Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo austriaco della scienza (FWF) concedere P18820-B13. Etica dichiarazione: Lo studio è stato approvato (PLUS_Ethik_090514) da parte del Comitato Etico per esperimenti che coinvolgono gli esseri umani e / o animali presso l&#39;Università di Salisburgo conformi alle Declaraction di Helsinki modificata nel 1983 e tutti i pazienti partecipanti hanno dato il loro consenso informato scritto.

1. Preparazione di coniugati farmaco <ol><li> Sciogliere 10 mg DF in 1 ml di dH 2 O in una provetta da 1,5 ml di reazione. Nel procedere ulteriormente uso 95 ml di questa soluzione DF. A coniugare PP HSA sciogliere 30,4 mg di derivati ​​PP (304 g / mol) in 500 microlitri 0,3 M di idrossido di sodio (NaOH). </li><li> Aggiungi 430,6 microlitri dH 2 O e 100 l 0,5 M 2 - (N-morfolino) etano acido (MES) pH 6,5-95 l di DF sciolto. Aggiungi 33,1 microlitri dH 2 O e 140 ml di 2 M MES tampone pH 2,9 a campione PP. </li><li> Aggiungere 57,5 ml di uno preparati al momento N-etil-N &#39;- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) soluzione madre sciolto in dH 2 O con una concentrazione di 100 mg / ml al campione DF, o 10 ul di soluzione EDC per PP campione. Vortex i campioni per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 16,9 ml di soluzione di HSA con una concentrazione di 118 mg / ml per ogni campione. </li><li> Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 300 giri / min. </li><li> Dializzare il DF e campioni di PP 3 volte contro le 2 litri di soluzione salina tampone fosfato (PBS) pH 7,4 per diverse ore ciascuno. Eseguire tutti i passaggi dialisi a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione 10 minuti a 14.000 xg e raccogliere il supernatante contenente DF o PP coniugato con HSA. </li><li> Controllare surnatante per le proteine ​​eseguendo un SDS-PAGE, utilizzando il 12% gel. Carico di circa 12 mg di HSA coniugato in uno slot gel. </li></ol> 2. Determinare il tasso di accoppiamento di coniugati farmaco (Figura 2) <ol><li> Per l&#39;analisi del tasso di accoppiamento del DF e PP coniugati da HPSEC utilizzare una di sodio 100 mM tampone fosfato pH 6,5 contenente 150 mM di NaCl e sodio azide 0,05%. Utilizzare un 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 colonna SWXL. </li><li> Eseguire il rilevamento dei segnali utilizzando un line-coupled RI e rivelatore sistema UV. </li><li> Preparare un campione standard di HSA con una concentrazione di 1 mg / ml in DH 2 O. Per la calibrazione del rivelatore iniettare 50 microlitri HSA soluzione standard. </li><li> Calcolare la costante k RI RI e UV UV costante k per il rivelatore. Utilizzare l&#39;area formule RI RI = k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] e l&#39;area UV UV = k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] con (dn / dc) HSA = 0,185 e (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Preparare DF e PP standard derivati ​​HPSEC che ammonta 5, 10 e 30 nmol di entrambi gli standard possono essere facilmente iniettato. </li><li> Calcolare i valori medi per (dn / dc), di droga e (dA / dc), farmaco per entrambi gli standard. Per DF, un (dn / dc) di 0,235 ± 0,010 e un (dA / dc) di 39,000 ± 0,493 è stato determinato. Per PP, una (dn / dc) di 0,328 ± 0,016 e un (dA / dc) di 53,155 ± 2,464 è stato determinato. </li><li> Iniettare coniugati farmaco su HPSEC e determinare la loro RI e UV aree dei picchi. </li><li> Calcolare la concentrazione di DF, derivati ​​PP e HSA risolvendo l&#39;area due equazioni RI RI = k * [(dn / dc) Farmaco * c (droga) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] e UV zona UV = k * [(dA / dc) Farmaco * c (droga) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] per le incognite. </li></ol> 3. BAT utilizzando coniugati farmaco <ol><li> Preparare sette coppe citometria a flusso e etichettarli a seconda del loro contenuto: controllo senza macchia, controllo negativo, controllo positivo, e coniugati droga. </li><li> Pipettare 50 ml di B-CCR-STB buffer di stimolazione (FLOW2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) nel fiale riservato per il controllo senza macchia e negativo. Come controllo positivo, utilizzare 50 ml di un anti-FcεRI soluzione fornita dal kit FLOW2 CAST. Aggiungere la quantità appropriata della soluzione di coniugato alla fiale riservato ai coniugati farmaco creando una serie diluizione 1:10 da 0,02 -20 mg / ml DF coniugato e PP coniugato (concentrazioni finali in un volume dosaggio di 200 l). Questi esperimenti di titolazione devono essere eseguiti per determinare la concentrazione ottimale di attivazione dei basofili per ogni campione del paziente. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di buffer stimolo a ciascuna provetta con EDTA e sangue intero 50 microlitri del paziente. Mescolare accuratamente i campioni. </li><li> Pipettare 20 l FLOW2 colorazione CAST reagente contenente anticorpi anti-CCR3 marcati con ficoeritrina (PE) e anti-CD63 anticorpi marcati con isotiocianato di fluorescina (FITC) per ciascuna provetta e mescolare nuovamente. Non pipettare colorazione del reagente nel campione senza macchia! </li><li> Incubare i campioni per 45 minuti in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Fermare la reazione in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> Lisi degli eritrociti con l&#39;aggiunta di 2,0 ml di reagente di lisi CAST FLOW2 ad ogni flacone e agitare delicatamente. Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare i campioni per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante con cura. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FLOW2 CAST lavare e conservare il ghiaccio fino citometria a flusso. </li><li> S Regolare la tensione della citometria a flusso dimpostazioni per scatter in avanti e laterale (FSC, SSC) durante l&#39;acquisizione del campione senza macchia. </li><li> Porta le cellule come linfociti previsto dalla SSC-FSC complotto per la SSC-PE trama. Basofili sono identificati da un PE con etichetta anti-CCR3 anticorpi come CCR3 hi SSC lo e li porta nel FITC-PE trama. L&#39;anticorpo anti-CD63 rilevazione basofili attivati ​​è marcato con FITC. </li><li> Impostare il cut-off ad un massimo del 2,5% dei basofili come CD63 hi nel controllo negativo. Un campione è considerato positivo per l&#39;attivazione dei basofili se basofili&gt; 5% sono CD63 hi e l&#39;indice medio di fluorescenza (MFI) del campione divisa per la MFI del controllo negativo supera i 2 (Figura 3). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Questo esperimento valuta BAT come uno strumento utile per rilevare IgE-dipendente ipersensibilità a farmaci. Coniugati proteina di FANS sono utilizzati per l&#39;attivazione dei basofili. Da HPSEC con RI e rilevamento dello stato di aggregazione UV, il grado di accoppiamento, e la resa effettiva dei coniugati sono determinati. Come mostra la Figura 4 mostra, il 43,5% dei coniugati DF è rimasto monomerica con un grado di accoppiamento su 5,0 DF / HSA. Per gli aggregati un grado di accoppiamento di 9,5 è stata determinata. Il coniugato propyphenazone è stato dimostrato che consistono di monomeri 68,5% con un grado di accoppiamento di 21,2. Il grado di accoppiamento degli aggregati è stato 27,9. In totale, il grado di accoppiamento