MA è stato sostenuto da una borsa di studio di Schrödinger Fondo austriaco della scienza (FWF, J3086-B11) e ringrazia il Max-Planck-Società per il sostegno finanziario e amministrativo. GS e JH sono stati sostenuti dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS13-030).

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The authors declare that they have no competing financial interest.

Misurazione interazioni proteina-proteina in situ è altamente auspicabile soprattutto quando si tratta di interazioni a bassa affinità, come TCR-pMHC vincolante 11. Questo perché il on-rate e la stabilità di tali interazioni sono significativamente influenzati dalle circostanze particolari avviene il legame. Approcci di imaging basato FRET-minimamente invasivi sono quindi in linea di principio perfettamente adatto per tali compiti, ma implicano una serie di ostacoli che devono essere superati prima. Il rumore generato da autofluorescenza cellulare limita la sensibilità delle misurazioni e deve pertanto essere mantenuto al minimo. Microscopia TIRF serve questa esigenza molto bene 12 ma richiede la funzionalizzazione di vetro diapositive, idealmente sotto forma di un planare-oggetti sostenuto doppio strato lipidico decorato con proteine ​​di scelta 13-15. Un altro vantaggio di un approccio in parte di ricostituzione è che i partner FRET ricombinante doppio strato-residente può essere molto mORE facilmente etichettati in uno, site-specific modo quantitativo e razionale con fluorofori più piccoli e più brillanti di quanto sarebbe possibile con proteine ​​di superficie espresso cellulari. TCR sono contrassegnati con ricombinante SCF V s, che non influenzano il riconoscimento delle cellule T, come è stato testato in precedenza 2. Inoltre, la composizione proteica della SLB, per esempio la densità pMHCs e la scelta dei fattori accessori può essere regolata alle proprie esigenze specifiche. Abbiamo già effettuato esperimenti con diverse densità di pMHCs stimolanti, ma non abbiamo rilevato differenze significative nella 2D-k off e 2D-K D 2. Finora qui il riconoscimento di molecole MHC di classe II è stato trattato solo, soprattutto a causa della natura della loro cleft legame peptidico, che è aperto alle due estremità ed accoglie pertanto peptidi più grandi compreso un linker per il fissaggio fluoroforo. In alcuni casi tale approccio potrebbe funzionare anche per l&#39;etichettatura MHC class io molecole 16, ma molta cautela da adottare per verificarne l&#39;utilizzo negli esperimenti. La sensibilità di cellule T verso antigeni, che può essere misurata mediante saggi di proliferazione delle cellule T, così come la cinetica di legame pMHC-TCR misurata in vitro mediante risonanza plasmonica di superficie non dovrebbe essere influenzata dall&#39;aggiunta del linker e fluoroforo per il peptide. In alternativa, MHC classe I assumono molecole possono essere etichettate in modo sito-specifico con l&#39;introduzione di una cisteina spaiato all&#39;interno della sequenza della catena pesante (osservazioni non pubblicate). Con l&#39;uso di opportune sonde molecolari alcuna interazione proteina-proteina sinaptica può in linea di principio essere studiato in modo qui descritto. Tali sonde, ad esempio, SCF V s o Progettato Proteine ​​Ankyrin Ripeti (DARPins) 17, dovrebbero essere monovalenti e dovrebbe legare il loro obiettivo in modo stabile senza influenzare l&#39;interazione di interessi. Naturalmente, informatio strutturalen è altamente desiderabile per la progettazione razionale della sonda ma non assolutamente necessario. Quando si stabilisce un nuovo paio di partner FRET, si consiglia di registrare ed analizzare FRET in massa prima. Siti di attaccamento etichette possono essere variate sensibilmente per massimizzare il segnale FRET e anche per verificare che i rendimenti misurati FRET variano in base alla distanza tra colorante. Una volta che il sistema è ottimizzato, singola molecola FRET segnali possono essere registrati limitando l&#39;etichettatura del grande abbondanza FRET partner 10-30% e sbianca la bassa abbondanza FRET compagno fino a quando le singole molecole sono risolvibili nel campo dell&#39;illuminazione. Ultimo ma non meno importante si deve rilevare che SLB ravvicinamento alcuni, ma non tutti gli aspetti di una membrana plasmatica fisiologico. Qualità come membrana curvatura e flessibilità, compartimentazione dominio, riarrangiamenti citoscheletrici e motilità cellulare, nonché una elevata varietà di proteine ​​di membrana di superficie espressi non sono rappresentate da SLB ma possono influenzare tegli elabora sotto inchiesta. Sarà necessario molto sforzo per essere investito per stabilire le modalità di imaging che permette di seguire in interazioni proteina-proteina con una risoluzione di singola molecola nelle sinapsi fisiologici, che sono inaccessibili per l&#39;imaging TIRF.

