Riconosciamo con gratitudine finanziamenti da DARPA sponsorizzato Micro / Nano di messa a fuoco Fluidics Fundamentals (MF3) Centro con il contratto numero N66001-10-1-4003, e dal DARPA concessione N660001-09-C-2082.

1. Fisica della ITP ITP forma un confine netto in movimento tra ioni di carica simile. La tecnica può essere eseguita con campioni anionici o cationici, ma adattiamo questa introduzione alla ITP anionico e annotare gli stessi principi si applicano a ITP cationico. Abbiamo scelto buffer LE e TE LE tali che gli ioni hanno una maggiore mobilità effettiva grandezza elettroforetica. La mobilità elettroforetica efficace, μ = U / E, è la costante di proporzionalità tra campo elettrico applicato, E, e velocità di deriva ione, U. 13 Noi costituire un&#39;interfaccia diffusa tra il LE e TE e applicare un campo elettrico diretto dal alta conduttività LE zona a bassa conducibilità TE zona. Il sistema prevede rapidamente un forte gradiente di campo elettrico all&#39;interfaccia ITP, a causa della non uniforme profilo conducibilità. Come per il suo nome (dal greco &quot;isos&quot; significa &quot;uguale&quot;, &quot;takhos&quot; significa &quot;velocità&quot;), e TE LE viaggio ioni allo stesso tempo, ve uniformelocity, come conseguenza della non-uniforme campo elettrico e la conservazione di corrente (questo è il cosiddetto &quot;condizione di ITP&quot;, vedi Figura 1). L&#39;interfaccia ITP è autoaffilante: LE ioni che diffondono nell&#39;esperienza TE zona un flusso forte restauro e ritorno nella zona di attacco (e viceversa per gli ioni TE nella zona LE). Esempi di ioni a fuoco questa interfaccia se la loro mobilità efficace nella zona TE è maggiore di quelle dei TE co-ioni, e se la loro mobilità efficace nella zona LE è inferiore a quella dei co-ioni LE (vedi Figura 1). L&#39;auto-affilatura e concentrarsi proprietà di ITP contribuiscono alla robustezza di questa tecnica e rendere ITP relativamente insensibili ai disturbi di interfaccia (ad esempio a causa della pressione-driven flow o cambiamenti nella geometria, come contrazioni, espansioni, e si trasforma). In modalità di picco ITP (vedi Figura 2a e Video 1-2), concentrazioni di ioni del campione sonosempre significativamente inferiore LE e TE concentrazioni di ioni e quindi contribuire trascurabile conducibilità locale. La distribuzione di ioni del campione è determinata dalla interfaccia autoaffilante tra zone adiacenti (qui il TE e LE) e il valore della mobilità campione efficace rispetto a queste zone. 14 ioni del campione più concentrarsi nella stessa regione stretta interfaccia ITP come ampiamente sovrapposizione di picchi. Le larghezze di interfaccia e di picco, così come il fattore preconcentrazione associato, scala inversamente con la corrente applicata (vedi esperimenti in Figura 2b). 14 Per sufficientemente alte concentrazioni del campione iniziale e il tempo di accumulo sufficiente, ioni del campione raggiunge un valore di concentrazione di soglia. Per completamente ionizzati specie, tale valore è determinato dalla funzione di regolazione Kohlrausch (KRF). 15 Per elettroliti deboli, è determinata dalle funzioni Alberty e Jovin. 16,17 In plateaumodalità, come illustrato in figura 3 e Video 3, ioni del campione separare e purificare in zone di concentrazione localmente uniforme e costante in un ordine determinato dalla loro effettiva mobilità. Ioni molto diluite può concentrarsi ancora in modalità di picco tra le zone di plateau. In ITP, ioni del campione può essere introdotto in una iniezione finito tra la TE e LE (vedi figura 3) o alternativamente mescolato con il TE e / o LE (vedi Figura 2). Ci riferiamo alla miscelazione nella zona TE come iniezione &quot;semi-infinito&quot;, che può essere utilizzata per accumulare ioni analita continuo. Accumulo di campione continuo aumenta la sensibilità sia in modalità di picco e saggi di plateau. Tuttavia, le iniezioni finiti sono più comuni in modalità plateau. Ciò è probabilmente perché alte concentrazioni di analiti iniziali semi-infinito iniezione può aumentare notevolmente la conducibilità TE e minori tassi di messa a fuoco. Inoltre, la purificazione completa non è possibile in semi-infinita di iniezione (poiché non vi remains una concentrazione finito in TE). 