato nella figura 1, la diffusione della infezione può essere osservata in Cre-reporter topi (ROSA26R) 12 iniettata con rAAV8-Cre in siti anatomici diversi. Iniezioni in regioni specifiche, come la corteccia e collicolo superiore, tipicamente generano infezioni locali con diffusione minima nelle regioni adiacenti (Fig. 1A-B). Uso di una soluzione ad alta virus titolo rende l&#39;infezione delle aree adiacenti, come l&#39;ippocampo, più probabile (Fig. 1A). Iniezione con risultati soluzione a basso titolo nelle infezioni da virus sparse, che rimane di solito in prossimità del sito di iniezione, come mostrato nella iniezione cerebellare di rAAV8-Cre sulla linea mediana del topo giornalista ROSA26R (figura 1C-D). Abbiamo osservato nei topi ricombinazione giornalista ROSA26R entro 2 giorni dopo l&#39;iniezione di rAAV8-Cre, suggerendo che l&#39;infezione, ricombinazione, ed espressione di geni reporter possono verificarsi in modo relativamente rapido. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per studiare gli effetti della delezione del gene in un non-ROSA locus utilizzando un allele floxed condizionale, i cui risultati verranno pubblicati altrove. Il numero di cellule infette dovrebbero correlazione con il titolo della soluzione iniettata virale. Per esempio, l&#39;iniezione di un mix di soluzioni di alto titolo di due rAAV8 virus che esprimono diverse proteine ​​fluorescenti nel cervelletto infetta molte cellule di Purkinje che sono etichettati in modo differenziale (Fig. 2A). Al contrario, iniettando una soluzione a basso titolo virus possono causare infezioni sparse per aiutare a visualizzare singole cellule (Fig. 2B). Neuroni fluorescente può essere osservata direttamente nel taglio fresco, tessuto vivo (Fig. 2B) o può essere sottoposto a immunostaining per migliorare i segnali endogeni fluorescenti per l&#39;acquisizione di immagini più tardi da grande campo o confocal microscopia a fluorescenza (Fig. 2A, fig. 3A-C). Infine, rAAV8 è in grado di infettare una grande varietà di tipi di neuroni della corteccia con l&#39;etichettatura dei processi di forte multa (Fig. 3A-C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" /> Figura 1: colorazione LacZ nel cervello di topi giornalista ROSA26R che sono stati iniettati con rAAV8 Cre-a P0 dimostra attività Cre e la posizione di infezione. <ol type="A"><li> Ampio campo di vista sagittale del cervello di un P14 che mostra alto titolo (1x10 12 GC / ml) iniezioni di corteccia e nel collicolo superiore. L&#39;uso di virus ad alto titolo rende più probabile che le aree adiacenti saranno infettati. </li><li> Sezione sagittale del P14 corteccia iniettati con basso titolo (1x10 11 GC / ml) dimostra una infezione da virus locale con minore diffusione. </li><li> Una vista wholemount di un cervelletto P28 iniettato sulla linea mediana, con basso titolo (1x10 9 GC / ml) soluzione del virus indica che l&#39;infezione è scarsa e rimane di solito in prossimità del sito di iniezione. </li><li> Sagittale della linea mediana del cervelletto in C). Si noti che le cellule di Purkinje in genere solo sono infettati da rAAV8. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" /> Figura 2: etichettatura cerebellare mediante iniezione con titoli ad alta e bassa di rAAV8 esprimono proteine ​​fluorescenti. <ol type="A"><li> Una sezione sagittale del P21cerebellum infettato con un mix di due virus che esprimono EGFP (verde) e DsRed (rosso). Un mix alto titolo di virus è stato utilizzato per infettare un gran numero di cellule di Purkinje. </li><li> Una cellula di Purkinje nel cervelletto vivere P14 titolo da infezione virale molto bassa ripreso immediatamente dopo la dissezione. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" /> Figura 3: etichettatura corticale da rAAV8-DsRed. Esempi della varietà di tipi di neuroni corticali in sezioni coronali di una corteccia P21 che è stato infettato da rAAV8-DsRed a P0.

