Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della ricerca medica e sanitaria sovvenzione da parte del Comune di Parigi, la nazionale francese concedere ANR-09-JCJC-0118-1, e l&#39;ERC Starting Grant Progetto RNAvirusPopDivNVax no. 242719.

<ol>
	<li>Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA-dependent+RNA+polymerase+(in)fidelity+revealed+by+kinetic+analysis+of+the+polymerase+encoded+by+a+foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+reduced+sensitivity+to+ribavirin.">Determinants of RNA-dependent RNA polymerase (in)fidelity revealed by kinetic analysis of the polymerase encoded by a foot-and-mouth disease virus mutant with reduced sensitivity to ribavirin.</a> J Virol. 82, 12346-12355 (2008).</li><li>Arnold, J. J., Vignuzzi, M., Stone, J. K., Andino, R., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+site+control+of+an+active+site+fidelity+checkpoint+in+a+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase.">Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.</a> J Biol Chem. 280, 25706-25716 (2005).</li><li>Korneeva, V. S., Cameron, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+the+viral+RNA-dependent+RNA+polymerase:+fidelity,+replication+speed,+and+initiation+mechanism+determined+by+a+residue+in+the+ribose-binding+pocket.">Structure-function relationships of the viral RNA-dependent RNA polymerase: fidelity, replication speed, and initiation mechanism determined by a residue in the ribose-binding pocket.</a> J Biol Chem. 282, 16135-16145 (2007).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+mutation+in+poliovirus+RNA-dependent+RNA+polymerase+confers+resistance+to+mutagenic+nucleotide+analogs+via+increased+fidelity.">A single mutation in poliovirus RNA-dependent RNA polymerase confers resistance to mutagenic nucleotide analogs via increased fidelity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7289-7294 (2003).</li><li>Pfeiffer, J. K., Kirkegaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+fidelity+reduces+poliovirus+fitness+and+virulence+under+selective+pressure+in+mice.">Increased fidelity reduces poliovirus fitness and virulence under selective pressure in mice.</a> PLoS Pathog. 1, e11-e11 (2005).</li><li>Vignuzzi, M., Stone, J. K., Arnold, J. J., Cameron, C. E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+diversity+determines+pathogenesis+through+cooperative+interactions+in+a+viral+population.">Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.</a> Nature. 439, 344-348 (2006).</li><li>Vignuzzi, M., Wendt, E., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+attenuated+virus+vaccines+by+controlling+replication+fidelity.">Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.</a> Nat Med. 14, 154-161 (2008).</li><li>Crotty, S., Cameron, C., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribavirin's+antiviral+mechanism+of+action:+lethal+mutagenesis.">Ribavirin's antiviral mechanism of action: lethal mutagenesis.</a> J Mol Med. 80, 86-95 (2002).</li><li>Coffey, L. L., Vignuzzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+alternation+of+chikungunya+virus+increases+fitness+while+restricting+population+diversity+and+adaptability+to+novel+selective+pressures.">Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.</a> J Virol. 85, 1025-1035 (2011).</li><li>Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+mutant+spectrum+in+adaptation+and+replication+of+West+Nile+virus.">Role of the mutant spectrum in adaptation and replication of West Nile virus.</a> J Gen Virol. 88, 865-874 (2007).</li><li>Ibarra, K. D., Pfeiffer, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ribavirin+antiviral+efficacy+via+nucleoside+transporter-mediated+drug+resistance.">Reduced ribavirin antiviral efficacy via nucleoside transporter-mediated drug resistance.</a> J Virol. 83, 4538-4547 (2009).</li><li>Levi, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidelity+variants+of+RNA+dependent+RNA+polymerases+uncover+an+indirect,+mutagenic+activity+of+amiloride+compounds.">Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.</a> PLoS Pathog. 6, e1001163-e1001163 (2010).</li><li>Sierra, S., D&#225;vila, M., Lowenstein, P. R., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+foot-and-mouth+disease+virus+to+increased+mutagenesis:+influence+of+viral+load+and+fitness+in+loss+of+infectivity.">Response of foot-and-mouth disease virus to increased mutagenesis: influence of viral load and fitness in loss of infectivity.