2. Dispositivo di pulizia e preparazione Per i saggi presentati in questo protocollo usiamo isotropicamente wet-inciso (sezione trasversale approssimativamente a forma di D) chip vetro microfluidici con cross-channel disegno (vedi Figura 1). La pulizia e la seguente protocollo di preparazione è ottimizzato per i canali di silice borosilicato e fuso, ma può anche essere utilizzata con vetro / PDMS chip. Eseguire questa procedura di pulizia prima di esperimenti per garantire run-to-run ripetibilità e la corretta applicazione di rivestimenti dinamici necessari per sopprimere flusso elettroosmotico (EOF). L&#39;omissione di questo protocollo può causare una forte dispersione di interfaccia ITP 14. <ol><li> Per decontaminare il canale, riempire la Nord, Est, Sud e serbatoi con il 10-20 microlitri di candeggina al 10%, applicare il vuoto nel serbatoio Occidente per 2 min. Se si utilizza uno standard Pinza chip di caddy, il vuoto può essere efficacemente applicato semplicemente attaching l&#39;estremità larga di una microlitri 200 (filtrato) punta della pipetta al serbatoio chip e collegando la linea di vuoto ad un tubo di 2 mm di diametro interno. </li><li> Svuotare i serbatoi e risciacquare il canale (come nel passaggio 1) con idrossido di sodio 1 M per 2 min. Questo incide delicatamente le pareti del canale, ottenendo una superficie pulita borosilicato per aiutare a stabilire proprietà di superficie uniformi. </li><li> Svuotare i serbatoi e pulito con acqua deionizzata (DI), quindi sciacquare il canale con LE per ~ 2 min. Durante questo periodo le proprietà superficiali e rivestimenti dinamici equilibrate all&#39;interno del canale. </li></ol> 3. Fluoroforo messa a fuoco in modalità di picco ITP <ol><li> Preparare 1 mL LE costituito da 100 mM HCl, 200 mM tris, e 1% PVP. </li><li> Preparare 1 mL TE costituito da HEPES 100 mM e 200 mM di tris. Unire 90 microlitri di TE con 10 microlitri di 1 pM Alexa Fluor 488 (AF488). </li><li> Dopo aver sciacquato con LE come descritto nella parte 2, svuotare il serbatoio Occidente e pulire un paio di volte con DI oder per diluire qualsiasi LE rimanente nel serbatoio. Riempire questo serbatoio con 20 microlitri TE contenente AF488. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo positivo nel bacino orientale e la terra (negativo) elettrodo nel serbatoio Occidente e applicare 2 μA (corrente costante). Il picco campione migreranno ad una velocità costante dal serbatoio al serbatoio Ovest-Est (vedi figura 1) e la tensione tra questi serbatoi aumenterà come minore è la conducibilità TE riempie il canale. </li></ol> 4. Estrazione e purificazione di acidi nucleici da coltivate E. coli La capacità di concentrarsi selettivamente specie ioniche rende ITP una tecnica ideale per la preparazione del campione biologico. Abbiamo purificare acidi nucleici da lisato cellulare trattato selezionando un anione posteriore con una grandezza inferiore mobilità efficace l&#39;acido nucleico bersaglio, ma superiore a co-ionici inibitori della PCR (ad esempio detergenti anionici, proteine, e solventi organici, anche se presente in hiconcentrazione di gh). Cationico PCR inibitori (ad esempio metalli alcalini e proteine ​​cationiche e detergenti) migrano nella direzione opposta e così sono anche lasciato. ITP estrae e si concentra acidi nucleici bersaglio dal serbatoio del campione, lasciando più lenti PCR-inibitori specie dietro (vedi Figura 4). <ol><li> Ottenere un campione di cultura o di E. coli ad una densità superiore a 10 8 UFC / ml. </li><li> Trasferire 1 ml di coltura cellulare in una cassetta di sicurezza-lock provetta e pellet per centrifugazione a 4000g per 6 min. </li><li> Risospendere il pellet in 80 microlitri acqua priva di RNasi e aggiungere 10 ul di agente di lisi consistente di tricina 10 mM, 10 mM tris-bis, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, e 5 mg / ml lisozima. Mescolare delicatamente e incubare per 5 minuti. a temperatura ambiente (protocollo adattato da lisi Bercovici et al. 11). </li><li> Aggiungere 10 pl di idrossido di sodio 1 M per portare il pH lisato di ~ 12,5. Azionare delicatamente la pipetta su e giù finola soluzione diventa limpida, in cui lisi punto è completa. </li><li> Combinare 10 pl di lisato con 90 pl di tricina 50 mM e 100 mM bis-tris. Questa soluzione può essere utilizzato come TE. </li><li> Preparare 1 mL di LE consiste di 500 mM bis-tris, HCl 250 mM, 1% di PVP, e 1X SYBR Green II. Riempire il chip microfluidica con LE come descritto nella parte 3. </li><li> Per estrarre l&#39;acido nucleico purificato per analisi