Il protocollo qui descritto consente la generazione di librerie di RNA a lunghezza intera mutagenizzate in modo casuale di genomi virali a RNA positivo a singolo filamento fino a 10 kilobyte di lunghezza e la selezione di fenotipi di interesse nelle condizioni sperimentali desiderate. Questa tecnica è in grado di creare librerie di RNA virale a lunghezza intera con diversi livelli di diversità genetica in breve tempo utilizzando un approccio senza clonazione. La tecnica utilizza reagenti poco costosi e ampiamente disponibili per la sintesi di librerie.
A dimostrare la procedura sarà Shaheen Khan, uno studente di dottorato della Sezione di Virologia, Dipartimento di Scienze della Vita, Shiv Nadar University. Per iniziare, eseguire l'ep-PCR preparando la miscela master per quattro serie di esperimenti con primer diretti e inversi insieme ai componenti di reazione senza il modello pJFH1, come descritto nel manoscritto del testo. Aliquotare la miscela master in quattro tubi.
Aggiungere 100 nanogrammi, 50 nanogrammi, 25 nanogrammi e 10 nanogrammi del modello nelle singole provette e regolare il volume totale della reazione a 50 microlitri. Applicare le condizioni cicliche per amplificare un frammento di coppia di 97 36 basi. Stimare il prodotto ep-PCR amplificato caricando cinque microlitri dei prodotti PCR e confrontandolo con quantità note di una scala di DNA kilobase eseguendo un'elettroforesi su gel di agarosio a base di TAE allo 0,8%.
Purificare il prodotto utilizzando un kit di purificazione a colonna. Stimare la concentrazione del prodotto purificato misurando l'assorbanza a 260 nanometri. Concentrare sottovuoto il prodotto ep-PCR per ottenere una concentrazione del prodotto uguale o superiore a 100 nanogrammi per microlitro.
Impostare una reazione di sintesi dell'RNA in vitro e posizionarla a 37 gradi Celsius per l'incubazione. Quindi purificare il prodotto sintetizzato utilizzando un kit di purificazione a colonna. Impostare una reazione di sintesi di cDNA da 20 microlitri aggiungendo circa un microgrammo di RNA virale, cinque primer inversi micromolari e 200 unità di trascrittasi inversa, secondo le raccomandazioni del produttore.
Usando il cDNA, preparare una miscela di reazione come descritto nel manoscritto del testo ed eseguire un ciclo di amplificazione. Eseguire il prodotto su un gel di agarosio a base di TAE allo 0,8% per confermare le dimensioni del prodotto di 25 paia di basi 71, quindi purificare il prodotto utilizzando un kit di purificazione a colonna come dimostrato in precedenza. Eluire in 40 microlitri di acqua sterile.
Per aggiungere una sporgenza di tre prime A, aggiungere 0,5 micromolari DATP e un'unità di Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà e incubare l'intero prodotto PCR a 70 gradi Celsius per 30 minuti, insieme a 1X tampone PCR e 1,5 millimolari di cloruro di magnesio. Quindi purificare la miscela utilizzando un kit di purificazione a colonna. Impostare la reazione di legatura e incubarla a temperatura ambiente per tre ore.
Quindi aggiungere 100 microlitri di Escherichia coli DH5-Alpha al DNA legato e provocare uno shock termico delle cellule a 42 gradi Celsius per 35 secondi. Aggiungere un millilitro di terreno LB alla sospensione cellulare e incubare con agitazione delicata per un'ora a 37 gradi Celsius. Centrifuga a 13.800 RCF.
Scartare il surnatante e risospendere in 200 microlitri di terreno LB fresco. Piastra 100 microlitri di cellule DH5-Alfa trasformate di E.coli su una piastra LB contenente 50 microgrammi per millilitro di ampicillina e incubare a 37 gradi Celsius per 16 ore. Prepara mini preparazioni da 25 a 30 colonie in cinque millilitri di terreno LB contenente 50 microgrammi per millilitro di ampicillina e coltiva durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, estrarre i plasmidi con un kit commerciale ed eseguire la digestione degli enzimi di restrizione in un volume di 10 microlitri con 200 nanogrammi dei plasmidi isolati, due unità di EcoR1 e un tampone di restrizione 1X per tutte le colonie. Dopo aver incubato le miscele di digestione a 37 gradi Celsius per tre ore, caricare i prodotti su gel di agarosio a base di TAE allo 0,8% per confermare l'inserimento del DNA plasmidico. Eseguire il sequenziamento Sanger dei plasmidi di 25 cloni positivi utilizzando i primer consigliati.
Un giorno prima della trasfezione, dividere le cellule e contare il numero di cellule vitali usando un emocitometro. Quindi seminare le cellule dell'epatoma umano 7,5 in piatti da 35 millimetri in due millilitri di DMEM completo e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16 ore in un'incubatrice umidificata con il 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, preparare il complesso lipidico trascritto diluendo 10 microlitri di reagente di trasfezione in 50 microlitri del mezzo essenziale minimo e diluire separatamente cinque microgrammi di trascritti virali in 50 microlitri del mezzo essenziale minimo.
Incubare entrambe le miscele a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi mescolarli in un'unica provetta sterile per microcentrifuga e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo l'incubazione cellulare, rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule due volte con PBS 1X preriscaldato e aggiungere 1,5 millilitri del terreno essenziale minimo.
Aggiungere lentamente il complesso e agitare delicatamente il piatto per una distribuzione uniforme. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per 10 ore. Quindi rimuovere il mezzo.
