Il lavoro è stato supportato anche da finanziamenti Helse og rehabilitering (JLB), il norvegese Research Council (GH e JCG) e l&#39;Università di Oslo (NK e JCG).

1. Isolamento e la coltura di cellule staminali umane e la preparazione per l&#39;iniezione in embrioni <ol><li> Le cellule staminali umane utilizzate come esempi di questo protocollo (cervello, adiposo, midollo osseo) sono isolati in modo diverso dai diversi tessuti. Per esempio, cellule staminali neurali adulte vengono isolate dai pezzi di tessuto raccolti dalla parete del ventricolo del cervello durante la neurochirurgia endoscopica, che sono poi dissociate alle singole celle che vengono coltivate in vitro. Le cellule staminali neurali formano spontaneamente neurosfere che galleggiano nel mezzo di coltura, mentre altri tipi di cellule aderire al fondo del piatto 7. Derivate da tessuto adiposo cellule staminali mesenchimali sono ottenuti da materiale liposuzione che è enzimaticamente digerito e tese a rimuovere il tessuto fibroso e poi centrifugato per rimuovere adipociti maturi. Le cellule risultanti sono risospese in terreno di coltura integrato con siero di promuovere la proliferazione delle cellule staminali in altri tipi di cellule staminali emopoietiche e 8 cellule progenitrici possono essere isolati da aspirati di midollo osseo da una selezione positiva utilizzando anticorpi specifici coniugati con particelle magnetiche (Myltenyi Biotec, Germania o Dynal-Invitrogen, USA) e la separazione delle cellule magnetiche e / o utilizzando anticorpi coniugati con fluorofori e fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) 9. </li><li> Per facilitare la successiva identificazione, etichetta le cellule staminali con un marcatore fluorescente prima dell&#39;impianto in embrioni di pollo. Le cellule staminali possono essere etichettati con coloranti fluorescenti lipofili come DII (Invitrogen, USA) o PKH26 (Sigma, USA) utilizzando protocolli di fornitore-raccomandato fino a poco prima dell&#39;impianto, o, per una etichetta permanente essenzialmente alcun pericolo di cellule ospiti contaminanti, possono essere trasdotte con il gene di una proteina fluorescente come proteina fluorescente verde, utilizzando vettori lentivirali, pur nella cultura 10. </li><li> Protocolli per la cultura e la propagazione delle cellule staminali umane possono variare. Protocolli dettagliate sono disponibili in letteratura. Brevemente, una sfera che formano le cellule staminali sono tipicamente coltivate in fiasche, mentre le cellule staminali aderenti sono tipicamente coltivate in piastre di Petri (che facilitano la triturazione quando spacca, vedi sotto), in mezzo adeguato. Per la suddivisione o la raccolta, pellet sfera che formano le cellule del 5 centrifugazione min a 1200rpm e risospendere in pre-riscaldato tripsina / EDTA soluzione per non più di 5 minuti a 37 gradi Celsius. Per le cellule aderenti aggiungere la tripsina / EDTA soluzione alla capsula di Petri, e triturare alla fine di 5 minuti. Terminare il tripsinizzazione con l&#39;aggiunta di Ca 2 + mezzo contenente, a volte completati con l&#39;albumina. Per rimuovere la tripsina / EDTA, centrifugare le cellule (5 min a 1200rpm), rimuovere il surnatante, risospendere in veicolo di iniezione a freddo (in genere medio o PBS), e centrifugare di nuovo (5 min a 1200rpm). Rimuovere la maggior parte di questo supernatante e risospendere delicatamente le cellule per creare una sospensione di cellule altamente concentrato. </li><li> Mantenere la sospensione di cellule staminali umane in una piccola fiala innevate o provetta da microcentrifuga in ghiaccio per diverse ore prima dell&#39;iniezione. Sopravvivenza in questo stato può essere di tipo cellulare-dipendente. Il veicolo iniezione deve essere ottimizzato in base alle proprietà delle cellule, comprese le loro adesività (ad esempio un