off-chip dopo ITP, sostituire il contenuto del serbatoio Oriente con un PCR-compatibile LE contenente 50 mM bis-tris, HCl 25 mM, e 0,1% di PVP. Applicare 1000 V tra Oriente e Occidente pozzi per iniziare l&#39;esperimento. La corrente tra questi serbatoi diminuirà. </li><li> Al termine dell&#39;esperimento il campione eluisce nel serbatoio LE. In coincidenza con questo eluizione, il tempo contro corrente per questo sistema raggiunge tipicamente un valore di plateau (perché la resistenza è ora dominato da ioni TE uniformemente distribuiti nel canale). Mescolare delicatamente il serbatoiocontenuto di pipettaggio ripetuto ed estrarre un volume di 5 microlitri per analisi mediante RT-PCR quantitativa. </li></ol> 5. Separazione di amminoacidi con ITP cationico modalità plateau e non-focalizzazione tracciante (NFT) per la visualizzazione ITP possono essere utilizzati per separare e concentrare piccoli ioni in altipiani adiacente e rilevabile tra la TE e LE. Ciò consente la rilevazione e l&#39;identificazione sulla base delle proprietà fisico, come conducibilità locale, assorbanza UV, rilevamento della temperatura, o indice di rifrazione. Qui mostriamo un non-focalizzazione tracciante (NFT) test dove viene aggiunta una fluorescente, co-ionico specie al LE. Questa specie fluorescenti non si concentra, ma la sua concentrazione adatta ad un campo elettrico locale, rendendo così possibile la visualizzazione delle zone di plateau purificati (vedi figura 5). <ol><li> Preparare 1 mL LE costituito da etanolammina 100 mM, 200 mM tricina, e 1% di PVP, e 100 pM di 6G cationico Rodamina fluoroforo. </li> &lt;li&gt; Preparare 1 mL TE costituito da 20 mM Tris, 40 mM tricina. Preparare campioni miscelando 90 pl di TE con 10 pl ciascuno di 50 mM di arginina e lisina 50 mM. </li><li> Dispensare 20 LE ul in Occidente e serbatoi Nord e campione nel serbatoio Oriente. Applicare il vuoto al serbatoio del Sud per 1 min. </li><li> Sciacquare bene con l&#39;Oriente e sostituirlo con DI TE (TE senza campione). </li><li> Applicare 500 V tra Oriente e Occidente serbatoi. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Noi mostriamo isotachopherograms di esperimenti modalità di picco in figura 2b e esperimenti estrazione dell&#39;acido nucleico in figura 4. In esperimenti modalità di picco con un reporter fluorescente (es. AF488, SYBR Green II), l&#39;intensità globale fluorescenza possono essere integrati e confrontati con una curva di taratura per ottenere informazioni quantitative concentrazione. 12 Inoltre, in esperimenti di estrazione degli acidi nucleici, campione è consentito eluire in tegli LE serbatoio ed estratta con una pipetta per l&#39;analisi mediante RT-PCR quantitativa. 10,12 Mostriamo isotachopherograms modalità plateau di separazione amminoacido in figura 5. Intensità di fluorescenza (rispetto alla LE o TE intensità zona) può essere utilizzato per l&#39;identificazione di zona, mentre le larghezze zona di abilitazione quantificazione. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig1.jpg" /> Figura 1. Isotachophoresis (ITP) è una tecnica elettrocinetico utilizzata in applicazioni microfluidiche per una rivelazione sensibile e la separazione di ioni. ITP offre separazione, messa a fuoco selettiva, e capacità di preconcentrazione. Inoltre, è estremamente robusta e insensibile ai disturbi fisici causa della sua natura autoaffilante. Esempi di ioni selettivamente concentrarsi tra un elettrolita leader (LE) e finali (TE) e viaggiano attraverso il microcanale ad una velocità costante determinata dalla velocità degli ioni principali nella zona LE. Esempi di ioniconcentrarsi se la loro mobilità effettiva per elettroforesi è racchiuso tra l&#39;effettiva mobilità degli ioni e TE LE. Lo schema rappresenta un esperimento ITP modello in cui campione si concentra continuamente tra la LE e le zone TE. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig2.jpg" /> Figura 2. Diluire il campione in ioni di messa a fuoco &quot;picco modalità&quot; ITP. a) due distinti diluito (c campione &lt;&lt; LE c) messa a fuoco specie in modalità di picco a livello di interfaccia formata tra la LE e le zone TE. Solamente il LE e TE determinare il campo elettrico, come specie di esempio non contribuiscono in maniera significativa corrente. Ioni del campione sono mescolati con TE (in un semi-iniezione infinito) e si concentrano insieme in un picco approssimativamente gaussiana all&#39;interfaccia ITP. Messa a fuoco criterio (indicato come disuguaglianze) si applica a specie fortemente ionizzati. b) Gli esperimenti mostrano Alexa Fluor 488 (AF488) si è concentrato in modalità di picco per una serie di correnti applicate (vedi anche Video 1). Picco larghezza del campione è inversamente proporzionale alla corrente (per trascurabile dispersione advective causa flusso elettroosmotico). 