determinato di coniugati DF DF è stata di 7,6 e quello di coniugati PP era 23.2. BAT eseguita con coniugati in condizioni ottimizzate (concentrazione di coniugati, il tempo di stimolazione) indagine ha permesso di IgE-dipendente reazioni di ipersensibilità FANS. Come mostrato nella Figura 5, solo il PP coniugato è stato in grado di innescare l&#39;attivazione dei basofili visualizzati attraverso un up-regolazione dell&#39;espressione di CD63 di superficie: 20,6% dei basofili sono stati attivati ​​caratterizzati da un log-shift di intensità di fluorescenza. La IFM aumentato di un fattore pari a 4,9 da 386 (controllo negativo) al 1893. Al contrario, utilizzando il coniugato DF solo 3,1% dei basofili sono stati attivati, che era inferiore al 5% di cut-off. Anche la IFM è aumentato solo di un fattore 1,1 (limite 2,0) da 197 (controllo negativo) a 210. Validità del test è dato da (i) &lt;5% di attivazione dei basofili nel controllo negativo, (ii) un log-spostamento di intensità di fluorescenza di una sottopopolazione basofili, e (iii)&gt; 50% basofili attivati ​​(controllo positivo). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" /> Figura 1. Accoppiamento di derivati ​​DF e PP di HSA. Dopo aver sciolto le droghe, l&#39;acqua, MES buffer e EDC (reagenti di accoppiamento) sono aggiunti. I campioni sono in agitazione per 1 minuto prima di HSA è pipettati alle soluzioni droga. Entro 2 ore agitazione a temperatura ambiente i farmaci si legano covalentemente alla HSA. Monomeri così come aggregati può causare. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" /> Figura 2. Calcolo dei gradi di accoppiamento. In primo luogo, le costanti k RI e UV k sono determinati. Pertanto, HSA standard con concentrazione nota viene iniettato nel sistema HPSEC. (Dn / dc) e (dA / dc) di HSA sono riportati i valori di 0,185 e 0,518, rispettivamente 5. Le aree dei picchi sono utilizzati per calcolare le costanti. In secondo luogo, per ciascun farmaco viene iniettato tre standard per determinare droga e la concentrazione specifici per aree di RI e ai raggi UV. Dato che il RI k UV e le costanti k sono noti i passaggi precedenti, i derivati ​​farmaco-specifici (dn / dc) e (dA / cc) può essere calcolato. In terzo luogo, droga HSA coniugati vengono iniettate nel HPSEC. Le aree dei picchi risultanti vengono utilizzati per calcolare le concentrazioni di farmaco e HSA al picco risolvendo le due equazioni con due incognite. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" /> Figura 3. Gating basofili. Cellule come linfociti sono previsti side scatter gate contro forward scatter (SSC-plot FSC). I basofili sono identificati come CCR3 hi SSC lo dai linfociti gated (SSC-CCR3-PE trama). I basofili sono analizzati per l&#39;attivazione (CD63 hi) nel CD63-FITC-CCR3-PE trama. Il controllo negativo viene utilizzato per impostare il cut-off del massimo basofili 2,5% rimanente CD63 hi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" /> Figura 4. Gradi di accoppiamento determinato di coniugati farmaco. RI e segnali UV mostrano due picchi che rappresentano aggregati (eluizione a volume di ritenzione basso) e monomeri (eluizione a volume di ritenzione di altezza) di farmaco-HSA coniugati. Percentuali di monomeri e aggregati (determinata dai segnali RI) e le loro gradi di accoppiamento sono rappresentati (n = 1). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" /> Figura 5. Basofili Activatiin prova. Risultati di farmaco coniugato attivato campioni, controlli negativi e controlli positivi sono mostrati in CD63-FITC-CCR3-PE trame (n = 1).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

