Creazione di chimere del proencefalo aviario per valutare lo sviluppo facciale

Questo metodo consente ai ricercatori di valutare le interazioni tissutali tra il proencefalo basale e il viso. Il vantaggio principale di questa tecnica è che isola il proencefalo basale per la valutazione e previene la contaminazione con le cellule della cresta neurale, che confonderebbe l'analisi. La parte difficile di questa tecnica è la rimozione del proencefalo dall'ospite e la sostituzione con il tessuto donatore.

A dimostrare la procedura sarà Diane Hu, ricercatrice del laboratorio del Dr.Ralph Marcucio. Per iniziare, preparare i supporti DMEM con rosso neutro, una pipetta di trasferimento del vetro e tungsteno affilato. Utilizzando una siringa da 10 millilitri e un ago da 18 gauge, rimuovere 0,5 millilitri di albumina dall'estremità appuntita del guscio d'uovo.

Fai un piccolo foro sopra il guscio usando la punta delle forbici. Quindi posizionare un pezzo di nastro adesivo sopra il foro e tagliare un'apertura circolare per esporre l'embrione. Macchia l'embrione con rosso neutro.

Raccogliere innesti di tessuto dal lato sinistro del proencefalo basale degli embrioni allo stadio sette o otto. Utilizzare aghi di tungsteno affilati curvi per incidere delicatamente un pezzo del proencefalo. Per non includere l'endoderma sottostante, far scorrere l'ago sotto il proencefalo e parallelamente all'asse del tubo neurale.

Prelevare l'innesto dall'embrione donatore usando la pipetta di trasferimento di vetro e trasferirlo in DMEM contenente rosso neutro per due minuti per colorarlo. Quindi posizionare l'innesto colorato in DMEM che non contiene rosso neutro fino a quando non è pronto per l'attecchimento. Incubare le uova fecondate dal pollo bianco livornese a 37 gradi Celsius in una camera umidificata fino alla settima all'ottava tappa di Hamburger-Hamilton.

Esporre gli embrioni come precedentemente dimostrato. Utilizzando aghi di tungsteno affilati, preparare il sito di innesto tagliando e quindi rimuovendo un pezzo di proencefalo basale di 0,3 x 0,2 millimetri per accogliere l'innesto. Evitare un'eccessiva interruzione dell'endoderma sottostante, che sarà evidente poiché i granuli di tuorlo inizieranno a fuoriuscire attraverso qualsiasi lacrima fatta.

Dopo aver trasferito l'innesto all'ospite, posizionare l'innesto per sostituire il proencefalo basale estirpato dell'ospite. Posizionare del nastro adesivo strettamente sopra il foro e restituire gli embrioni all'incubatore a 37 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'analisi. Inizialmente, le chimere sono state create trapiantando tessuti di quaglia in embrioni di pulcino.

Utilizzando l'anticorpo QCPN, le cellule di quaglia sono state visualizzate e distinte dai tessuti ospiti. Il sistema quaglia-pulcino ha confermato che tutto l'innesto era costituito solo da tessuto neurale e non era contaminato da altri tipi di cellule. Il trapianto di tessuto di quaglia in embrioni di anatra ha portato a chimere gravemente deformate a causa di un cervello di quaglia in rapido sviluppo.

Pertanto, è stato eseguito il trapianto di tessuti di anatra in embrioni di pollo. Le chimere risultanti anatra-pulcino suggeriscono che il cervello partecipa alla regolazione della morfologia. L'ibridazione C2 dell'intera montagna è stata utilizzata per valutare l'espressione del riccio sonico nelle chimere.

Simile alla morfologia, l'espressione del riccio sonico sul lato dell'anatra della chimera appariva più simile a un'anatra. La preparazione del sito ospitante richiede pratica. Un gran numero di embrioni non sopravvive, quindi la creazione di un gran numero di chimere può aiutare a garantire campioni adeguati per l'analisi.

Questo metodo ha permesso di valutare come i segnali provenienti dal cervello modellano il dominio di espressione del riccio sonico nella zona ectodermica frontonasale.