14 L&#39;interfaccia autoaffilante è resistente alla dispersione a causa della pressione-driven flusso (vedere Video 2). <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig3.jpg" /> Figura 3. Ioni di campione ad una concentrazione sufficientemente elevata attenzione in modalità &quot;plateau&quot; e governare conducibilità locale. Noi di solito introdurre ioni del campione in una iniezione finita tra la TE e LE. In questa modalità, gli ioni del campione separato e ordine in base alla loro mobilità elettroforetica efficace (vedi Video 3). Per specie fortemente ionizzato, il TE e plateau concentrazioni zone sono determinate dalla funzione di regolazione Kohlrausch (KRF, un insieme invariante inizialmente dalla zona LE). Diluire ioni continuerà a concentrarsi in modo picco tra bracketing plateau zone la loro mobilità efficace. Messa a fuoco criterion (mostrato come le disuguaglianze) si applica a specie fortemente ionizzati. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig4.jpg" /> Figura 4. LISATO preparazione e estrazione degli acidi nucleici con ITP modalità di picco. L&#39;acido nucleico viene estratto da E. coli coltura cellulare utilizzando il lisozima assistita lisi alcalina e purificato da elettroforetica messa a fuoco selettiva via ITP. TE miscelato con lisato (marrone) contiene acido nucleico bersaglio (verde), proteine, e potenziali inibitori PCR-chimiche. Selezione appropriata di finale e che porta gli ioni permette di messa a fuoco selettiva di acido nucleico bersaglio, lasciando dietro di inibitori della PCR. Totale picco dell&#39;acido nucleico ITP assume spesso un non-forma ideale, come mostrato nell&#39;immagine qui incasso. Come dimostrazione di questo test, abbiamo estratto totale di acido nucleico da batteri gram-negativi, Escherichia coli (lisati con una soluzione di idrossido di sodio da solo), purificato dal lisato NA utilizzando ITP, raccoltiestratto il materiale genetico, ed eseguito RT-PCR analisi per verificare la purificazione successo di 16S rRNA (rosso) e 16S rDNA (verde) da coltura batterica. Negativi cicli di controllo soglia per 16S rRNA (blu) e 16S rDNA (giallo) sono stati sopra ogni 30 cicli. Abbiamo eseguito qRT-PCR utilizzando la tecnologia Power SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit da Applied Biosystems con 150 nM in avanti (5&#39;-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) e inversa (5&#39;-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) primer, alle condizioni raccomandate cicli termici. <img alt="Figura 5." src="/files/ftp_upload/3890/3890fig5.jpg" /> Figura 5. Non-focalizzazione tracciante (NFT) saggio per la separazione e rivelazione di amminoacidi non marcati. a) Schema del saggio NFT. Una iniezione finito di ioni del campione viene introdotta nel canale Oriente. Noi mescolare il LE con un fluoroforo tracciante cationico con una mobilità effettiva inferiore a quella degli ioni TE (tracciante μ &lt;μ TE). Il fluoroforosi dice che agisce come &quot;tracer underspeeding&quot;. Come il fluoroforo electromigrates dal LE in zone oggi occupate da altipiani campione e TE, sperimenta un campo elettrico maggiore e quindi aumenta la sua concentrazione. Questo cambiamento nella concentrazione crea passi nella isotachopherogram. b) separazione di due aminoacidi, arginina e lisina, utilizzando il saggio NFT con 6G rodammina come tracciante fluorescente underspeeding. Il picco leggera tra TE e arginina è comune in ITP, non è ben compreso, e qui non interferisce con il rilevamento o quantificare gli altipiani. Movie supplementare 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie1.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> . Movie supplementare 2. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie2.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> . Movie supplementare 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3890/3890movie3.mpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il filmato supplementare</a> .

