Questo studio è stato condotto in collaborazione con il Progetto Bioresource Nazionale, il Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone.

Lo schema generale di questo esperimento è mostrato in fig. 1. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Rendere il terreno base (qui in nota come PB1) in una bottiglia da 100 ml in vetro secondo la seguente tabella di seguito: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> MW </td><td> mM </td><td> mg/100ml </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,4 </td><td> 136,98 </td><td> 800,0 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,6 </td><td> 2,68 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 136,1 </td><td> 1,47 </td><td> 20,0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O </td><td> 358,14 </td><td> 8,04 </td><td> 288,1 </td></tr><tr><td> MgCl 2, 6H 2 O </td><td> 203,3 </td><td> 0,49 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td&gt; Glucosio </td><td> 180,2 </td><td> 5,56 </td><td> 100,0 </td></tr><tr><td> Na piruvato </td><td> 110 </td><td> 0,33 </td><td> 3,6 </td></tr><tr><td> CaCl 2, 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 0,9 </td><td> 13,2 </td></tr><tr><td> Penicillina G </td><td></td><td></td><td> 6,0 (circa) </td></tr></tbody></table></li><li> Rendere il Ficoll-saccarosio (FS) soluzione: <ol><li> Aggiungere le seguenti sostanze chimiche a 14 ml di PB1 soluzione, in tubo da 50 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Ficoll 70 </td><td> 6,0 g </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> 3,424 g </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 42,0 mg </td></tr></tbody></table></li><li> Mescolare Ficoll 70 e saccarosio in PB1 soluzione e agitare bene fino a completo scioglimento. </li><li> Dopo aver controllato completa dissoluzione sopra, aggiungere BSA sulla superficie della soluzione e la tiene a4 ° C fino a BSA è completamente sciolto (&gt; 4 ore o durante la notte). </li></ol></li><li> Rendono la soluzione di equilibrio (EFS20) e la soluzione vetrificazione (EFS40) in una provetta da 50 ml: <ul><li> EFS20: 20% (v / v), glicole etilenico, il 24% (w / v) Ficoll, e 0,4 mol / L di saccarosio in PB1 con BSA </li><li> EFS40: 40% (v / v), glicole etilenico, il 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L di saccarosio * in PB1 con BSA * Per gli embrioni dal ceppo BALB / c o ICR, aumentare la concentrazione di saccarosio di 0,9 mol / L di saccarosio perché sono più sensibili ai cryodamage 6. </li></ul><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> EFS20 soluzione </td><td> EFS40 soluzione </td></tr><tr><td> Glicole etilenico </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> FS soluzione </td><td> 4 ml </td><td> 3 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione con un filte 0,45 micronr. Fai aliquote in provette da 5 ml in polistirolo e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 6 mesi. </li><li> Preparazione della soluzione scongelamento degli embrioni contenenti saccarosio 0,75 M (TS1) <ol><li> Sciogliere 7,7 g di saccarosio in PB1 (preparato nel passo 1.1) e portare il volume complessivo di 30 ml. Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto. </li><li> Aggiungere 90 mg di BSA sulla superficie della soluzione e lasciare riposare fino a completo scioglimento. </li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol> Nota: TS1 può anche essere disponibili in commercio preparati a partire da M2. <ol start="6"><li> Sciogliere 7,7 g di saccarosio in M2 e portare il volume complessivo di 30 ml. </li><li> Mescolare agitando delicatamente fino a quando saccarosio è completamente sciolto. </li><li> Sterilizzare la soluzione per filtrazione. