1. Preparazione <ol><li> Preparare xylazina-ketamina soluzione (La ketamina è una sostanza controllata. Record dettagliato deve essere mantenuto e soluzioni custoditi in cassaforte, la posizione chiusa). </li><li> Pulire e sterilizzare attrezzature. </li><li> Preparare zona chirurgia strofinando con agente asettico e poi coprire con carta assorbente sterile, e impostare il micromanipolatore. </li></ol> 2. Preparazione di cellule per il trapianto <ol><li> Le cellule devono essere risospeso ad una concentrazione di 100.000 cellule / l É e, anche se solo 250.000 cellule vengono trapiantate per il mouse, un eccesso di cellule è necessaria per scopi di carico siringa (preparare almeno 300.000 cellule per topo riceve cellule). </li><li> Lavare le cellule da trapiantare 3 volte in HBSS in un flaconcino da 50 ml. Contare le celle prima della centrifuga finale. </li><li> Dopo la centrifuga finale verso il basso, e lasciare decantare HBSS flaconcino in posizione capovolta per evitare che le goccioline di raggiungere il pellet. </li><li> Pareti interne a secco con un UV-irradiato, Kimwipe sterile. Non lasciare che il pellet ad asciugare. </li><li> Tenendo il tubo in posizione verticale, molto lentamente e delicatamente risospendere le cellule in metà del volume finale desiderato HBSS. </li><li> Misurare il volume totale pipettando la maggioranza della sospensione in un puntale e quindi regolando la ghiera sulla pipetter fino a quando la sospensione intero la punta della pipetta. Questo vi dirà quanto più HBSS è necessario per la concentrazione desiderata. </li><li> Portare il volume al livello desiderato con l&#39;aggiunta di HBSS. </li><li> Mettere di nuovo sul ghiaccio. Verificare la vitalità delle cellule, se essi devono essere in ghiaccio per più di 2 ore. </li></ol> 3. Preparazione di topi per la chirurgia e trapianti <ol><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) in circa 100 dosi microlitri o un equivalente anestetico. L&#39;intera procedura di preparazione chirurgica di sutura richiederà 30-40 minuti. </li><li> (Opzionale: applicare numerate, nastri colorati per la coda di ogni mouse per garantire l&#39;identificazione) </li><li> Radere l&#39;area dorsale del mouse dalla parte bassa della schiena al collo, ed estendendo bilaterali 2 centimetri dalla linea mediana, con il tagliaunghie elettrici. I capelli devono essere tagliati il ​​più vicino possibile (può essere necessario andare oltre l&#39;area più volte). </li><li> Per rimuovere i capelli rimanenti, applicare un sottile strato di crema depilazione (Nair) con una garza punta applicatore. </li><li> Dopo 1-2 minuti, pulire Nair con garza bagnate leggermente con acqua e sapone. L&#39;area preparata deve essere pulita la pelle nuda, senza pezzi randagi di capelli che potrebbero entrare nella ferita nel corso della successiva procedura chirurgica. Sterilizzare l&#39;area preparato con soluzione di ioduro. </li></ol> 4. Laminectomia <ol><li> Cambiano frequentemente e / o sterilizzare i guanti durante l&#39;intera procedura. Posizionare il lato dorsale del mouse con la testa rivolta a sinistra (se siete di mano destra). Drappo animali per garantire la sterilità e che solo l&#39;area rasata è esposto. Effettuare una incisione verticale (~ 1,3 centimetri) sopra il luogo laminecomy si estende da circa vertebre toraciche T8 a T12. </li><li> Con la pinza Graefe tenuto nella mano sinistra, fissare saldamente la colonna vertebrale a T9 (Figura 1A) e sollevare il mouse fino a esagerare la curvatura della spina dorsale. </li><li> Utilizzare il bisturi per segnare la giunzione tra T10 e T11, lo spazio tra le due sporgenze spinose. Ulteriori esporre il bivio con attenzione rottamazione strato di muscolo, allontanandosi per esporre l&#39;osso (vedi Figura 1B, C). </li><li> Utilizzare le forbici per ulteriori muscolare chiara distanza dalla lamina ed intorno al peduncolo, con tagli di piccole dimensioni. Questo aprirà un piccolo spazio tra le vertebre. Lentamente e delicatamente inserire una lama delle forbici in questo divario e tagliare il peduncolo. Assicurarsi che la curvatura delle forbici è sempre posizionato lateralmente, lontano dal cordone ombelicale. Ripetere dall&#39;altra parte. (Vedi Figura 1D, E) </li><li> Sollevare la lamina di esporre il cavo e con attenzione lo snip off. Assicurarsi di non lasciare frammenti ossei liberi o frastagliate dietro. (Vedi Figura 1F) </li><li> Prima dell&#39;iniezione, pulire il sangue via con tamponi