basso Ca 2 + veicolo può aiutare a prevenire grumi) e resistenza alle variazioni di ipossia e pH. </li></ol> 2. Uovo di incubazione e di preparazione <ol><li> Conservare le uova fecondate in una camera di raffreddamento (per esempio: Termaks, Bergen, Norvegia) a 14-15 ° C prima dell&#39;incubazione. A questo sviluppo temperatura è arrestato fino a quando inizia l&#39;incubazione. Uova fecondate conservati per più di 10 giorni a temperature più basse hanno un tasso più basso di successivo sviluppo e la sopravvivenza. </li><li> Rilanciare lo sviluppo, posto le uova in una umidificata, tiraggio forzato incubatore (ad esempio: Binder, New York, USA) a 38-39 ° C, e incubare fino alla fase di sviluppo desiderato è raggiunto (per la stadiazione, vedi rif 11. ). </li><li> Prima di aprire l&#39;uovo, creare una sacca d&#39;aria sopra l&#39;embrione con l&#39;inserimento di un 18 ago della siringa calibro attraverso il guscio dell&#39;uovo (non troppo in profondità per evitare di forare il tuorlo) e l&#39;evacuazione 4 ml di albumina (Fig. A). Questo crea una caduta di pressione che in pochi minuti è pareggiato con l&#39;entrata di aria attraverso il guscio poroso. Come l&#39;aria entra raccoglie nel punto più alto all&#39;interno del guscio, separando così l&#39;embrione dalla superficie interna del guscio. </li><li> Sigillare il foro creato dal l&#39;ago della siringa con nastro di plastica convenzionale. </li></ol> 3. Tirare micropipette di vetro <ol><li> Tirare micropipette di vetro con vetro al borosilicato (per esempio, 1,2 OD x 0,94 mm ID, Harvard Apparatus, USA) su un elettrodo estrattore convenzionale (per esempio, modello P-2000, Sutter Instruments, USA). Regolare le impostazioni estrattore di ottenere micropipette che hanno elevata resistenza d&#39;ingresso quando viene utilizzato come Microelectrodes. Suggerimenti dovrebbe essere di circa 1-1,5 cm di lunghezza. Gli alberi possono essere contrassegnati ad intervalli di 1 mm per il calcolo dei volumi espulso. </li><li> Rompere le punte micropipetta a una dimensione praticabile piegando con una pinza o spingere contro una superficie solida durante la visualizzazione al microscopio. La rottura deve essere il più uniforme possibile in tutto il perimetro del vetro e il diametro interno conseguente alla punta dovrebbe adattarsi alle dimensioni delle cellule per essere utilizzato senza essere ostruiti. Tipicamente di 20-30 micron di diametro interno funziona bene. </li></ol> 4. Preparazione di Fast soluzione colorante verde (reagente di contrasto) <ol><li> Preparare una soluzione allo 0,1% (w / v) di Fast colorante verde (Sigma-Aldrich, USA), sciogliendo in soluzione salina fisiologica di pollo (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na- fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4). </li><li> Filtrare la soluzione rapida verde attraverso un micron 0,22 Millex GP filtro (Co. Millipore, Bedford, USA). </li></ol> 5. Aprendo le uova e contrastanti l&#39;embrione <ol><li> Inserire due pezzi di nastro sulla parte superiore dell&#39;uovo, che copre le dimensioni della sacca d&#39;aria. Mantenere l&#39;uovo orientato in modo che l&#39;area registrato (e quindi la camera d&#39;aria) è più alto, tagliare una piccola finestra all&#39;interno dei confini dell&#39;area registrato utilizzando un paio di forbici dissezione robusto. Il nastro aggiunge il supporto e aiuta a prevenire i frammenti cadano sul guscio l&#39;embrione. Le bolle d&#39;aria associata alla sacca d&#39;aria possono essere estratti con il back-end di un puntale di plastica o altri sonda smussato. </li><li> Disegnare una soluzione rapida verde in una siringa da 1 ml con un ago da 25 gauge. Rimuovere eventuali bolle d&#39;aria nella siringa e l&#39;ago. Piegare l&#39;ago in un angolo di 45 gradi, penetrare in un punto al di fuori della piastra embrionale (identificata