</a> J Virol. 74, 8316-8323 (2000).</li><li>Ruiz-Jarabo, C. M., Ly, C., Domingo, E., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethal+mutagenesis+of+the+prototypic+arenavirus+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV).">Lethal mutagenesis of the prototypic arenavirus lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV).</a> Virology. 308, 37-47 (2003).</li><li>Sierra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foot-and-mouth+disease+virus+mutant+with+decreased+sensitivity+to+ribavirin:+implications+for+error+catastrophe.">Foot-and-mouth disease virus mutant with decreased sensitivity to ribavirin: implications for error catastrophe.</a> J Virol. 81, 2012-2024 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Scelta di linee cellulari. L&#39;efficacia degli analoghi base come l&#39;RNA mutageni si correla con l&#39;assorbimento da parte relativa da diversi tipi di cellule 11. Se la linea cellulare che viene normalmente utilizzato per il passaggio del virus si rivela refrattaria alla mutageno assorbimento o troppo sensibile (ad alta tossicità cellulare), può essere necessario utilizzare un&#39;altra linea cellulare che risponde a questi requisiti ed è ancora permissiva per la replicazione virale. Una volta che la variante resistenza mutageno è isolato, il resto della caratterizzazione può essere eseguita in originale, linea cellulare preferito. Nella nostra esperienza, le cellule HeLa facilmente prendere mutageni; cellule BHK richiedere fino a concentrazioni superiori di 10 volte e le cellule Vero sono refrattari ad assorbimento mutagene. Scelta del mutageno. Nel tentativo di isolare le varianti fedeltà da un trattamento mutageno, la probabilità di successo aumenta se più di un tipo di mutageni. Base mutageni analogico di diversa struttura, che vengono erroneamente incorporati nel genoma durante la replicazione sarà prevalentemente indurre risultato in uno specifico sottoinsieme di mutazioni nei successivi cicli di replica: trattamento ribavirina favorisce GtoA e mutazioni transizione CtoU 12; 5-azacitidina ha una distorsione simile, con la aggiunta di CtoG e trasversioni GtoC 13, 5-fluorouracile preferenzialmente induce transizioni Atog e UtoC 14. In alternativa, concentrazioni più elevate di Mg 2 + o Mn 2 + può essere integrato al mezzo per aumentare la frequenza complessiva mutazione del virus a RNA, senza il pregiudizio di cui sopra 12. A seconda del codone sequenze del virus &#39;, e il codone cambiamenti necessari per generare una variante fedeltà, alcune di queste condizioni favoriscono l&#39;emergere di questa variante rispetto agli altri. Per il poliovirus G64S maggiore fedeltà e virus Coxsackie A372V, ribavirina più facilmente selezionati per le varianti, perché il passaggio Atog richiesta presso il sito codone corrispondeva alle mutazioni prevalentemente generato da questa ribavirina. MOI vs dimensione della popolazione. In virologia, i protocolli per l&#39;infezione dei tessuti cultura prestare particolare attenzione alla molteplicità di infezione (MOI), per evitare l&#39;accumulo di particelle difettoso interferenti (basso MOI) o per promuovere ricombinazione tra virus (alto MOI), per esempio. Per selezionare gli eventi emergere oltre seriale passaging, è importante considerare anche la dimensione della popolazione virus. Dal momento che il mutante resistente si registri inizialmente a bassa frequenza, è meglio trasferire il maggior numero di abitanti il più possibile da un passaggio all&#39;altro (10 5 -10 6 virus, ad esempio) per evitare di perdere queste varianti emergenti, ad ogni passaggio. Scaling up la dimensione del bene o del matraccio (numero di cellule infette) può aiutare a minimizzare l&#39;aumento di MOI se questo è motivo di preoccupazione. D&#39;altra parte, per esperimenti in cui la sensibilità di un virus mutageno viene testato, a basso infection MOI è effettuata al fine di aumentare il numero di cicli di replica che si verificano durante l&#39;esperimento e per evitare salvataggio di genomi mutagenizzate by genomi di fitness più elevato attraverso complementazione in co-cellule infette. Questo è importante in quanto le mutazioni generate genomi progenie durante il primo turno di replica non sarà immediatamente rilevato. La maggior parte di questi RNA mutagenizzate saranno ancora confezionato in virione. E &#39;nel prossimo ciclo di infezione che le mutazioni letali presenti in questi genomi si tradurrà in un ciclo di replicazione