di cotone sterile. </li></ol> 5. L&#39;iniezione di cellule <ol><li> Fissare l&#39;ago con l&#39;ago dado alla siringa Hamilton e pulirli da vampate di calore più volte con acqua, poi etanolo al 70% e, infine, HBSS. Inserire pistone dopo ogni riempire con acqua, etanolo al 70%, o HBSS. </li><li> Preparare la siringa Hamilton per il caricamento delle cellule, rimuovendo il pistone e allentando il dado di ago e tirando l&#39;ago dalla siringa per evitare contropressione. Garantire che la movimentazione accurata dell&#39;ago e il dado è fatto con i guanti sterili. </li><li> Carico 15μl di cellule in puntale e premere la punta saldamente l&#39;estremità posteriore della siringa per caricare le cellule nella siringa. </li><li> Inserire lo stantuffo circa 5mm e poi serrare il dado ago. </li><li> Premere lo stantuffo ONUfinchè alcune delle sospensione cellulare viene visto uscire l&#39;ago. </li><li> Assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa e laici la siringa in posizione orizzontale per evitare che le cellule di fare un gradiente di gravità. </li><li> Prendete in mano il mouse laminectomized dal muscolo spinale dorsale che collega il spine di T8 e T9 (Figura 2B, C). </li><li> Bloccare il hemostat a sinistra (verticale) micromanipolatore braccio in modo che le zampe anteriori del mouse sono nell&#39;aria e le sue zampe posteriori leggermente toccando una piattaforma di asciugamani di carta sterile come in Figure 2A e 2B. </li><li> Collegare la siringa al braccio destro micromanipolatore (ad un angolo di 70 °) e far scorrere la siringa nella posizione più bassa possibile, prima di serraggio. </li><li> Stabilizzare il mouse da appuntare la coda contro i tovaglioli di carta e abbassare lentamente la siringa (Figura 2B). </li><li> Abbassare l&#39;ago verso il cavo e inserire l&#39;ago nel 1 millimetro l&#39;emisfero opposto attraverso la linea mediana dorsale (Figura 2C). La punta dell&#39;ago deve essere nella materia grigia nei pressi del canale centrale. </li><li> Iniettare lentamente 2.5μl delle cellule. Iniettare ad un tasso di 1ml / 5 secondi. Dopo aver iniettato le cellule, attendere 10 secondi e ritrarre l&#39;ago di un decimo di giro alla volta ogni 10 secondi fino a quando l&#39;ago è fuori del cavo. Prestare attenzione alla possibile efflusso di sospensione cellulare. </li><li> Rapidamente ritrarre la siringa e staccarlo dal braccio micromanipolatore. Stendere la siringa in posizione orizzontale. </li><li> Rilasciare il mouse e trasferimento a tavola sutura. </li><li> Ripetere i passaggi 5,7-5,14 per ogni mouse fino a quando la siringa è vuota. Sterilizzare gli strumenti (nello sterilizzatore) e l&#39;ago (strofinando con etanolo) tra gli animali. Eliminare le cellule e ricaricare se aggregazione è visibile. </li><li> Pulire la siringa come nel passaggio tra 5,1 carichi. </li></ol> 6. Suture e post-op cura <ol><li> Sutura l&#39;incisione. Aghi per suture è inserito nella fascia superficiale su entrambi i lati dell&#39;incisione. Il filo è teso attraverso, tirando fascia superficiale insieme (Figura 3A), coprendo così il midollo spinale esposta nel sito di lamina rimosso. Non sutura il muscolo cutaneo attaccate alla pelle o il muscolo scheletrico della schiena. Tirare il filo intero attraverso, lasciando circa 1 / 2 &quot;. Utilizzando la porta aghi, tre nodi si formano e filo è tagliato più vicino possibile al nodo più possibile. </li><li> Chiudere l&#39;incisione mediante l&#39;applicazione di 2-3 punti (a seconda delle dimensioni di incisione) per la pelle (Figura 3B). Estrarre delicatamente la pelle di distanza dal mouse per evitare di pinzatura il muscolo sottostante. </li><li> Utilizzando un 26G3 / 8 ago iniettare 0,5 ml Ringer lattato sottocute nella parte bassa della schiena dalla incisione. </li><li> Posto del mouse indietro nella sua gabbia. Per assicurarsi che sia in grado di respirare confortevolmente mentre sotto anestesia, il mouse deve essere posizionato su un lato nella gabbia, evitando il contatto tra il sito chirurgico e biancheria da letto gabbia. Le gabbie dovrebbero essere immessi sul pad riscaldamento. </li><li> I topi sono monitorati dopo l&#39;anestesia svanisce per assicurare il sanguinamento, suture rimangono chiuse, e che i topi tornare al pre-intervento mobilità. </li><li> Trattare i topi una volta con la buprenorfina analgesico (0,05-0,1 mg / kg) dopo l&#39;intervento. </li><li> Garantire topi compromessa hanno sufficiente accesso al cibo e