BAT è una realtà consolidata anche se non ancora metodo utilizzato di routine per la diagnosi di IgE-mediata malattia allergica 6,7. Per ipersensibilità a farmaci, tuttavia, la sua applicabilità è compromessa come composti a basso peso molecolare non sono in grado di reticolazione recettori IgE, un prerequisito per l&#39;attivazione dei basofili 8. Pertanto, i farmaci oggetto di indagine devono essere accoppiati in modo covalente alle proteine ​​di trasporto idoneo (es. HSA). È importante sottolineare che il grado di accoppiamento (cioè il numero di molecole di farmaco per ogni proteina di trasporto) deve essere controllata per garantire attività immunologica (cioè recettore IgE cross-linking) delle coniugati. Teoricamente, due apteni per molecola vettore dovrebbe essere sufficiente per il recettore IgE cross-linking e un minimo di cinque molecole DF per HSA hanno dimostrato di innescare rilascio mediatore in un saggio basato su cellule 4. Entrambi i coniugati, PP-HSA e DF-HSA, sono stati determinati per visualizzare un grado di accoppiamento sufficientemente elevato (HPSEC) e di essere immunologicamente attive che li rende reattivi adatto per l&#39;uso delle BAT. Un altro problema potrebbe essere che i metaboliti della droga può avere un ruolo, come un metabolita invece del farmaco può causare la reazione di ipersensibilità. In caso di DF, questa possibilità è stata valutata in dettaglio in precedenza utilizzando cinque Fase I principali metaboliti e una variante di collegamento 4. Fattori importanti per padroneggiare la tecnica descritta comprendono la qualità del campione di sangue (&lt;12 ore dopo la raccolta del sangue, il numero dei basofili rilevato&gt; 500) e l&#39;ottimizzazione delle condizioni di stimolazione (tempo, dose). Inoltre, i cosiddetti non-responder che non hanno nemmeno reagire con il controllo positivo (anticorpo diretto contro il recettore IgE) devono essere identificati. Pertanto, i criteri di validazione devono includere un anti-FcεRI anticorpi come controllo positivo. Un importante vantaggio di usare coniugati farmaco è il fatto che appaiono non tossico in contrasto con la droga pura, come mostrato per DF-HSA coniugato dal co-stimolazione con anti-anticorpi in FcεRI BAT 4. DF puro, al contrario, mostra gli effetti citotossici ad una concentrazione di 1,25 mg / ml, causando problemi con l&#39;interpretabilità delle BAT 9. Generalmente, i test di citotossicità potenziale è fortemente raccomandato per ogni coniugato di nuova produzione. Qui, abbiamo dimostrato il potenziale di PP-HSA coniugato utilizzato in BAT per rivelare ipersensibilità IgE-mediata. Al contrario, DF ipersensibilità non è associato con livelli di IgE dimostrato dalla mancanza di attivazione dei basofili in risposta a DF-HSA coniugato. È importante sottolineare che, in caso di incertezza relativa ad un meccanismo IgE-mediata, coniugati devono essere valutati per l&#39;attività immunologica da parte nei sistemi di dosaggio in vitro cell-based come è stato dimostrato per DF 4. Utilizzando la configurazione descritta di coniugare i farmaci a basso peso molecolare covalente al vettore proteico adatto molecole una serie di reazioni di ipersensibilità contro la droga tra cui antibiotici, altri FANS, radiologico media, miorilassanti, anestetici, ecc possono essere indagato per un coinvolgimento di IgE-mediata meccanismo. Quindi, BAT può servire come aggiunta ai metodi esistenti per la diagnosi (test cutanei, test provocazione orale).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / dispositivo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morpholino) etano acido </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL colonna </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifuga da banco in alto </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenac sale sodico </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> FLOW2 CAST Kit </td><td> Bühlmann Laboratories </td><td> FK-CCR </td><td> Efficace CAST 14 Giugno 2011 FLOW2 kit è ora CAST di flusso </td></tr><tr><td> HP1100 sistema HPLC </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albumina sierica umana </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Laboratorio centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-etil-N&#39;-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS compresse </td><td> Applichem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone derivati </td><td> Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Salisburgo, Austria </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio bicarbonato </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Rivelatore a serie di triple </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex personale V-1, più </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Acqua del bagno 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