Lavare le celle trasfettate due volte con un millilitro di PBS 1X preriscaldato e aggiungere due millilitri di DMEM completo. Isolare l'RNA virale da 140 microlitri di surnatanti di coltura utilizzando un kit di isolamento dell'RNA virale. Impostare una reazione qRT-PCR da 10 microlitri utilizzando un kit qRT-PCR commerciale.
Utilizzare i primer e la sonda diretta e inversa per la quantificazione dell'RNA dell'HCV. Impostare il ciclo di reazione a 48 gradi Celsius per 20 minuti, 95 gradi Celsius per 10 minuti e 45 cicli di 95 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per un minuto. Eseguire le reazioni e impostare i controlli negativi.
Parallelamente, generare una curva standard utilizzando un numero di copie note diluite in serie di trascritti di HCV per quantificare l'RNA virale. Eseguire in triplice copia. Piastre di cellule di epatoma umano 7,5 in una piastra da 96 pozzetti e incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al 5% circa 16 ore prima di aggiungere il virus.
In un armadio di classe II per la biosicurezza, eseguire diluizioni seriali decuplicate del virus. Aggiungere 100 microlitri di virus diluito per pozzetto per infettare le cellule e incubarle a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo tre giorni, lavare le cellule infette tre volte con 0,1 millilitri di PBS e fissare e permeabilizzare le cellule con 0,1 millilitri di metanolo ghiacciato a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti.
Lavare i pozzetti con 1X PBS tre volte, e poi 1X con PBST. Dopo aver rimosso il PBST, bloccare le celle per 30 minuti a temperatura ambiente con 0,1 millilitri di 1%BSA contenente lo 0,2% di latte scremato in PBST. Rimuovere la soluzione bloccante e trattare le cellule per cinque minuti con 0,1 millilitri di perossido di idrogeno al 3% preparato in PBS 1X.
Anche in questo caso, lavare le celle due volte con PBS 1X e 1X con PBST. Aggiungere 50 microlitri di anticorpo monoclonale anti-NS5A 9E10 per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Lavare i pozzetti tre volte con 1X PBS e una volta con PBST.
Aggiungere 50 microlitri di IgG secondarie anti-topo di capra coniugate HRP per pozzetto, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere l'anticorpo non legato lavando i pozzetti con 0,1 millilitri di PBS 1X. Aggiungere 30 microlitri di DAB e incubare la piastra con un leggero dondolio per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione DAB e lavare i pozzetti due volte con PBS 1X e una volta con acqua distillata.
Aggiungere 100 microlitri di PBS contenente lo 0,03% di sodio azide. Esamina ogni pozzetto con un microscopio ottico invertito utilizzando un obiettivo 10X. Contare il numero di pozzetti positivi.
Utilizzare un calcolatore di Reed e Muench per stimare la diluizione finale che infetta il 50% dei pozzetti. Sciogliere pibrentasvir, un inibitore di NS5A, in DMSO al 100% a una concentrazione di un millimolare e diluirlo ulteriormente in DMEM completo a una concentrazione di 10 nanomolari. Quindi infettare le cellule Huh-7,5 naive al 70% di confluenza con una dose di virus ML50 per infettare il 50% delle cellule per 12 ore, quindi trasferire le cellule infette su piastre a sei pozzetti 24 ore dopo l'infezione.
Aggiungere 1X EC50 PIB alle cellule infette dopo 16 ore di divisione cellulare. Eseguire questa operazione dopo ogni divisione cellulare per sei passaggi consecutivi, seguiti da tre cicli di passaggio senza farmaci, e monitorare la diffusione del virus utilizzando un test di formazione del focus. Raccogli i surnatanti virali ad ogni passaggio e conservali a meno 80 gradi Celsius.
Estrarre l'RNA virale dal surnatante il giorno 18 e dal cDNA sintetizzato. Amplifica il gene NS5A utilizzando cinque microlitri di cDNA diluito. Quindi determinare le mutazioni di resistenza ai farmaci NS5A in sei-otto plasmidi batterici positivi utilizzando i primer di sequenziamento NS5A.
Le librerie mutanti complete del genoma sono state sintetizzate utilizzando pJFH1 clonale in quantità decrescenti da 100 a 10 nanogrammi. Le rese medie dei prodotti ep-PCR variavano da 3,8 a 12,5 nanogrammi per microlitro. La proporzione di mutazioni nelle librerie mutanti è aumentata con la diminuzione dell'input di pJFH1 nella reazione ep-PCR.
ML50 sintetizzato utilizzando 50 nanogrammi del modello aveva quattro sostituzioni per 10.000 coppie di basi copiate, mentre ML25 sintetizzato utilizzando 25 nanogrammi di modello ospitava nove sostituzioni. Non sono state trovate sostituzioni all'interno del numero di nucleotidi sequenziati nel pJFH1 clonale. Le varianti virali ML50 erano meno suscettibili a pibrentasvir rispetto al virus clonale JFH1.
Degli otto cloni di NS5A, quattro avevano una combinazione di D7V+F28C, mentre V8A+F28C e F36L si trovavano in un clone ciascuno. Queste mutazioni si trovavano nella regione terminale N di NS5A, che è nota per ospitare mutazioni di resistenza a NS5A clinicamente rilevanti. La concentrazione finale di ciascun componente dell'ep-PCR è fondamentale, in particolare la quantità del modello.
La mancanza di KB Extender ridurrà notevolmente la resa del prodotto ep-PCR.