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L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain.">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li><li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. 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L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo neonatale iniezione virale qui presentata fornisce un modo semplice e rapido per generare mosaici in vivo per lo studio dello sviluppo cerebrale postnatale. Il metodo si avvale di alleli floxed che sono attualmente disponibili e quelle che vengono effettuate tramite il gene targeting High Throughput progetto 6. Rispetto all&#39;uso di espressione transgenica di Cre, questo metodo fornisce un modo rapido per testare la funzione del gene in vari tipi di cellule, come topi portatori degli alle...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> rAAV8-Cre, GFP-,-DsRed, </td><td> Vector Biolabs </td><td> # 7060, # 7061, ordine personalizzato </td><td> http://www.vectorbiolabs.com </td></tr><tr><td> Harvard pompa 11 Plus </td><td> Harvard Apparatus </td><td> # 702208 </td><td> (No porta a pedale) </td></tr><tr><td> Pigmento epitelio della retina Kit iniezione </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> RPE-KIT </td><td> Contiene connettivo tubi, aghi da iniezione (36G), e porta aghi </td></tr><tr><td> NanoFil siringa, 100μl </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> NANOFIL-100 </td><td> Include ago riutilizzabili carico </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14040-117 </td><td></td></tr><tr><td> GFP anticorpi </td><td> Aves </td><td> GFP-1020 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi DsRed </td><td> Clontech </td><td> 632496 </td><td></td></tr><tr><td> Riscaldamento Block </td><td> VWR </td><td> 97042-610 </td><td></td></tr><tr><td> ROSA26R del mouse </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 003309 </td><td></td></tr></tbody></table>

mosaic analysis of gene function in postnatal mouse brain development by using virus-based cre recombination

Normali funzioni cerebrali si basa non solo sullo sviluppo embrionale in cui i principali percorsi neuronali sono stabiliti, ma anche sullo sviluppo postnatale, quando i circuiti neurali sono maturato e raffinato. Misregulation in questa fase può portare a disturbi neurologici e psichiatrici come l&#39;autismo e la schizofrenia 1,2. Molti geni sono stati studiati nel cervello prenatale e ha trovato cruciali per molti processi di sviluppo 3-5. Tuttavia, la loro funzione nel cervello postnatale è in gran parte sconosciuto, anche perché la loro cancellazione in topi spesso conduce a mortalità durante lo sviluppo neonatale, e in parte perché la loro richiesta nel primo sviluppo ostacola l&#39;analisi post-natale. Per superare questi ostacoli, floxed alleli di questi geni sono attualmente generati nei topi 6. Se combinato con alleli transgenici che esprimono Cre ricombinasi in tipi cellulari specifici, la cancellazione condizionale può essere raggiunto per studiare la funzione dei geni nel cervello postnatale. Tuttavia, questo metodo richiede alleli aggiuntivi e tempi supplementari (3-6 mesi) per generare i topi con genotipi del caso, limitando così l&#39;espansione della analisi genetica di larga scala nel cervello di topo. Qui mostriamo un approccio complementare che utilizza virale Cre-espresso per studiare questi alleli floxed rapidamente e sistematicamente nello sviluppo cerebrale postnatale. Iniettando ricombinante virus adeno-associati (rAAVs) 7,8 codifica Cre nel cervello neonatale, siamo in grado di eliminare il gene di interesse in diverse regioni del cervello. Controllando il titolo virale e coexpressing un marcatore fluorescente proteina, siamo in grado di raggiungere contemporaneamente l&#39;inattivazione del gene mosaico e sparse etichettatura neuronale. Questo metodo evita l&#39;esigenza di molti geni nello sviluppo iniziale, e ci permette di studiare la loro funzione autonoma delle cellule in molti processi critici nello sviluppo cerebrale postnatale, compresa la crescita assonale e dendritiche, ramificazione, e rivestimenti, come pure la formazione di sinapsi e raffinatezza. Questo metodo è stato utilizzato con successo nel nostro laboratorio proprio (risultati non pubblicati) e altri 8,9, e può essere esteso ad altri virus, come il lentivirus 9, così come l&#39;espressione di shRNA o dominante proteine ​​attive 10. Inoltre, combinando questa tecnica con elettrofisiologia così come recentemente sviluppato strumenti di imaging ottico 11, questo metodo fornisce una nuova strategia per studiare come i percorsi genetici influenzano lo sviluppo neurale del circuito e la funzione di topi e ratti.

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Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Un<em&gt; In vivo</emMetodo&gt; per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L&#39;inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  Keck School of Medicine, University of Southern California. Un In vivo per testare la funzione del gene nel cervello postnatale è descritto. AAVs ricombinanti che esprimono Cre e / o di una proteina fluorescente vengono iniettate nel cervello di topo neonatale. L'inattivazione del gene mosaico e rada etichettatura neuronali siano raggiunti, consentono una rapida analisi della funzione del gene nei processi critici per lo sviluppo del circuito neurale.

