L'etichettatura e la visualizzazione di singole cellule di pergole dendritiche o assonali sono necessarie per studiare la morfogenesi neuronale. Etichettando i pergolati in via di sviluppo in modo minimamente invasivo, il tessuto retinico rimane sano e adatto per l'imaging dal vivo confocale prolungato. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di visualizzare singoli pergole con proteine fluorescenti multicolore entro quattro giorni dall'iniezione.
Ciò rende possibile lo studio delle morfologie del pergolato neonatale. Questo protocollo di imaging e analisi di iniezione può essere utilizzato per studiare le morfologie neuronali in tutto il sistema nervoso centrale. La selezione Cre appropriata e la posizione di iniezione devono essere determinate per indirizzare la popolazione cellulare di interesse.
Iniziare selezionando una linea di topo Cre per etichettare le popolazioni di cellule retiniche di interesse. Ottenere il virus AAV ricombinasi-dipendente che codifica per proteine fluorescenti. Per un'etichettatura ottimale dei processi fini, selezionare vettori che esprimono proteine fluorescenti modificate che prendono di mira la membrana plasmatica.
Per l'aliquota AAV su ghiaccio, e preparare una diluizione da uno a quattro AAV usando soluzione salina sterile o PBS. Per visualizzare le iniezioni, colorare la soluzione di blu aggiungendo circa un microlitro di soluzione colorante Fast Green FCF allo 0,02% per ogni 15 microlitri di diluizione AAV. Sterilizzare l'area di iniezione con etanolo al 70%.
Riempire la micropipetta con la diluizione AAV utilizzando una microsiringa. Sotto uno stereomicroscopio, rompere la punta della micropipetta con un ago calibro 30 per aprire il sigillo alla punta. Dopo aver anestetizzato i topi neonatali, tatuare le zampe con inchiostro per tatuaggi usando un ago calibro 30 per identificare gli animali.
Raccogli ritagli di coda per l'isolamento e la genotipizzazione del DNA. Tamponare la pelle sovrastante gli occhi con il 70% di etanolo. Utilizzare un ago da 30 gauge per aprire la palpebra fusa mentre si applica una leggera pressione con le dita per aprire l'occhio.
Fai un piccolo foro attraverso la cornea alla giunzione della sclera corneale. Inserire la micropipetta di vetro nel foro e premere il pedale del micro iniettore due o quattro volte per iniettare l'AAV nello spazio intravitreale. Rimuovere lentamente la micropipetta e confermare l'iniezione di AAV visualizzando il colorante blu nella pupilla.
Dopo aver preparato l'aCSF retinico come descritto nel manoscritto di testo, ossigenare l'aCSF retinico gorgogliando con carbogeno per un minimo di 15 minuti, quindi regolare il pH a 7,4. Incorporare una capsula di Petri di 60 millimetri di diametro in un vassoio del ghiaccio e riempirla con aCSF retinico ossigenato. Posizionare la capsula di Petri riempita sotto uno stereomicroscopio.
Quindi, tagliare il lembo palpebrale del topo eutanasizzato per esporre l'occhio. Utilizzare pinze smussate per enucleare gli occhi e trasferirli nell'aCSF retinico freddo posto sotto lo stereomicroscopio. Sotto lo stereomicroscopio, stabilizzare l'occhio stringendo il nervo ottico usando la pinza numero cinque di Dumont e praticare un foro al centro della cornea con un ago di calibro 30, quindi inserire una punta delle micro forbici nel foro per fare un'incisione dal foro alla fine della cornea.
Ripetete per creare quattro fette nelle direzioni cardinali, creando quattro lembi. Afferrare e tirare i due lembi adiacenti, staccando delicatamente la sclera dalla retina per tutti i lembi della cornea. Quindi rimuovere la lente dalla coppa retinica usando la pinza.
Infine, utilizzare micro forbici per eseguire quattro incisioni radiali dal bordo della retina verso il nervo ottico, creando quattro petali uguali. Se si utilizzano filtri a membrana MCE grigi di grande diametro per il montaggio, tagliare il disco in quadranti di circa un centimetro di diametro, quindi posizionare il disco MCE al centro di una carta da filtro bianca più grande. Usando due pennelli tre per zero, capovolgere una tazza retinica su un pennello con la cellula gangliare retinica rivolta verso il basso.
Sollevare delicatamente la retina dall'aCSF, assicurandosi che la tensione dell'acqua non strappi la retina. Mentre si tiene ancora il pennello con la retina, spostare la capsula di Petri contenente aCSF e posizionare la carta da filtro bianca con la membrana MCE sotto lo stereoscopio. Utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare una goccia di aCSF al centro della carta da filtro MCE.
Far fluttuare la retina nella goccia aCSF creata dalla tensione superficiale e dalla membrana MCE carica. Utilizzare pennelli per posizionare la retina all'interno della goccia con la cellula gangliare retinica rivolta verso l'alto, quindi aprire i quattro petali. Una volta posizionato, creare un ponte d'acqua tra il pennello e la carta da filtro bianca per rompere la tensione superficiale della goccia.