<ol>
	<li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis.">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li><li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis.">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li><li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotachophoresis:+Theory,+instrumentation,+and+applications.">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science &#38; Technology. , (1976).</li><li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preconcentration,+separation,+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers.">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable,+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water.">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li><li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay.">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li><li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays.">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li><li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers.">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li><li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+selective+extraction,+isolation,+preconcentration,+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis.">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li><li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis.">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li><li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons.">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li><li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis.">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li><li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I:+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers.">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li><li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+dispersion+in+isotachophoresis.">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li><li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l&#214;sungen+und+l&#214;sungsgemischen.">&#220;ber concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von l&#214;sungen und l&#214;sungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li><li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases.">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li><li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations.">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li><li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons.">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

I metodi di ITP qui presentati consentono la rilevazione rapida, sensibile e robusto e la manipolazione di molecole ioniche. La sfida principale con ITP è la scelta corretta di buffer LE e TE. In ITP anionico, si scelgono tipicamente cloruro come anione principale perché è un acido forte con elevata mobilità assoluto e quindi ha proprietà molto prevedibili. Pertanto, la scelta buffer in anionica ITP è tipicamente ridotto a scegliere un vero e proprio TE e controione. Per gli esperimenti di messa a fuoco selettiva, la scelta TE è fondamentale per l&#39;esclusione di contaminare ioni. Nelle applicazioni in cui i contaminanti non sono presenti, in basso la mobilità TE efficace conduce a una più rapida velocità di messa a fuoco. Si consiglia di utilizzare i seguenti, relativamente ben educati anionici ioni TE: MES, MOPS, HEPES, tricina. Scelta del controione influenza sia il pH del sistema e della mobilità TE efficace. Controioni comuni sono tris (pKa 8,1) e bis-tris (pKa 6,4). Per i test che richiedono un pH inferiore o superiore, si consiglia di piridina (pKa 5,25) eetanolammina (pKa 9,5), rispettivamente. Nelle tabelle 1 e 2, per ITP anionici e cationici, rispettivamente, riassumiamo alcuni esempi buffer utili. Prendiamo HCl come ione LE anionico e sodio come cationico LE ioni e non assumiamo 100 mM forza ionica del tampone LE. Il lettore noterà che la forza ionica tampone nei nostri protocolli (e nelle tabelle 1-2) è sempre maggiore o uguale a 10 mM. Mentre in teoria fisica di ITP vale a forza ionica inferiore a 10 mM, contaminanti naturali (ad esempio acido carbonico dalla reazione tra acqua e anidride carbonica atmosferica) vicino al livello 1 mM spesso limitano l&#39;uso pratico di buffer a bassa forza ionica. Notiamo che meccanismo di trasduzione del segnale non è limitato ai saggi presentati in questo protocollo. Come discusso brevemente nella parte 5, in modalità plateau purificato zone può essere rilevata tramite variazioni di conducibilità locale, assorbitori UVBance, temperatura, o di un indice di rifrazione. Nel nostro gruppo, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza anfoliti portanti fluorescenti sensibili per la diagnosi e l&#39;identificazione di analiti sconosciuti. 