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Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Ricerca

Neuroscienze

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Studying Brain Function in Children Using Magnetoencephalography

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the human brain. MEG is quiet and less likely to induce claustrophobia compared with magnetic resonance imaging (MRI). It is therefore a promising tool for investigating brain function in young children. However, analysis of MEG data from pediatric populations is often complicated by head movement artefacts which arise as a consequence of the requirement for a spatially-fixed sensor array that is not affixed to the child's head. Minimizing head movements during MEG sessions can be particularly challenging as young children are often unable to remain still during experimental tasks. The protocol presented here aims to reduce head movement artefacts during pediatric MEG scanning. Prior to visiting the MEG laboratory, families are provided with resources that explain the MEG system and the experimental procedures in simple, accessible language. An MEG familiarization session is conducted during which children are acquainted with both the researchers and the MEG procedures. They are then trained to keep their head still whilst lying inside an MEG simulator. To help children feel at ease in the novel MEG environment, all of the procedures are explained through the narrative of a space mission. To minimize head movement due to restlessness, children are trained and assessed using fun and engaging experimental paradigms. In addition, children's residual head movement artefacts are compensated for during the data acquisition session using a real-time head movement tracking system. Implementing these child-friendly procedures is important for improving data quality, minimizing participant attrition rates in longitudinal studies, and ensuring that families have a positive research experience.

This article introduces a child-friendly research protocol designed to improve data quality by reducing head movement during pediatric magnetoencephalography (MEG). We familiarize families with the MEG environment, train children to remain still using an MEG simulator, and correct for residual head movement artefacts using a real-time head movement detection system.

Studiare la funzione del cervello in bambini che usando magnetoencefalografia

Magnetoencephalography (MEG) is a non-invasive neuroimaging technique which directly measures magnetic fields produced by the electrical activity of the ...

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), including gene therapy applications. AAV vectors are non-replicating, able to infect both dividing and non-dividing cells&#160;and provide long-term transgene expression. Importantly, some serotypes, such as the newly described PHP.B, can cross the blood-brain-barrier (BBB) in animal models, following systemic delivery. AAV vectors can be efficiently produced in the laboratory. However, robust and reproducible protocols are required to obtain AAV vectors with sufficient purity levels and titer values high enough for in vivo applications. This protocol describes an efficient and reproducible strategy for AAV vector production, based on an iodixanol gradient purification strategy. The iodixanol purification method is suitable for obtaining batches of high-titer AAV vectors of high purity, when compared to other purification methods. Furthermore, the protocol is generally faster than other methods currently described. In addition, a quantitative polymerase chain reaction (qPCR)-based strategy is described for a fast and accurate determination of the vector titer, as well as a silver staining method to determine the purity of the vector batch. Finally, representative results of gene delivery to the CNS, following systemic administration of AAV-PHP.B, are presented. Such results should be possible in all labs using the protocols described in this article.

Here, we describe an efficient and reproducible strategy to produce, titer, and quality-control batches of adeno-associated virus vectors. It allows the user to obtain a vector preparation with high-titer&#160;(&#8805;1 x 1013 vector genomes/mL) and a high purity, ready for in vitro or in vivo use.

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent development of thin, flexible ECoG electrodes has enabled conduction of stable recordings of large-scale cortical activity. We have developed a whole-cortical ECoG array for the common marmoset. The array continuously covers almost the entire lateral surface of cortical hemisphere, from the occipital pole to the temporal and frontal poles, and it captures whole-cortical neural activity in one shot. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain. Marmosets have two advantages regarding ECoG recordings, one being the homologous organization of anatomical structures in humans and macaques, including frontal, parietal, and temporal complexes. The other advantage is that the marmoset brain is lissencephalic and contains a large number of complexes, which are more difficult to access in macaques with ECoG, that are exposed to the brain surface.These features allow direct access to most cortical areas beneath the surface of the brain. This system provides an opportunity to investigate global cortical information processing with high resolutions at a sub-millisecond order in time and millimeter order in space.

We have developed a whole-cortical electrocorticographic array for the common marmoset that continuously covers almost the entire lateral surface of cortex, from the occipital pole to the temporal and frontal poles. This protocol describes a chronic implantation procedure of the array in the epidural space of the marmoset brain.

Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...