basophil activation test for investigation of ige-mediated mechanisms in drug hypersensitivity

Reazioni di ipersensibilità contro i non-steroidei anti-infiammatori non steroidei (FANS) come propyphenazone (PP) e diclofenac (DF) può manifestarsi come tipo I reazioni simil-allergiche 1. Nella pratica clinica, la diagnosi di ipersensibilità a farmaci è svolta prevalentemente dalla storia del paziente, come test cutaneo non è affidabile e test di provocazione orale porta pericolo di vita i rischi per il paziente 2. Quindi, le prove per un sottostante meccanismo patogenetico IgE-mediata è difficile da ottenere. Qui, presentiamo un metodo in vitro basato sull&#39;uso dei basofili umani derivati ​​da pazienti con ipersensibilità al farmaco che imita la reazione allergica effettrici in vivo. Come basofili di farmaco pazienti allergici trasportare molecole di IgE specifiche per il farmaco colpevole, che si attivano al momento reticolazione recettore IgE e rilasciare le molecole effettrici allergiche. L&#39;attivazione dei basofili può essere monitorato dalla determinazione della sovra-regolazione dell&#39;espressione di CD63 superficie mediante citometria a flusso 3. Nel caso di farmaci a basso peso molecolare, coniugati sono progettati per consentire reticolazione recettore IgE sui basofili. Come illustrato nella figura 1, due rappresentanti dei FANS, PP e DF, un legame covalente con albumina sierica umana (HSA) tramite un gruppo carbossilico reagisce con il gruppo amminico primario di residui di lisina. DF trasporta un gruppo carbossile intrinseca e, quindi, può essere utilizzato direttamente 4, mentre un gruppo carbossile contenenti derivati ​​di PP doveva essere sintetizzato organochemically prima dello studio 1. Il grado di accoppiamento dei composti a basso peso molecolare della molecola di proteina carrier e la loro distribuzione spaziale è importante per garantire la reticolazione di due molecole del recettore IgE. Il protocollo qui descritto si applica ad alte prestazioni di dimensioni cromatografia di esclusione (HPSEC) equipaggiato con un indice di rifrazione sequenziale (RI) e ultravioletti (UV), sistema di rilevamento per la determinazione del grado di accoppiamento. Come la metodologia descritta può essere applicata per altri farmaci, il test di attivazione dei basofili (BAT) porta il potenziale per essere utilizzata per la determinazione di IgE-mediata meccanismi di ipersensibilità di droga. Qui, si determina come PP ipersensibilità IgE-mediata e ipersensibilità DF come non-IgE-mediata dalla BAT.

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Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Test di attivazione dei basofili è un potente strumento per la rilevazione di IgE-dipendente allergie<em&gt; In vitro</em&gt;. Qui, un protocollo ottimizzata per i test di attivazione dei basofili è utilizzato per indagare ipersensibilità a farmaci. Un metodo per la produzione efficiente di covalenti farmaco-proteina coniugati e la loro caratterizzazione fisico-chimica è descritta.

L&#39;attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

Hypersensitivity reactions against non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) like propyphenazone (PP) and diclofenac (DF) can manifest as Type I-like ...

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33.3K Views.  University of Salzburg. Test di attivazione dei basofili è un potente strumento per la rilevazione di IgE-dipendente allergie In vitro. Qui, un protocollo ottimizzata per i test di attivazione dei basofili è utilizzato per indagare ipersensibilità a farmaci. Un metodo per la produzione efficiente di covalenti farmaco-proteina coniugati e la loro caratterizzazione fisico-chimica è descritta.

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Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

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Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitare Drug Discovery: un sistema automatico di alta Tenore infiammazione in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host immune system has experienced in the recent past. DTH reactions are often divided into a sensitization phase, referring to the initial antigen experience, and a challenge phase, which usually follows several days after sensitization. The lack of a delayed-type hypersensitivity response to a recall Ag demonstrated by skin testing is often regarded as an evidence of anergy. The traditional DTH assay has been effectively used in diagnosing many microbial infections.
Despite sharing similar immune features such as lymphocyte infiltration, edema, and tissue necrosis, the direct DTH is not a feasible diagnostic technique in transplant patients because of the possibility of direct injection resulting in sensitization to donor antigens and graft loss. To avoid this problem, the human-to-mouse "trans-vivo" DTH assay was developed 1,2. This test is essentially a transfer DTH assay, in which human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and specific antigens were injected subcutaneously into the pinnae or footpad of a na&iuml;ve mouse and DTH-like swelling is measured after 18-24 hr 3. The antigen presentation by human antigen presenting cells such as macrophages or DCs to T cells in highly vascular mouse tissue triggers the inflammatory cascade and attracts mouse immune cells resulting in swelling responses. The response is antigen-specific and requires prior antigen sensitization. A positive donor-reactive DTH response in the Tv-DTH assay reflects that the transplant patient has developed a pro-inflammatory immune disposition toward graft alloantigens.
The most important feature of this assay is that it can also be used to detect regulatory T cells, which cause bystander suppression. Bystander suppression of a DTH recall response in the presence of donor antigen is characteristic of transplant recipients with accepted allografts 2,4-14. The monitoring of transplant recipients for alloreactivity and regulation by Tv-DTH may identify a subset of patients who could benefit from reduction of immunosuppression without elevated risk of rejection or deteriorating renal function.
A promising area is the application of the Tv-DTH assay in monitoring of autoimmunity15,16 and also in tumor immunology 17.