Assemblare la camera di incubazione per immagini dal vivo e riempirla con aCSF ossigenato. Accendere la pompa e il regolatore di temperatura, assicurandosi che la temperatura non superi i 34 gradi Celsius. Può richiedere fino a un'ora per stabilizzare la temperatura della camera.
Si consiglia di impostare la camera di incubazione prima di iniziare la dissezione retinica. La temperatura stabile della camera aiuta a ridurre la deriva del campione. Per trasferire il tumulo piatto retinico nella camera di perfusione, arrestare la pompa e rimuovere l'aCSF che si trova nella camera.
Quindi posizionare il disco MCE con il supporto piatto retinico nella camera di incubazione. Pre-bagnare un peso del campione per rompere la tensione superficiale, quindi posizionarlo sul supporto piatto assicurando che il peso del campione sia posizionato sulla carta MCE per ridurre la deriva del campione. Riempire la camera con l'aCSF riscaldato e far circolare l'aCSF a circa un millilitro al minuto.
Posizionare il nasello con l'obiettivo di immersione in acqua 25 volte nella camera di imaging. Scherma le cellule di interesse etichettate utilizzando la luce epifluorescente e regola il volume di imaging per catturare le caratteristiche dendritiche di interesse. Utilizzando una tabella di ricerca che identifica sia i pixel sovrasaturi che quelli sottosaturi, regolare la potenza del laser in modo che nessun pixel sia sovrasaturato.
Acquisisci il volume di imaging 3D e ripeti l'acquisizione alla frequenza fotogrammi desiderata. Il volume di imaging può essere regolato tra ogni punto temporale per compensare la deriva del campione. Importare la serie di immagini, dividendo le immagini per tempo.
Salva tutti i punti temporali manualmente o eseguendo un plug-in macro. Creare una funzione teorica di diffusione del punto utilizzando il plug-in ImageJ facendo clic su Deffrazione PSF 3D, l'apertura numerica dell'obiettivo, la lunghezza d'onda di emissione del fluoroforo, la dimensione dei pixel e la spaziatura Z sono necessarie per creare una PSF accurata. Selezionare plug-in, macro ed eseguire per eseguire la deconvoluzione iterativa parallela batch per tutti i punti temporali utilizzando la macro fornita.
Importate tutti i punti temporali deconvoluti come stack facendo clic su file, importa, quindi su sequenza immagine. Convertire lo stack in un hyperstack facendo clic su image, hyperstacks, quindi stacks in hyperstack. Aggiungi il numero di Z-slice e intervalli di tempo, quindi correggi la deriva 3D utilizzando il plug-in 3D drift corretto.
Salva l'hyperstack corretto con deriva 3D e riconverti l'immagine in uno stack normale facendo clic su image, hyperstacks, hyperstack to stack, quindi dividi i punti temporali facendo clic su image, stacks, tools e stacks splitter. Per il numero di sottostack da dividere, immettere il numero di punti temporali. Utilizzare l'elaborazione batch per creare una proiezione massima per tutti i punti temporali.
Importare la sequenza di immagini time lapse facendo clic su file, importa, quindi sequenza di immagini. E utilizzare gli strumenti ImageJ convenzionali per l'analisi desiderata di video bidimensionali deconvoluti e post-elaborati, Un video 3D ad alta risoluzione dello sviluppo di dendriti di cellule starburst è stato acquisito, deconvolto e corretto per la deriva 3D. Sono state prodotte proiezioni massime del piano Z per realizzare video 2D per l'analisi, mostrando un'area di raffinamento dendritico e un'area di escrescenza dendritica.
La deconvoluzione 3D di ogni punto temporale ha aumentato la risoluzione delle proiezioni di filopodi fini di una singola cellula amacrina starburst P6 prima e dopo la deconvoluzione con ImageJ. Periodi prolungati di infezione da AAV non portano necessariamente ad un aumento del segnale fluorescente, come dimostrato da livelli simili di espressione proteica a cinque e 11 giorni dopo l'iniezione. Ridurre la deriva del campione durante l'imaging è importante.
La deriva è ridotta al minimo mantenendo una temperatura di imaging costante e posizionando in modo appropriato il peso sul campione. Se si verifica una deriva, l'acquisizione manuale delle serie temporali consente di regolare il volume dell'immagine tra i fotogrammi. Ciò garantisce che le caratteristiche di interesse rimangano nel frame.
Questo protocollo produce video 3D ad alta risoluzione, deconvoluti e corretti alla deriva di neuriti in via di sviluppo. Tali video portano a una migliore comprensione del cablaggio dei neuroni e sono necessari per far progredire i metodi di analisi computazionale della morfogenesi 3D. Sono necessari migliori software di tracciamento e tracciamento automatici per ottenere un'analisi ad alto rendimento dello sviluppo di neuriti.