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol></li><li> TS2 (soluzione scongelamentocontenenti saccarosio 0,25 M): <ol><li> Diluire 10 ml TS1 con 20 ml di PB1 o M2, a seconda dei casi. </li><li> Aliquota e conservare a 4 ° C. Essi possono essere utilizzati per circa 1 mese. </li></ol></li></ol> 2. Vetrificazione di 2-cell embrioni di topo <ol><li> Preparare 2-cellule da embrioni di topo accoppiamento naturale o convenzionale nelle tecniche di fecondazione in vitro. </li><li> Aliquota 50 microlitri EFS40 in un CryoTube. D&#39;ora in poi, eseguire il resto della procedura di vetrificazione a temperatura ambiente. </li><li> Aliquota 50 ml di EFS20 sul fondo di una 35 mm o 60 mm piatto di plastica Petri. </li><li> Trasferimento fino a 30 embrioni per EFS20 utilizzando un capillare di vetro con solo la quantità minima di terreno di coltura. Avviare un timer per 2 min. Nota: gli embrioni Posizionare sul fondo della goccia. Questo rende la disidratazione efficiente degli embrioni. Controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio. Embrioni disidratati mostrano una morfologia rimpicciolito, come mostrato in fig. 2A.Se non sono abbastanza disidratato, attendere per più di 1 o 2 min. </li><li> A circa 1,5 minuti, raccogliere gli embrioni dal menu EFS20 con solo la quantità minima della soluzione. Trasferirli EFS40 nel CryoTube preparato in 2.1 passo. Nota: Per ottenere risultati ottimali, regolare il tempo di raccogliere gli embrioni in modo che tutti gli embrioni possono essere trasferiti in EFS40 a circa 2 min. </li><li> Attendere 1 min. </li><li> Mettere il CryoTube direttamente in azoto liquido (LN 2). </li></ol> 3. Scongelamento vetrificati 2-cell embrioni di topo <ol><li> Prima di scongelamento, preparare un piatto con 10 gocce ml di terreno di coltura degli embrioni per gli embrioni di recupero (vedi punto 3.13). Coprire il piatto con l&#39;olio e mettere in un incubatore CO 2 fino al momento dell&#39;uso. Nota: Anche se tutti i mezzi per la coltura degli embrioni di routine possono essere utilizzati in questo esperimento, si consiglia di media con maggiore osmolarità come medium M16. </li><li> TS1 caldo a 37 ° C. </li><li> Indossare una maschera viso e cryogloves. Aprire la LN 2 tank e recuperare un CryoTube contenente gli embrioni. </li><li> Aprire rapidamente la parte superiore del tubo ed eliminare LN 2. Attendere 30 secondi per evitare TS1 dal gelo nel passaggio successivo. </li><li> Utilizzare una pipetta 1000ul aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) nella provetta e miscelare la soluzione da pipettings dolce (circa dieci volte in 25 secondi) fino a quando la soluzione è sciolto in modo uniforme. </li><li> Trasferire l&#39;intero volume del tubo di plastica ad una parabola di 60 millimetri Petri (o un vetro da orologio) (Fig. 3A). Nota: Gli embrioni devono essere gestiti a temperatura ambiente (22-25 ° C) fino a quando non sono posti in un incubatore a CO 2 Passo 3.14. </li><li> Avviare un timer per 3 min. </li><li> A circa 2 minuti in TS1, agitare delicatamente il piatto fino a quando il supporto contenente embrioni si sviluppa sulla superficie del piatto (Fig. 3B). Nota: Questo aiuterà gli embrioni andare fino in fondo perché sono galleggianti in prossimità della superficie quando vengono trasferiti su TS1. </li><li> Mettete tre da 50 ml di gocce su TS2 °e piatto (Fig. 3C). </li><li> Dopo 3 minuti in TS1, controllare la morfologia degli embrioni da uno stereomicroscopio, ma dovrebbe essere leggermente rimpicciolito. Vedere la morfologia degli embrioni in precedenza (Fig. 2B) e più tardi (Fig. 2C) in TS1. Nota: Se gli embrioni sono ancora gonfi, tenerli in TS1 per di più 1 per 3 min. </li><li> Raccogliere gli embrioni e trasferirli la prima goccia di TS2 (Fig. 3D). Avviare un timer per 