We describe a valuable diagnostic assay that could potentially be used to decide the withdrawal of immunosuppression after transplant without elevated risk of graft rejection. The assay uses the principles of Delayed Type Hypersensitivity and provides accurate assessment of both donor specific effector and regulatory immune responses mounted by recipients.

Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

Delayed-type hypersensitivity response (DTH) is a rapid in vivo manifestation of T cell-dependent immune response to a foreign antigen (Ag) that the host ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&amp;#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to the frequent failure of traditional antibiotic treatments. Alternative therapeutics are urgently needed to tackle MDR bacteria.
An innovative non-antibiotic approach, antimicrobial blue light (aBL), has shown promising effectiveness against MDR infections. The mechanism of action of aBL is not yet well understood. It is commonly hypothesized that naturally occurring endogenous photosensitizing chromophores in bacteria (e.g., iron-free porphyrins, flavins, etc.) are excited by aBL, which in turn produces cytotoxic reactive oxygen species (ROS) through a photochemical process.
Unlike another light-based antimicrobial approach, antimicrobial photodynamic therapy (aPDT), aBL therapy does not require the involvement of an exogenous photosensitizer. All it needs to take effect is the irradiation of blue light; therefore, it is simple and inexpensive. The aBL receptors are the endogenous cellular photosensitizers in bacteria, rather than the DNA. Thus, aBL is believed to be much less genotoxic to host cells than ultraviolet-C (UVC) irradiation, which directly causes DNA damage in host cells.
In this paper, we present a protocol to assess the effectiveness of aBL therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in a mouse model of burn injury. By using an engineered bioluminescent strain, we were able to noninvasively monitor the extent of infection in real time in living animals. This technique is also an effective tool for monitoring the spatial distribution of infections in animals.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Infections caused by multidrug-resistant (MDR) bacterial strains have emerged as a serious threat to public health, necessitating the development of alternative therapeutics. We present a protocol to evaluate the effectiveness of antimicrobial blue light (aBL) therapy for MDR Acinetobacter baumannii infections in mouse burns by using bioluminescence imaging.

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy per la multi-resistente baumannii Acinetobacter Masterizzare Infezioni Utilizzando bioluminescenza Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients with autoimmune hepatitis. The overwhelming majority of patients with DIH are women. The underlying mechanisms of these sex differences in prevalence are unclear because of the paucity of animal models that mimic human disease. Even so, underlying mechanisms are widely believed to be associated with human leukocyte antigen haplotypes and sex hormones. In contrast, using a DIH mouse model, we have uncovered that IL-4 initiated&#160;CD4+ T cells directed against an epitope of cytochrome P450 2E1 induces influx of neutrophils, macrophages and mast cells into the livers of female BALB/c mice. Using this model, we have also shown that IL-33-induced FoxP3+regulatory T cells confer protection against DIH in female and male mice. This DIH model is induced by immunizing mice with an epitope of CYP2E1 that has been covalently altered with a drug metabolite that has been associated with DIH. This epitope is recognized by patients with DIH. Our method induces robust and reproducible hepatitis and autoantibodies that can be utilized to study the pathogenesis of DIH. While in vivo studies can cause undue pain and distress in mice when done improperly, the advantage of an in vivo model is the ability to evaluate the pathogenesis of disease in a large number of mice. Additionally, biological effects of the altered liver proteins can be studied using invasive procedures. The addition of in vitro studies to the experimental design allows rapid repetition and mechanistic analysis at a cellular level. Thus, we will demonstrate our model protocol and how it can be utilized to study in vivo and in vitro mechanisms of DIH.

We describe an in vivo immunization, translational hepatitis model in BALB/c mice that can be utilized to study the pathogenesis of drug-induced autoimmune hepatitis including sex differences seen in this disease. We will describe how this model demonstrates reproducible analyses using in vivo and in vitro experimental techniques.

Induzione dell'epatite autoimmune indotta da farmaci in topi BALB / c per lo studio dei suoi meccanismi patogenetici

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in vitro per valutare la potenza del vaccino contro la rabbia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.