5 In esperimenti modalità di picco, sonde specifiche possono essere usati per etichettare analiti focalizzati. In un esempio, usiamo segnali molecolari - sonde oligonucleotidiche che reagiscono al momento ibridazione per la loro sequenza bersaglio - per rilevare il DNA bersaglio o molecole di RNA con elevata specificità 11,18. Mentre ITP è relativamente robusto per dispersione causata dalla pressione-driven flusso e EOF, EOF eccessiva può portare ad una stagnazione del ITP, dove la velocità media EOF diventa uguale alla velocità ITP. 14 EOF Tale forte si verifica soprattutto in condizioni di pH elevato e bassa forza ionica. Per questo motivo, si consiglia l&#39;uso di tamponi con pH 8 o inferiore e con forza ionica dell&#39;ordine di 100 mm, se conveniente. Nella nostra esperienza, è il PVPrivestimento più efficace per la soppressione EOF in chips borosilicato. Tuttavia, a causa delle sue proprietà di setacciatura, PVP non può essere appropriato per alcune applicazioni, come focalizzazione DNA genomico. Negli esperimenti, si osserva che l&#39;aggiunta di PVP può ridurre notevolmente la mobilità DNA genomico assoluto (al punto in cui non si concentra). In questi casi, un rivestimento silanolo come Sigmacote in congiunzione con un tensioattivo (per esempio Triton X-100) può anche essere efficace nel ridurre EOF 10. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE anione (pKa -1) </td></tr><tr><td> Controione Buffering (pKa +1) </td><td> MES (6.10) </td><td> MOPS (7,20) </td><td> HEPES (7.50) </td><td> tricina (8.15) </td></tr><tr><td> etanolammina (9,50) </td><td> 21,41 </td><td> 20,40 </td><td> 17,38 </td><td> 22,85 </td></tr><tr><td> tris (8,08) </td><td> 21,00 </td><td> 19,23 &lt;/ Td&gt; <td> 15,84 </td><td> 17,56 </td></tr><tr><td> bis-tris (6.40) </td><td> 18,22 </td><td> 10,41 </td><td> 7,30 </td><td> 5,23 </td></tr><tr><td> piridina (5.18) </td><td> 1,01 </td><td> 3,72 </td><td> 2,42 </td><td> 1,48 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Mobilità grandezza effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro ITP anionica in cui il LE è HCl 100 mM e 200 mM tampone controione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> TE zione (pKa +1) </td></tr><tr><td> Controione Buffering (pKa -1) </td><td> etanolammina (9,50) </td><td> tris (8,08) </td><td> bis-tris (6.40) </td><td> piridina (5.18) </td></tr><tr><td> MES (6.10) </td><td> 35,57 </td><td> 21,96 </td><td> 16,39 </td><td> 10,45 </td></tr><tr><td> MOPS (7.20) </td><td> 35,47 </td><td> 20,92 </td><td> 9,76 </td><td> 3,93 </td></tr><tr><td> HEPES (7.50) </td><td> 35,35 </td><td> 19,97 </td><td> 7,77 </td><td> 2,88 </td></tr><tr><td> Tricina (8.15) </td><td> 34,77 </td><td> 16,72 </td><td> 4,50 </td><td> 1,44 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Magnitudine mobilità effettiva (× 10 -9 m 2 / V / s) della zona aggiustato analita puro in ITP cationico dove il LE è sodio 100 mM e 200 mM tampone controione.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> REAGENTI </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> GIBCO </td><td> 10977 </td><td> RNasi / DNasi gratuito </td></tr><tr><td> Clorox Ultra </td><td> Clorox </td><td> 02489CT </td><td></td></tr><tr><td> idrossido di sodio (NaOH) </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7708 </td><td></td></tr><tr><td> acido cloridrico (HCl) </td><td> EMD Chemicals </td><td> HX0603-4 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma base (tris) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> polivinilpirrolidone (PVP) </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 06067 </td><td> MW 1000000 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 carbossilico </td><td> Invitrogen </td><td> A20000 </td><td></td></tr><tr><td> tricina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T-9784 </td><td></td></tr><tr><td> bis-tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4429 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> AM9260G </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> lisozima </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6876 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green II </td><td> Invitrogen </td><td> S7564 </td><td></td></tr><tr><td> etanolammina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 411000 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina 6G </td><td> Acros Organics (Geel, Belgio) </td><td> CAS 989-38-8 </td><td></td></tr><tr><td> L-amminoacidi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> LAA21 </td><td></td></tr><tr><td> Potenza SYBR Green RNA-a-T C 1-Step Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4389986 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; PCR primers </td><td> Integrated DNA Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> ATTREZZATURE </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Borosilicato chip di microfluidica </td><td> Caliper Life Sciences Inc. </td><td> NS12A </td><td> Fornito con o senza plastica caddy </td></tr><tr><td> Pompa del vuoto </td><td> Gast </td><td> DOA-P104-AA </td><td></td></tr><tr><td> SourceMeter </td><td> Keithley </td><td> 2410 </td><td> Costante modalità correnti e costanti di tensione di funzionamento </td></tr><tr><td> Inverted microscopio epifluorescent </td><td> Olimpo </td><td> IX70 </td><td> Utilizzare lampada al mercurio (Olympus) o LED (Thorlabs) per l&#39;illuminazione </td></tr><tr><td> Cube Filter </td><td> Omega </td><td> XF115-2 </td><td> Eccitazione / emissione: blu / verde </td></tr><tr><td> Sicuro-Lock microprovette </td><td> Eppendorf </td><td> 022363204 </td><td> 1,5 ml di capacità </td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> 5417C </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Reagenti e attrezzature specifiche.