con l&#39;anello dei vasi sanguigni che lo circoscrivono, penetranti all&#39;interno della mortalità embrionale aumenta la piastra) e con attenzione guidare il ricamo sotto l&#39;embrione. Iniettare il colorante fino a contrasto desiderata. L&#39;embrione, che normalmente è trasparente, dovrebbe stare fuori come un fantasma biancastro contro il colore verde scuro (Fig. B). Molti ricercatori utilizzano inchiostro di china (diluito al 10% v / v) al posto di Green veloce. In questo caso è importante utilizzare inchiostro di china che non è tossico, come inchiostro Pelikan Fonte India. </li></ol> 6. Fare romboencefalo e del midollo spinale, le lesioni del tubo neurale <ol><li> Produrre aghi affilati tungsteno di fiamma incisione breve (2-3 cm), pezzi di 100 micron di diametro asta di tungsteno (numero di catalogo 719000, A &amp; R Sistemi, Seattle, Washington), con un acetilene / ossigeno torcia. Questo viene fatto inserendo la fine dell&#39;asta molto brevemente in la fiamma fino a quando una scintilla si vede, che rappresenta l&#39;erosione esplosivo degli strati esterni di tungsteno, lasciandosi dietro una punta acuminata. </li><li> Utilizzando un affilato ago di tungsteno, fendere e deviare la membrana vitellina che copre la zona per microchirurgia. </li><li> Utilizzando un secondo ago di tungsteno appuntito (la punta dell&#39;ago prima è spesso danneggiato dopo il taglio attraverso la membrana vitellina e non adatto per microchirurgia successive), tagliare con cura attraverso l&#39;epitelio sovrastante il tubo neurale e deviare, poi tagliato intorno e sotto il pezzo del tubo neurale da rimuovere, con tratti brevi e rapidi verso l&#39;alto (Figura C). Fare i tagli trasversali e poi i tagli longitudinali è di solito di maggior successo. Non tagliare troppo in profondità o si rischia di penetrare i vasi sanguigni sottostanti, che in genere è fatale. </li><li> Capovolgere dolcemente o trascinare il pezzo di tessuto asportato dal sito della lesione utilizzando l&#39;ago di tungsteno. Se questo si rivela difficile, ma può anche essere rimosso mediante aspirazione bocca utilizzando una micropipetta di vetro attaccato al tubo flessibile. </li></ol> 7. Iniezione di cellule staminali umane a. L&#39;iniezione in una lesione del tubo neurale Disegnare una piccola quantità di cellule nella punta di una micropipetta di vetro dalla bocca di aspirazione con un tubo di plastica. La concentrazione di lavoro della sospensione cellulare deve essere ottimizzato per il tipo di cellule da iniettare. Montare la micropipetta su un micromanipolatore e collegarlo ad una pompa microinjector (ad esempio: PV830 PicoPump pneumatico, WPI, Washington, USA). Sotto controllo visivo utilizzando un microscopio dissezione, guida la punta micropipetta nella lesione ed espellere attentamente le cellule, aumentando la pressione dell&#39;aria (sia da impulsi di pressione costante o per dilagare gradualmente la pressione) (Figura C). Quando la quantità desiderata di cellule si deposita all&#39;interno del sito della lesione, con attenzione ritirare la micropipetta. b. Iniezione nel lume del tubo neurale In alcuni casi può essere desiderabile per iniettare le cellule nei ventricoli sviluppo cerebrale, per esempio se le cellule sono invasivi sufficienti per accedere al tessuto nervoso, in assenza di lesioni. L&#39;iniezione di cellule nel lume di brain regione richiede l&#39;utilizzo di una fase di sviluppo in cui il lume fornisce un recipiente abbastanza grande, ed è facilmente raggiungibile; fasi HH 12-18 sono favorevoli a questo proposito. Una lesione non è necessario. Basta forare la parete del tubo neurale con la micropipetta di vetro prima dell&#39;iniezione di cellule. Gli elementi chiave per il successo di questo metodo sono la nitidezza della micropipetta e la repentinità della penetrazione, troppo lento il movimento