3 minuti </li><li> Dopo 3 minuti, trasferire gli embrioni per la seconda goccia e poi alla terza derivazione (Fig. 3E). </li><li> Trasferire gli embrioni al mezzo di coltura preparato a punto 3.1. Gli embrioni sono a forma mostrato in fig. 2D. </li><li> Piatto posto in un incubatore CO 2. Circa 10 minuti dopo, il trasferimento di embrioni per la caduta successiva del terreno di coltura per lavare saccarosio che è stato riportato da TS2. </li><li> Continua la cultura in un incubatore a CO2 fino al trasferimento degli embrioni. Nota: Il trasferimento Embryos alla ovidotti delle femmine destinatario il giorno del disgelo. Cultura lungo in vitro può diminuire la vitalità degli embrioni in alcuni ceppi di topi. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In vitro - e in vivo, lo sviluppo di embrioni dopo lo scongelamento è presentato nelle tabelle 1 e 2. I vantaggi di questo protocollo sono l&#39;elevata capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento e la sua vasta applicabilità a diversi ceppi di topi. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensione </td><td> Numero totale di tubi </td><td> Numero di embrioni vetrificata </td><td> Recupero (N. (%)) </td><td> Morfologicamente normali (N. (%)) </td><td> Sviluppo di blastocisti (N. (%)) </td></tr><tr><td> C57BL/6J </td><td> 20 </td><td> 400 </td><td> 397 (99) </td><td> 394 (99) </td><td> 342 (87) </td></tr><tr><td> BALB / cA </td><td> 15 </td><td> 300 </td><td> 296 (99) </td><td> 282 (95) </td><td> 238 (84) </td></tr><tr><td> ICR </td><td> 24 </td><td> 480 </td><td> 474 (99) </td><td> 443 (93) </td><td> 398 (90) </td></tr></tbody></table> Tabella 1. In vitro, sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati in ceppi di topo comune <table border="1"><tbody><tr><td> Condizione di embrioni </td><td> Numero di femmine destinatario </td><td> Numero di embrioni trasferiti </td><td> Siti di impianto (n. (%)) </td><td> Vivere prole (N. (%)) </td></tr><tr><td> Fresco </td><td> 12 </td><td> 180 </td><td> 141 (78.3) </td><td> 110 (61.1) </td></tr><tr><td> Vetrificati </td><td> 16 </td><td> 242 </td><td> 202 (83.5) </td><td> 125 (51.7) </td></tr></tbody></table> Tabella 2. In vivo-sviluppo di vetrificati-embrioni scongelati nei topi C57BL/6J. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig1.jpg" /> Figura 1. Lo schema complessivo dell&#39;esperimento, comprese equilibrio, vetrificazione, e lo scongelamento degli embrioni. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig2.jpg" /> Figura 2. La morfologia degli embrioni in ogni fase del disgelo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3155/3155fig3.jpg" /> Figura 3. Procedura di scongelamento di embrioni. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente. (A), Aggiungere 850 ml di TS1 (37 ° C) in un CryoTube e trasferire l&#39;intero volume della soluzione in CryoTube su un piatto di plastica. A questo punto, gli embrioni aspetto gonfio come mostrato in fig. 2B. (B), Stendere la soluzione sulla superficie del piatto da parte agitando delicatamente. (C), Place tre da 50 ml di gocce TS2 sul piatto di plastica. (D), trasferimento degli embrioni per la prima goccia di TS2. Dopo 3 minuti, gli embrioni aspetto shurunken come mostrato in fig. 2C. (E), Trasferimento li serialeLy in TS2 restanti gocce e poi al mezzo di coltura.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196&#176;+and+-269&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196&#176; and -269&#176;C.</a> Science. 187, 411-414 (1972).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Yoshiki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+resources+at+the+RIKEN+BioResource+center.">The mouse resources at the RIKEN BioResource center.