interrotta, e la riduzione del titolo virus. Può essere necessario per consentire varie tornate di accumulo di mutazioni lordo di un effetto significativo di mutagenesi letale si osserva. Infine, se rispetto alla serie passaggio in presenza del mutageno, il virus titoli continuano a scendere fino ad estinzione, allora il ricercatore dovrebbe cercare passaging virus in quantità via via crescente del mutageno (a partire da una concentrazione molto bassa). L&#39;isolamento e la generazione del clone RNA mutageno resistente dal mutageno resistente popolazione RNA. Mutageni RNA introdurre molteplici mutazioni casuali ad ogni genoma, ma la selezione per la resistenza solo arricchire (e fix per sequenza consenso) la mutazione di resistenza. Per individuare questa mutazione, abbiamo sequenza della popolazione resistente mutageno (consenso della popolazione) e non i singoli virus. Quindi, il singolo, le mutazioni casuali generati dal mutageno non vengono rilevati nella sequenza, ma solo le mutazioni che si traducono in cambiamenti consenso seguito di selezione, si trovano. Nella nostra esperienza abbiamo solo identificare uno o due di tali modifiche apportate alla sequenza consenso. Una volta che la popolazione resistente mutageno è ottenuta e la mutazione di resistenza è identificato, è necessario generare un magazzino più puro di questa variante. Soprattutto, abbiamo descritto una procedura di purificazione targa. In alternativa, se il virus di interesse non produce placche facilmente identificabili, la variante desiderata può essere purifIED limitando la diluizione. Questo approccio è essenzialmente un 50 TCID in formato a 96 pozzetti, dove viene diluito lo stock del virus in modo tale che meno del 50% dei pozzi sono infetti. Utilizzando questa diluizione, lo stesso approccio di cui sopra è presa, in isolamento fino a 10 singole varianti e confermando le loro sequenze. Come accennato, nel migliore dei casi, un clone cDNA infettive del ceppo virale è disponibile. Isolamento della variante non sarebbe quindi necessario. Nella nostra esperienza, le varianti fedeltà sono il risultato di singole sostituzioni di aminoacidi e può quindi essere generati utilizzando semplici, kit di mutagenesi commercializzato come QuikChange (Agilent). Una opzione secondaria è quella di utilizzare un clone cDNA di un ceppo strettamente correlate. Tuttavia, se un ceppo correlata è utilizzato, consigliamo vivamente di utilizzare sia questo approccio e l&#39;isolamento del virus (ad esempio la purificazione della placca), perché abbiamo scoperto che la stessa mutazione fedeltà alterando su due virus strettamente correlati non sarà necessariamente lo stesso effetto. Fedeltà e la replica. Selezione di RNA varianti resistenti mutageno hanno portato l&#39;isolamento di entrambe le varianti superiori e inferiori fedeltà con caratteristiche di crescita che sono simili alle loro controparti di tipo selvatico 4,12,15. Attualmente, il legame tra tasso di attività della polimerasi e la fedeltà non è del tutto chiaro. Studi in vitro utilizzando biochimici purificato RNA polimerasi hanno mostrato che versioni successive hanno un tasso di fedeltà lavorazione più lenti, mentre le varianti più bassa fedeltà tendono ad avere una più rapida elaborazione 1-3,12. In coltura, queste differenze non sono di solito evidenti, il che suggerisce che la disponibilità di risorse, piuttosto che l&#39;attività cinetica intrinseca polimerasi, è il fattore limitante. Se la variante fedeltà replica con cinetica che non sono significativamente diversi da wild-type, poi un confronto tra le loro frequenze mutazione può essere fatto direttamente. Se un cambiamento molto significativo in cinetica replica esiste, allora i dati dovrebbero essere normalizzati per spiegare le differenze cinetiche, per esempio confrontando i virus che hanno subito lo stesso numero di cicli di replica. Nella nostra esperienza, sebbene non significative differenze in un unico passaggio-cinetica di crescita sono state osservate tra wild-type e le varianti ad alta fedeltà, abbiamo osservato che l&#39;alta fedeltà varianti costantemente titolo superiore (entro 1 log) rispetto al wild-type, ma fanno un po &#39;meno di RNA (entro dello stesso ordine di grandezza), inoltre suggerisce che il genoma producono contengono un minor numero di mutazioni e quindi sono più contagiose. Preparazione del campione e sequenziamento. Per tutte le misure di questi protocolli, è indispensabile che ad alta