e la punta micropipetta può fossetta la parete del tubo neurale senza penetrare. c. Iniezione sistemica Iniezioni sistemica può essere effettuato tramite l&#39;extra-embrionali vasi sanguigni (a partire dalla fase HH 15, quando i pescherecci ben sviluppate). Questo non è raramente accompagnata da alcuni sanguinamento e poiché ci sono molte piccole arterie e vene meno grandi, iniezioni intra-arteriosa sono generalmente più sicuri quando si tratta di sopravvivenza dell&#39;embrione. D&#39;altra parte, le iniezioni endovenose di fornire un accesso più rapido delle cellule al cuore e quindi probabilmente una distribuzione più uniforme delle celle. Una iniezione di successo richiede una micropipetta tagliente con un diametro più piccolo del vaso bersaglio. Approccio della nave lungo il suo asse in un piccolo angolo rispetto al piano orizzontale (circa 30 gradi). Spingere la micropipetta nei confronti della nave fino a quando la nave inizia ad occludere. Quindi spingere ulteriormente in un movimento deciso, brusco da penetrare. Ritrarre lentamente fino a quando il sangue è visto di disegnare per azione capillare nella punta della micropipetta. L&#39;iniezione di cellule dovrebbero poi essere eseguiti usando una pressione costante, dopo di che la micropipetta è ritratta con un movimento rapido. 8. Tenuta l&#39;uovo <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, lasciate l&#39;uovo stare fermo per alcuni minuti per consentire le cellule iniettate di stabilirsi e di aderire. Per evitare la disidratazione (che può verificarsi rapidamente e può risultare fatale), giaceva un pezzo di tessuto inumidito o carta da filtro sopra la finestra durante questo periodo di riposo. </li><li> Dopo pochi minuti e le cellule si sono stabiliti, a secco il guscio attorno alla finestra e sigillare la finestra con nastro di plastica convenzionale. Assicurarsi che questo sigillo è stretto e che non albumina può fuoriuscire attraverso l&#39;apertura o tra il serbatoio e il nastro (questo si rivela spesso fatale durante l&#39;incubazione successive). </li><li> Sostituire le uova per la ventilazione forzata incubatore per un ulteriore sviluppo. L&#39;osservazione può essere fatta ad intervalli rimuovendo il nastro sopra la finestra. </li></ol> 9. Embrione dissezione <ol><li> Una volta che l&#39;embrione ha raggiunto la fase desiderata, crack aprire l&#39;uovo in una ciotola di ghiaccio freddo soluzione fisiologica o PBS (il nastro che copre la finestra deve essere tagliato prima a permettere le due metà del guscio d&#39;uovo per separare). Il ghiaccio-freddo salina serve per anestetizzare il bimbo con l&#39;ipotermia. Il cuore deve rapidamente rallentare e fermarsi in un paio di minuti. </li><li> Separare l&#39;embrione dalle membrane extraembrionali e lo stadio lo si utilizza rif. 11. </li><li> Decapitare l&#39;embrione, il trasferimento ad un piatto dissezione che ha un pavimento in gomma di silicone e soluzione fisiologica ossigenata contiene integrato con glucosio (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-fosfato, 5 HEPES mM, 11 mM glucosio, pH 7,4) e il pin è veloce lato ventrale in su. Rimuovere i visceri addominali e toracici. Utilizzando un forbici angolato, fare incisioni longitudinali lungo ogni aspetto ventrolaterale della colonna vertebrale. Soprattutto nelle fasi successive (dopo giorno 6 di sviluppo), l&#39;incisione iniziale è meglio del made in regione lombo-sacrale in cui lo spazio tra le vertebre e il midollo spinale è maggiore. Rimuovere l&#39;aspetto ventrale della colonna vertebrale per rivelare il midollo spinale. Assicurarsi che la soluzione fisiologica rimane ossigenata dalle bolle a circa 10 minuti con intervalli di puro ossigeno medicale. </li><li> Accuratamente tagliato le radici dorsali e ventrali nascente su entrambi i lati, transetto il midollo spinale a livello desiderato, e delicatamente sollevarlo fuori dal canale vertebrale. Il midollo spinale sopravviverà per molte ore in questo stato e può essere sottoposto a 12 anatomiche e fisiologiche 13,14 esperimenti. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2071/2071fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A) L&#39;approccio giusto per l&#39;evacuazione di albumina. Notare la posizione dell&#39;embrione e il posizionamento dell&#39;ago. B) In contrasto dell&#39;embrione. Notare il punto di penetrazione dell&#39;ago al di fuori del disco embrionale. C) Rappresentazione schematica della procedura di lesione spinale unilaterale del tubo neurale seguita da trapianto di cellule.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;embrione di pollo è un modello animale comodo e versatile per gli esperimenti di xenotrapianto. La mancanza di un funzionale sistema immunitario durante lo sviluppo embrionale e fetale permette la sopravvivenza e lo sviluppo delle cellule di qualsiasi specie che tollera la temperatura di incubazione. Embrioni di pollo sono stati utilizzati per testare il potenziale rigenerativo di vari tipi di cellule staminali (recensione in rif. 15). Le cellule staminali dei mammiferi in grado di integrare nei tessuti embrionali di pollo compreso il sistema nervoso centrale, dove possono dare origine ai neuroni la cui assonale proiezioni, connettività sinaptica e le proprietà elettrofisiologiche possono essere valutate nel contesto funzionale di 1,2 circuiti neurali. Perché le procedure chirurgiche sono relativamente facili, e le iniezioni sono fatte sotto visive al posto di controllo stereotassico, il numero di embrioni può essere facilmente aumentata a ospitare diverse condizioni sperimentali all&#39;interno di un singolo esperimento. Tipicamente le cellule possono essere iniettato in 20-30 embrioni nell&#39;ambito di un esperimento di 4 ore. Il post-iniezione di mortalità degli embrioni è il principale fattore limitante. Devono essere prese precauzioni per evitare emorragie e disidratazione. Siate consapevoli che ci sono alcune fasi critiche di sviluppo in cui il tasso di mortalità naturale aumenta. Completa l&#39;embrione con pochi ml di caldo, l&#39;iniezione di pollo sterilizzato suoneria seguito e il giorno prima critica fasi di sviluppo, oltre ad assicurare che la finestra nell&#39;uovo è ben chiusi e ben orientata a evitare perdite, migliora la sopravvivenza. Se la perdita attraverso il nastro di sigillo dovesse accadere, rimuovere il nastro, asciugare le superfici e ri-nastro. Alcuni ricercatori uso cera e vetro o plastica coprioggetto per sigillare la finestra. La mortalità non dovrebbe essere sostanzialmente diversi in iniettato contro sham-operati embrioni. Anche se ci siamo concentrati qui l&#39;iniezione di cellule staminali umane nel anlage del cervello e del midollo spinale, le cellule staminali possono essere iniettate nel anlage di altri organi (vedi per esempio rif. 4). Ogni organo pone le proprie sfide. Per esempio, l&#39;iniezione nel cuore può essere difficile a causa della elevata resistenza meccanica alla penetrazione e pipetta a causa di movimenti, che invece può essere rallentata da un raffreddamento degli embrioni a temperatura ambiente prima dell&#39;iniezione. Organi che mancano di un lume non può accogliere l&#39;iniezione di volumi sufficienti e possono quindi richiedere lesione chirurgica per creare un recipiente. Nella nostra esperienza, post-lesione rigenerazione dei tessuti è un vantaggio perché promuove l&#39;integrazione delle cellule staminali umane nel tessuto. Le cellule possono anche essere iniettato nel mesenchima embrionale come il mesenchima disperdere somitic o la cresta neurale migrazione come un modo per raggiungere l&#39;incorporazione in derivati ​​mesenchimali, tra cui cresta neurale derivata gangli periferici 16,17.