</a> Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).</li><li>Mochida, K., Ogura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+embryos+in+laboratory+species.">Cryopreservation of embryos in laboratory species.</a> J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).</li><li>Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+mouse+embryos+cryopreservation+in+a+low+toxicity+vitrification+solution,+without+appreciable+loss+of+viability.">A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability.</a> J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing+methods.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Kasai, M., Mukaida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+animal+and+human+embryos+by+vitrification.">Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification.</a> Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).</li><li>Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+mouse+oocytes+and+embryos+at+various+stages+of+development+in+an+ethylene+glycol-based+solution+by+a+simple+method.">Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method.</a> Theriogenology. 40, 121-134 (1993).</li><li>Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+rat+embryos+at+various+developmental+stages.">Vitrification of rat embryos at various developmental stages.</a> Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).</li><li>Jin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+vitrification+of+mouse+embryos.">Equilibrium vitrification of mouse embryos.</a> Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Dal momento che il primo rapporto di vetrificazione del mouse embrione da Rall e Fahy nel 1985 2, diversi miglioramenti tecnici sono stati fatti per aumentare la capacità di sopravvivenza degli embrioni dopo lo scongelamento. Una delle modifiche di maggior successo è stato ottenuto mediante l&#39;uso di glicole etilenico come crioprotettore a causa della sua bassa tossicità ed elevata permeabilità di membrana. Tali vantaggi ci permettono di gestire il congelamento degli embrioni a temperatura ambiente 4; metodi di vitrificazione altri richiedono embrione consegna a temperature più fredde e non sono sempre applicabili ad alcuni ceppi di topi compresi BALB / c 6. A base di glicole etilenico la prima vetrificazione è stato sviluppato da Kasai et al. nel 1990 5,7. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Pertanto, il metodo di vetrificazione qui descritte possono essere applicable a molti laboratori usando topi come modelli di ricerca. Lo stesso metodo può essere utilizzato anche per embrioni di topo a morula e di blastocisti fasi 8 e 9 embrioni di ratto. Tuttavia, abbiamo recentemente scoperto che la qualità del cryotubes possono influenzare i tassi di sopravvivenza degli embrioni dopo il congelamento-scongelamento. Quindi, è essenziale esaminare la superficie interna del cryotubes per la sua morbidezza gli embrioni prima di vetrificazione (ad esempio, vedere tabella di reagenti e attrezzature specifiche). Metodi di vetrificazione hanno molti vantaggi rispetto ai tradizionali metodi di congelamento lento, ma di per sé hanno uno svantaggio rispetto a scopo di trasporto. Come embrioni vetrificata deve essere mantenuto al di sotto dei -120 ° C per mantenere la loro vitalità, spedizionieri a secco sono generalmente utilizzati per il loro trasporto sicuro. Spedizionieri secco sono pesanti e ingombranti, e la loro andata e ritorno è costoso, soprattutto per il trasporto internazionale. Ora siamo attualmente sviluppando un nuovo metodo di vetrificazioneche gli embrioni vetrificate possono essere conservati a temperatura di ghiaccio secco (circa -80 ° C) per almeno 7 giorni 10. Questo metodo dovrebbe essere la vetrificazione della prossima generazione.