Una comprensione più fondamentale di come le cellule T riconoscono antigeni richiede guardando al posto giusto, cioè, all&#39;interno della sinapsi immunologica formato tra la cellula T e APC. Qui, cinetica di legame molecolari non solo sono determinate dalle proprietà intrinseche biochimiche dei partner di interazione coinvolti ma dipendono in larga misura parametri cellulari, che includono forze cellulari, architettura membrana e interazioni laterali tra proteine ​​di membrana e vincoli geometrici specifici sinapsi 3. Approcci biochimici sono limitati in potere risolvente quanto richiedono l&#39;interruzione di almeno una delle membrane sinaptiche coinvolte. Per questo motivo una metodologia di imaging basato FRET-è stato sviluppato per monitorare vincolante del TCR di pMHCs antigeniche 2. Qui le cellule T sono decorati con un ricombinante e il sito-specifico etichettati TCRβ-reattiva singola catena frammento di anticorpo (SCF V) e confrontati con il piano<html> ar bistrati di vetro supportato lipidi (SLB), che ospitano MHC di classe II molecole caricate con un peptide antigenico fluorescente, molecole costimolatorie e proteine ​​di adesione. Synaptic vincolante tra dye-marcato TCR e tingere marcati risultati pMHC in FRET, che possono essere monitorati su una massa e livello di singola molecola per fluorescenza a riflessione totale interna (TIRF) microscopia. In questo articolo viene spiegato in dettaglio come utilizzare SLB per saggiare le sinapsi delle cellule T, verificare la loro integrità attraverso un cellule T saggio di calcio-flux funzionale, condotta FRET misurazioni in massa e con sensibilità singola molecola, e analizzare i dati acquisiti. Le raccomandazioni sono offerti per la produzione di proteine ​​adeguatamente conformati necessarie per doppio strato funzionalizzazione. Per informazioni più specifiche per quanto riguarda la formazione di doppio strato e l&#39;installazione di un microscopio TIRF adatto prega di fare riferimento a un accesso pubblico JoVE aggiuntivo di pubblicazione pubblicato back to back 4. tenda &quot;&gt; Natura di SLB SLB Functionalizable possono essere facilmente generati dalle vescicole unilamellari (SUV) che contengono le due lipidi 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocolina (breve: POPC, 90-99%) e sn 1,2-dioleoyl- - glycero-3 - {[N (5-ammino-1-carbossipentil) iminodiacetico acido] succinil} (breve: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV sparsi su vetrini puliti per formare una contigua planare doppio strato 4. DGS-NTA-Ni serve ad ancorare le proteine ​​polyhistidine-tag tramite complesso-formazione polyhistidine mediata con il sintetico NTA-Ni-gruppo contenente testa (Figura 1A). Per stabile associazione uno tipicamente sostituisce il dominio transmembrana e la coda citoplasmatica nativo della proteina di adesione ICAM-1 e la molecola di costimolazione B7-1 con un tag contenente dodici istidine (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . La classe II molecola IE k peptide-caricato contiene due catena polipeptidica membrana-embedded (α e β)S. I transmembrana / domini citoplasmatici di entrambe le catene devono essere sostituiti con un tag contenente sei istidine ogni (IE k α β 6H 6H o IE k -2x6H). In alternativa, estendendo la α-catena con dodici istidine e lasciando il dominio extracellulare del β-chain untagged (dando luogo a IE k α β 12H 0H o IE k -12H) dà luogo a risultati soddisfacenti (Figura 1B). Etichettatura site-specific di pMHCs E &#39;importante per etichettare il pMHC stechiometricamente e sito-specifico per essere in grado di convertire i rendimenti misurati FRET in vincolante