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<td>Fluorescent microscope</td>
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<td>Olympus IX-81</td>
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<td>Stereo Investigator</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
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<td>Mice</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mathematica</td>
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<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Image J</td>
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<td>NIH</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slidebook</td>
<td>Program</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo

L&#39;embrione di pollo è un classico modello animale per studiare il normale sviluppo embrionale e fetale e per gli esperimenti di xenotrapianto di studiare il comportamento delle cellule in una forma standardizzata<em&gt; In vivo</em&gt; Ambiente. I principali vantaggi di un embrione di pollo sono a basso costo, l&#39;accessibilità, facilità di manipolazione chirurgica e la mancanza di un sistema immunitario completamente sviluppato. Lo xenotrapianto in embrioni di pollo in grado di fornire informazioni preziose sulla proliferazione cellulare, la differenziazione e il comportamento, le risposte delle cellule di segnali in definizione nicchie tessuti embrionali, e il potenziale oncogeno. Trapianto di cellule in embrioni di pollo può essere anche un passo verso esperimenti di trapianto in altri modelli animali. Recentemente l&#39;embrione di pollo è stato utilizzato per valutare il potenziale di neurogena staminali umane e cellule progenitrici dopo l&#39;impianto in anlage neurale<sup&gt; 1-6</sup&gt;. In questo video documentiamo l&#39;intera procedura per il trapianto di cellule staminali umane nel sviluppo del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. La procedura inizia con l&#39;incubazione delle uova fecondate fino embrioni di età desiderata si sono sviluppate. Il guscio viene quindi aperto, e l&#39;embrione contrastato da iniettare mezzo di contrasto tra l&#39;embrione e il tuorlo. Piccole lesioni sono realizzati in tubo neurale mediante microchirurgia, creando un luogo di rigenerazione per la deposizione delle cellule che promuove la successiva integrazione nel tessuto ospite. Dimostriamo iniezioni di cellule staminali umane in tali lesioni fatte nella parte del tubo neurale che forma il romboencefalo e il midollo spinale, e nel lume della parte del tubo neurale che forma il cervello. Iniezioni sistemiche in extraembrionali vene e le arterie sono anche dimostrato come un modo alternativo per fornire cellule ai tessuti vascolarizzati compreso il sistema nervoso centrale. Infine mostriamo come rimuovere l&#39;embrione dalle uova dopo alcuni giorni di ulteriore sviluppo e il modo di sezionare il midollo spinale libera per la successiva analisi fisiologiche, biochimiche e istologiche.

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Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

In questo articolo presentiamo un metodo per il trapianto di cellule staminali umane in varie regioni del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. Ciò fornisce un<em&gt; In vivo</emModello&gt; per valutare la proliferazione e la differenziazione dei vari tipi di cellule staminali umane negli ambienti di tessuti embrionali.

Lo xenotrapianto di cellule staminali umane in embrioni di pollo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.2K Views.  University of Oslo. In questo articolo presentiamo un metodo per il trapianto di cellule staminali umane in varie regioni del sistema nervoso centrale di un embrione di pollo. Ciò fornisce un In vivo per valutare la proliferazione e la differenziazione dei vari tipi di cellule staminali umane negli ambienti di tessuti embrionali.

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Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Trasfezione delle cellule staminali neuronali con il Nucleofector Amaxa

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

Ricerca

Biologia

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Conteggio cellule staminali neuronali

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Generazione di transgenici<em&gt; Hydra</em&gt; Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.