all&#39;acqua: bottiglie d&#39;acqua sono dotati di beccucci estese 3,5 pollici e topi che non sono in grado di camminare sono l&#39;acqua a mano nutriti e / o ad alto contenuto calorico supplemento dietetico (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Risultati desiderati saranno riconoscibili dalla mancanza di efflusso di sospensione cellulare durante l&#39;iniezione e dalla comparsa intatta del midollo spinale dopo la procedura. A tal fine, è fondamentale avere illuminazione brillante e diretta sul dorso del mouse durante la laminectomia e durante l&#39;iniezione. Un&#39;illuminazione ottimale è facilitato dalla fibra ottica di illuminazione (Figura 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 - laminectomia (A) Una volta vertebra T9 è solidamente tenuto con la pinza Graefe, (B, C) ​​punteggio della colonna vertebrale con il bisturi tra le T10 e T11 per facilitare l&#39;ingresso delle forbici micro.. (D) Far scorrere delicatamente le forbici micro attraverso lo spazio tra T10 e T11 (frecce e inserto, E) e tagliare i peduncoli su ogni lato (trattini, E) per liberare la lamina dorsale. (F) Capovolgere la lamina fino rostralmente e tagliarlo fuori. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Iniezione di NSC. (A) L&#39;impostazione generale del micromanipolatore con il hemostat tenendo premuto il mouse collegato al braccio sinistro e la siringa Hamilton sul ​​braccio destro con un angolo di 70. (B) Il hemostat tenere il muscolo spinale dorsale collegare le spine di T8 e T9. (C) L&#39;ago viene abbassato attraverso tlui linea mediana e nella materia grigia sull&#39;emisfero opposto, in prossimità del canale centrale. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Suture e la chiusura della ferita. (A) Le suture vengono applicate alla fascia superficiale su entrambi i lati dell&#39;incisione. (B) L&#39;incisione viene chiusa con 2-3 punti in base alle esigenze (una graffetta mostrato una ferita che necessitano di 3).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un trapianto ben eseguito dipenderà principalmente sulla laminectomia attenta e l&#39;iniezione delle cellule. L&#39;insidia principale per evitare nel corso di una laminectomia è il danneggiamento del midollo spinale. Questo può verificarsi durante la procedura stessa o da danni causati da frammenti ossei taglienti lasciati alle spalle dopo la procedura. Per evitare questi, in modo che le punte delle forbici curve micro sono sempre rivolta verso il cavo e esaminare attentamente la colonna vertebrale laminectomized per assicurare che tutti i frammenti ossei vengono cancellate e che i bordi della struttura rimanente vertebrali non hanno apertamente sporgenti o frastagliati. Come accennato in precedenza, la rilevazione di efflusso sarà possibile se la luce brilla e direttamente sul midollo spinale esposti durante l&#39;iniezione. Efflusso è più probabile che accada con 30 aghi calibro (contro 33 gauge) e se l&#39;iniezione viene fatta troppo rapidamente. Anche se questo protocollo ci ha dato buoni risultati, altri hanno riferito di attesa più lunghi periodi (fino a 5 minuti) prima di ritrarre l&#39;iniezione ago seguenti 8,9. Inoltre, aghi di calibro più piccolo sono preferibili, ma abbiamo osservato che alcune cellule sono troppo facilmente lisati quando passa attraverso 33 aghi di calibro. Per massimizzare l&#39;efficienza, un team di trapianto equipaggi delle quattro stazioni differenti (mouse preparazione, laminectomia, iniezione, e suture) è auspicabile. Inoltre, i tempi per ogni procedura deve essere ottimizzato per minimizzare il tempo le cellule sono in attesa su ghiaccio. Per esempio, abbiamo i nostri topi trapiantati in gruppi di quattro (il numero di dosi in ogni carico della siringa), la persona iniettando le cellule inizierà a caricare la siringa dopo il mouse terzo è stato laminectomized e la persona che prepara i topi dovrebbero anestetizzare le seguenti gruppo dopo il secondo mouse del gruppo precedente è stato laminectomized. In questo modo, siamo in grado di trapiantare cellule (o un supporto di controllo) in 40 topi in circa 3 ore, anche se ogni mouse avrà circa 30-40 min. Terapie di sostituzione cellulare per il trattamento di alcuni disturbi del SNC sono attualmente in sperimentazione clinica 10. Non vi è alcun sostituto per modelli in vivo di NSC trapianto e il nostro protocollo per l&#39;attecchimento delle NSCs nel midollo spinale di topi affetti da demielinizzazione virale indotta facilita l&#39;utilizzo di un importante modello di sclerosi multipla e può essere facilmente adattato ad altri modelli.