fedeltà, correzione di bozze enzimi vengono utilizzati per la PCR e RT-PCR per limitare l&#39;introduzione di ulteriori mutazioni, poiché non possono essere distinti da mutazioni biologicamente rilevanti. E &#39;fondamentale che le popolazioni di virus da confrontare sono stati preparati nelle stesse condizioni (passaggio storia, la cultura media dei tessuti, la temperatura, metodo di estrazione RNA, RT-PCR protocolli, ecc) È altresì importante garantire che il materiale di partenza era abbastanza ottenuto dalla estrazione di RNA in modo tale che una band forte è generato mediante RT-PCR. A 1 / 100 di diluizione del campione di RNA deve anche dare una rilevabile RT-PCR banda, indicando che il campione contiene un numero sufficiente di molecole di RNA per evitare distorsioni di rappresentanza (amplificazione del genoma stesso più volte). Dal momento che la frequenza di mutazione è una distribuzione, ci si aspetterebbe che i valori simili si ottengono indipendentemente dalle dimensioni della popolazione, a condizione che il pregiudizio di cui sopra non si sta verificando. Come mostra la figura 6 mostra, a 10 5 volte diluizione di uno stock del virus dà una frequenza di mutazione che non è significativamente diverso dal magazzino dei genitori. Fino a quando le condizioni ottimali per TopoTA clonazione si trovano, confermano la presenza di inserti in seguito ad un&#39;analisi blu / bianco, da colonia PCR prima sequenza. Come controllo per il rumore mutazione (mutazione introdotta mediante RT-PCR e sequenziamento), clone di un prodotto di PCR da un cuscinetto plasmide e la stessa sequenza virale / o clonare e sequenziare i prodotti RT-PCR di RNA in vitro trascritto corrispondente al genoma del virus (da consapevoli del fatto che diversi degli enzimi di trascrizione in vitro hanno tassi di errore diversi e non possono dare informazioni utili per l&#39;errore di fondo reale nella procedura). Alcune sequenze del virus può essere tossico per i batteri, quindi è importante verificare questo prima di decidere sulla regione del genoma virale ad essere sequenziato per la frequenza di mutazione. Nell&#39;analizzare sequenze ottenute da TopoTA, si noti che ogni clone dovrebbe contenere un solo inserimento / sequenza. Se un doppio picco si osserva, suggerendo una popolazione mista, è possibile che due colonie batteriche vicini sono stati selezionati. E &#39;anche possibile, anche se altamente improbabile date le basse frequenze di mutazione in replica batterica, che la mutazione è stata introdotta durante l&#39;amplificazione del plasmide nella coltura batterica. In p placcaurified popolazioni, un doppio picco può rappresentare placche si sovrappongono, o un virus che sta acquisendo una nuova mutazione o il ripristino di una mutazione nel corso dello sviluppo della placca. Siate coerenti e decidere se contare o meno contare queste mutazioni. Infine, tenere presente che le frequenze di mutazione usato qui sono valori relativi. Essi sono validi solo nel confronto tra popolazioni di virus coltivati ​​nelle stesse condizioni, e sequenziato più della stessa regione! Essi non devono essere presi come valori assoluti di tasso di mutazione, o la frequenza di mutazione del genoma nel suo complesso. Tuttavia, quando le condizioni sono controllate, che lo permettono riproducibili, il confronto quantitativo delle differenze nella distribuzione di mutazione e di frequenza.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> ribavirina </td><td> Sigma </td><td> R9644-10mg </td><td></td></tr><tr><td> 5-fluorouracile </td><td> Sigma </td><td> F6627-1G </td><td></td></tr><tr><td> 5-azacitidina </td><td> Sigma </td><td> A2385-100MG </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1028-100ML </td><td></td></tr><tr><td> MnCl 2 </td><td> Sigma </td><td> M1787 </td><td></td></tr><tr><td> Blu tripano </td><td> Sigma </td><td> T8154-20ML </td><td></td></tr><tr><td> TopoTA clonazione kit </td><td> Invitrogen </td><td> 10351021 </td><td></td></tr><tr><td> QuikChange mutagenesi kit </td><td> Agilent </td><td> 200516 </td><td> Se un clone cDNA infettive è disponibile </td></tr><tr><td> 96-bene miniprep kit </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740625 </td><td></td></tr><tr><td> Lasergene, Sequencher </td><td> DNAstar, Gene Codes Corporation </td><td> <a href="www.dnastar.com">www.dnastar.com</a> <a href="www.genecodes.com">www.genecodes.com</a> </td><td> O il software di allineamento altri </td></tr></tbody></table>