on-chip isotachophoresis for separation of ions and purification of nucleic acids

Tecniche elettrocinetici sono una graffetta di applicazioni su microscala per la loro capacità unica di eseguire una varietà di processi e fluidici elettroforetica in sistemi semplici e compatti senza parti in movimento. Isotachophoresis (ITP) è una tecnica semplice e molto robusta elettrocinetico che può raggiungere 1,2 milioni di volte preconcentrazione ed efficiente separazione ed estrazione basata sulla mobilità ionica. 3 Per esempio, abbiamo dimostrato l&#39;applicazione di ITP di separazione e rivelazione sensibile di non marcato ionici molecole (ad esempio tossine, DNA, rRNA, miRNA) con poco o nessun campione 4-8 preparazione e di estrazione e purificazione di acidi nucleici da matrici complesse compreso coltura cellulare, urina, sangue e 9-12. ITP raggiunge focalizzazione e separazione utilizzando un campo elettrico applicato e due buffer all&#39;interno di un sistema fluidico canale. Per analiti anionici, il principale elettrolita (LE) buffer viene scelto sale che i suoi anioni hanno una maggiore mobilità elettroforetica efficace rispetto agli anioni dell&#39;elettrolita finale (TE) tampone (mobilità efficace descrive la velocità di deriva osservabile di uno ione e tiene conto dello stato di ionizzazione dello ione, come descritto in dettaglio da Persat et al . 13). Dopo aver stabilito un&#39;interfaccia tra il TE e LE, un campo elettrico viene applicato in modo tale che gli ioni LE allontanarsi dalla regione occupata da ioni TE. Ioni del campione di razza intermedia mobilità efficaci prima di ioni TE, ma non può superare ioni LE, e così si concentrano presso il LE-TE interfaccia (in appresso denominata &quot;interfaccia ITP&quot;). Inoltre, la TE LE e aree del modulo di conducibilità rispettivamente a bassa ed alta, che stabiliscono una forte pendenza campo elettrico a livello di interfaccia ITP. Questo gradiente di campo preconcentrates specie campione come essi si concentrano. La corretta scelta dei risultati e di TE LE a messa a fuoco e la purificazione della specie bersaglio da altri non focalizzate specie e, infine, la separazione unod segregazione di specie campione. Noi qui rivedere la ITP principi fisici alla base e discutere due modi standard di funzionamento: &quot;picco&quot; e &quot;plateau&quot; modalità. In modalità picco, relativamente diluire ioni del campione si concentrano insieme in sovrapposizione picchi stretti a livello di interfaccia ITP. In modalità plateau, ioni del campione più abbondanti raggiungere una concentrazione nello stato stazionario e segregare in adiacenti plateau-like zone ordinate per la loro mobilità effettiva. Modalità di picco e plateau derivare da la stessa fisica di base, ma rappresentano distinti regimi differenziati dalla concentrazione dell&#39;analita iniziale e / o la quantità di tempo assegnato per l&#39;accumulo di campione. Per prima descritto in dettaglio un picco esperimento modello modalità e quindi dimostrare un saggio picco modalità per l&#39;estrazione di acidi nucleici da E. coli di coltura cellulare. Concludiamo con la presentazione di un saggio modo di plateau, dove usiamo un non-traccianti di messa a fuoco (NFT) specie per visualizzare la separazione e performare quantificazione di amminoacidi.