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Phoenix Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina cloridrato </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td>  10 microlitri Hamilton siringa w / rimovibile ago </td><td> Hamilton Azienda </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Aghi, 30 G o 33 G, ½ pollici, 30 ° smusso </td><td> Hamilton Azienda </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Prova la vitalità delle cellule dopo il passaggio attraverso gli aghi per identificare il miglior indicatore da utilizzare </td></tr><tr><td> Micro forbici </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Piccolo Graefe Pinza </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 1772 Holder universale </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 1773 Electrode Holder </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 902 stereotassica di piccoli animali </td><td></td></tr><tr><td> Stereotassica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modello 960 vettore elettrodo sinistro </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer lattato </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Scienza multa </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Emostatica </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi, dimensioni 10,11 </td><td> Pescatore </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> Dimensione 5-0, 3 / 8 &quot;cerchio, ago 19 mm, filo intrecciato 45 centimetri </td></tr><tr><td> Reflex 7 ferita applicatore Clip </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7 millimetri clip ferita Reflex </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar ago titolare </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Topi infettati con il ceppo JHM neurotropica del virus dell&#39;epatite topo (MHV) sviluppare gli esiti patologici e clinici simili a pazienti con la malattia demielinizzante sclerosi multipla (SM). Abbiamo dimostrato che il trapianto di NSC nel midollo spinale di topi malati risultati in un miglioramento significativo in entrambi i rimielinizzazione e nel risultato clinico. Terapie di sostituzione cellulare per la cura di malattie croniche neurologiche sono ormai una realtà e in modelli in vivo sono di vitale importanza per comprendere le interazioni tra le cellule trapiantate e tessuti microambiente ospitante. Questa presentazione fornisce un metodo adatto per trapiantare le cellule nel midollo spinale di topi infettati JHMV. In breve, mettiamo a disposizione una procedura per i) preparazione di NSCs prima del trapianto, ii) pre-operatorio di topi, iii) l&#39;esposizione del midollo spinale tramite laminectomia, iv) l&#39;iniezione stereotassica di NSCs, e iv) assistenza post-operatoria .

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Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Il trapianto di cellule staminali neurali del mouse (NSC) nel midollo spinale di topi con demielinizzazione stabilito è dettagliata. La preparazione del NSC, la laminectomia della vertebra toracica 9 (T9), e il trapianto di NSC si delinea con l&#39;assistenza pre-e post-operatoria dei topi.

Il trapianto chirurgico di cellule staminali neurali del mouse nel midollo spinale di topi infettati con virus dell&#39;epatite neurotropi mouse

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Views.  University of California, Irvine. Il trapianto di cellule staminali neurali del mouse (NSC) nel midollo spinale di topi con demielinizzazione stabilito è dettagliata. La preparazione del NSC, la laminectomia della vertebra toracica 9 (T9), e il trapianto di NSC si delinea con l'assistenza pre-e post-operatoria dei topi.

Video: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

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Neuroscienze

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

Homochronic trapianto di precursori Interneurone in cervelli di topo postnatale precoce

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

Trapianto di progenitori interneuroni corticali chemiogeneticamente ingegnerizzati nei primi cervelli dei topi postnatali

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

Il rilevamento di 5-Hydroxytethylcytosine in cellule staminali neurali e cervelli di topi

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...