isolation of fidelity variants of rna viruses and characterization of virus mutation frequency

Virus a RNA uso RNA polimerasi RNA dipendente di replicare i loro genomi. Il tasso di errore intrinseco elevato di questi enzimi è un grande contributo alla generazione di diversità demografica estrema che facilita l&#39;adattamento e l&#39;evoluzione del virus. Crescente evidenza mostra che i tassi di errore intrinseco, e le frequenze di mutazione risulta, di virus a RNA possono essere modulati da sottili cambiamenti di aminoacidi per la polimerasi virale. Anche se esistono test biochimici per alcuni polimerasi RNA virale che permettono una misura quantitativa della incorporazione fedeltà, qui descriviamo un metodo semplice per misurare le frequenze di mutazione del virus a RNA, che ha dimostrato di essere più precisi approcci biochimici per identificare le mutazioni alterano la fedeltà. L&#39;approccio utilizza le tradizionali tecniche di sequenziamento virologici e che possono essere eseguite nei laboratori di biologia più. Sulla base della nostra esperienza con un certo numero di virus diversi, abbiamo identificato i passaggi chiave che deve essere ottimizzato per aumentare la probabilità di isolare varianti fedeltà e la generazione di dati di significatività statistica. L&#39;isolamento e la caratterizzazione di mutazioni fedeltà alterare in grado di fornire nuove intuizioni nella struttura e la funzione della polimerasi 1-3. Inoltre, queste varianti fedeltà possono essere strumenti utili nella caratterizzazione dei meccanismi di adattamento e di evoluzione del virus 4-7.

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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Il presente articolo descrive i passaggi necessari per isolare e caratterizzare l&#39;RNA polimerasi varianti fedeltà dei virus a RNA e come utilizzare i dati di frequenza di mutazione per confermare le modifiche fedeltà in coltura.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

29.4K Views.  Institut Pasteur. Il presente articolo descrive i passaggi necessari per isolare e caratterizzare l'RNA polimerasi varianti fedeltà dei virus a RNA e come utilizzare i dati di frequenza di mutazione per confermare le modifiche fedeltà in coltura.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

High-throughput screening per largo spettro chimico inibitori di RNA virus

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Salvataggio e caratterizzazione del virus ricombinante da un nuovo mondo Clone infettivo del virus Zika

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generazione di varianti di fuga di neutralizzare l'Influenza Virus anticorpi monoclonali

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...