Watch this Scientific Journal Video about On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids at JoVE.com

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.

On-Chip Isotachophoresis per separazione degli ioni e purificazione di acidi nucleici

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

24.2K Views.  Stanford University. Isotachophoresis (ITP) è una separazione solido elettrocinetico e tecnica preconcentrazione con applicazioni che vanno dal rilevamento della tossina alla preparazione del campione. Esaminiamo i principi fisici di ITP e la metodologia di applicazione di questa tecnica per due applicazioni specifiche esempio: separazione e la rilevazione di piccole molecole e di purificazione degli acidi nucleici da lisato di coltura cellulare.

Video: On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Ricerca

Bioingegneria

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

On-Chip Fenotipizzazione Endothelial infiammatoria

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Film secco basati su Photoresist biosensore elettrochimico Microfluidic Platform: Fabbricazione di dispositivi, saggio su chip preparazione e funzionamento del sistema

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Riconoscimento visivo delle più acidi nucleici in una matrice capillare

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-assemblaggio di acidi nucleici peptidici modificati gamma in nanostrutture complesse in miscele di solventi organici

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering

Microfluidics is a widely used tool to generate droplets and vesicles of various kinds in a controlled and high-throughput manner. Liposomes are simplistic cellular mimics composed of an aqueous interior surrounded by a lipid bilayer; they are valuable in designing synthetic cells and understanding the fundamentals of biological cells in an in vitro fashion and are important for applied sciences, such as cargo delivery for therapeutic applications. This article describes a detailed working protocol for an on-chip microfluidic technique, octanol-assisted liposome assembly (OLA), to produce monodispersed, micron-sized, biocompatible liposomes. OLA functions similarly to bubble blowing, where an inner aqueous (IA) phase and a surrounding lipid-carrying 1-octanol phase are pinched off by surfactant-containing outer fluid streams. This readily generates double-emulsion droplets with protruding octanol pockets. As the lipid bilayer assembles at the droplet interface, the pocket spontaneously detaches to give rise to a unilamellar liposome that is ready for further manipulation and experimentation. OLA provides several advantages, such as steady liposome generation (&#62;10 Hz), efficient encapsulation of biomaterials, and monodispersed liposome populations, and requires very small sample volumes (~50 &#181;L), which can be crucial when working with precious biologicals. The study includes details on microfabrication, soft-lithography, and surface passivation, which are needed to establish OLA technology in the lab. A proof-of-principle synthetic biology application is also shown by inducing the formation of biomolecular condensates inside the liposomes via transmembrane proton flux. It is anticipated that this accompanying video protocol will facilitate the readers to establish and troubleshoot OLA in their labs.

The present protocol describes octanol-assisted liposome assembly (OLA), a microfluidic technique to generate biocompatible liposomes. OLA produces monodispersed, micron-sized liposomes with efficient encapsulation, allowing immediate on-chip experimentation. This protocol is anticipated to be particularly suitable for synthetic biology and synthetic cell research.