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Merck Biosciences (Calbiochem) </td><td> 12657 </td><td></td></tr><tr><td> Glicole etilenico </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 058-00986 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 70 </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0310-10 </td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 041-00595 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 191-01665 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 163-03545 </td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 169-04245 </td><td></td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 · 12H 2 </sub&gt; O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 500-04195 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 135-00165 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H2O </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 031-00435 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina G </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-4687 </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato di sodio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-8574 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Pure Wako Chemical Industries </td><td> 196-00015 </td><td></td></tr><tr><td> M16 media </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7292 </td><td></td></tr><tr><td> M2 di media </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> CryoTube </td><td> Sumitomo Bakelite </td><td> MS-4501 </td><td> &quot;Vial criogenici&quot; </td></tr></table>

cryopreservation of mouse embryos by ethylene glycol-based vitrification

Crioconservazione di embrioni di topo è una base tecnologica che supporta scienze biomediche, perché molti ceppi di topi sono stati prodotti da modificazioni genetiche e il numero è costantemente aumentando di anno in anno. Il suo sviluppo tecnico è iniziato con i metodi di congelamento lento nel 1970 1, seguito da metodi di vetrificazione sviluppati alla fine del 1980 2. In generale, la tecnica di questi ultimi è vantaggioso nella sua rapidità, semplicità e capacità di sopravvivenza elevato di embrioni recuperati. Tuttavia, i crioprotettori contenuti sono altamente tossici e possono influenzare il successivo sviluppo embrionale. Pertanto, la tecnica non era applicabile a alcuni ceppi di topi, anche quando le soluzioni sono raffreddato a 4 ° C per mitigare l&#39;effetto tossico durante la manipolazione degli embrioni. Al Bioresource RIKEN Center, più di 5000 ceppi di topi con differenti background genetici e fenotipi sono mantenuti 3, e quindi abbiamo ottimizzato a te vetrificazionechnique con i quali siamo in grado di crioconservare embrioni da molti diversi ceppi di topi, con i benefici di sopravvivenza dell&#39;embrione alto dopo vetrificazione e scongelamento (o liquefazione, più precisamente) a temperatura ambiente 4. Qui vi presentiamo un metodo di vetrificazione per embrioni di topo che è stato utilizzato con successo presso il nostro centro. La soluzione crioconservazione contiene glicole etilenico invece di DMSO per ridurre al minimo la tossicità di embrioni 5. Esso contiene inoltre Ficoll e saccarosio per la prevenzione delle devetrificazione e regolazione osmotica, rispettivamente. Gli embrioni possono essere gestite a temperatura ambiente e trasferiti in azoto liquido entro 5 minuti. Poiché il metodo originale è stato ottimizzato per cannucce di plastica come contenitori, abbiamo leggermente modificato il protocollo per cryotubes, che sono più facilmente accessibili in laboratorio e più resistenti ai danni fisici. Abbiamo anche descrivere la procedura di scongelamento di embrioni vetrificata nel dettaglio, perché è un critico step per il recupero efficiente dei topi vivi. Queste metodologie sarebbe utile a ricercatori e tecnici che hanno bisogno di conservazione dei ceppi di topi per un uso successivo in modo sicuro e conveniente.

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Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Un glicole etilenico metodo basato vetrificazione per embrioni di topo è descritto. E &#39;vantaggioso per altri metodi nella sua semplicità e bassa tossicità embrionale, e quindi può essere ampiamente applicabile a molti ceppi di topi, compresi topi inbred e geni modificati.

Crioconservazione di embrioni di topo da glicole etilenico-Based Vetrificazione

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

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In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

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Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Generare embrioni di zebrafish Chimerico da trapianto

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements and tools for genetic manipulation have become available in Drosophila 2. Soon after the initial discovery by Frie and Mello 3 that double stranded RNA can be used to knockdown the activity of individual genes in Caenorhabditis elegans, RNA interference (RNAi) was shown to provide a powerful reverse genetic approach to analyze gene functions in Drosophila organ development 4, 5.
Many organs, including lung, kidney, liver, and vascular system, are composed of branched tubular networks that transport vital fluids or gases 6, 7. The analysis of Drosophila tracheal formation provides an excellent model system to study the morphogenesis of other tubular organs 8. The Berkeley Drosophila genome project has revealed hundreds of genes that are expressed in the tracheal system. To study the molecular and cellular mechanism of tube formation, the challenge is to understand the roles of these genes in tracheal development. Here, we described a detailed method of dsRNA injection into Drosophila embryo to knockdown individual gene expression. We successfully knocked down endogenous dysfusion(dys) gene expression by dsRNA injection. Dys is a bHLH-PAS protein expressed in tracheal fusion cells, and it is required for tracheal branch fusion 9, 10. dys-RNAi completely eliminated dys expression and resulted in tracheal fusion defect. This relatively simple method provides a tool to identify genes requried for tissure and organ development in Drosophila.

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNA interference has been proven very effective to analyze gene function in Drosophila tracheal development. A detailed protocol used by Jiang lab to inject dsRNA into fly embryos to knockdown gene expression is illustrated. This technique has the potential for screening genes required for tissue and organ development in Drosophila.

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Crioconservazione di embrioni preimpianto di bovini, ovini, e caprini

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tutto il monte In Situ</emIbridazione> di E8.5 a E11.5 embrioni di topo

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...