equilibrio costanti significative. Ciò può essere ottenuto mediante l&#39;etichettatura chimica di un peptide sintetico che viene caricata nella fessura-peptide di legame di istidina-marcato ricombinante MHC di classe II molecole 2,5. Il peptide comprende tutti i residui del epitopo T-cellulare come well come una breve C-terminale linker (GGS), seguita da cisteina (ad esempio nel falena citocromo c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GTECH, il linker è segnato in grassetto). Questo cisteina viene utilizzato per etichettare il peptide stechiometricamente con l&#39;uso di derivati ​​maleimide-dye. A questo punto particolare attenzione dovrebbe essere dedicata alla verifica dye accoppiamento quantitativa al peptide-cisteina contenenti. HPLC-purificazione della addotto peptide-dye è raccomandata e deve essere seguita da spettrometria di massa Elettrospray. Eventuali masse registrate corrispondenti al reagente peptide (senza tintura) riflettono l&#39;etichettatura incompleta. Se questo è vero, il peptide-HPLC purificato deve essere sottoposto a turni consecutivi di colorante etichettatura fino a quando l&#39;etichettatura è considerata quantitativa. Si noti che la spettroscopia di massa MALDI-TOF deve essere evitata in quanto questo metodo comporta la radiazione laser per il campione di ionizzazione. Questo trattamento disintegra fluorofori sensibili collegate prima messa peptide viene letto e quindi underrepre<html> gradi senta di dye-coniugazione. Etichettatura indiretta ma site-specific di TCR cellule legato con l&#39;utilizzo di monovalente singola catena frammenti F V E &#39;ancora difficile da collegare tinture per cellulare proteine ​​di superficie associato di cellule viventi in modo site-specific. Per superare questo ostacolo per TCR-superficie esposta, una versione monovalente singola catena (SCF V) dai geni del TCRβ -reactive anticorpo monoclonale H57-197 2 è stato costruito. La struttura cristallina di questo anticorpo in complesso con il TCR permette di progettare razionalmente una versione, in cui un residuo di serina in prossimità del C-terminale del peptide associato MHC (cui è collegato il corrispondente partner di tintura FRET) è sostituito con un residuo di cisteina. Questo mutante cisteina serve poi come accettore per tinture coniugazione (Figura 2). Metodologie di registrare FRET nt &quot;&gt; valori FRET Bulk sono più adatti a verificare il rapporto tra scelte distanze inter-dye e FRET efficienza misurati in questo TCR-pMHC sistema 2 vincolante. Inoltre, le misure di FRET rinfusa rivelano differenze qualitative e quantitative in sinaptiche affinità TCR-pMHC ( vedere di seguito e la sezione protocollo 3.2). Vari approcci per quantificare l&#39;efficienza FRET sono stati introdotti nella letteratura 6. In questo articolo viene registrata tramite FRET (a) recupero del donatore dopo accettore candeggio, e via (b) sensibilizzati FRET emissione accettante. Il primo metodo (a) richiede l&#39;uso di un accettore FRET facilmente fotodecolorate, e un donatore, che è piuttosto fotostabile. Inoltre, è importante garantire che l&#39;accettore fotodecolorate non è più in grado di tempra fluorescenza del donatore. Come lo stesso canale di rilevamento (donatore) è usato per la quantificazione, senza fattori di correzione di und senza aberrazioni cromatiche devono essere considerati, che rende questa metodologia semplice ed affidabile. Tuttavia, le misure quantitative non possono essere ripetuti nello stesso punto del campione e le variazioni di FRET non possono essere registrati nel corso del tempo. Per evitare effetti causati dalla diffusione molecolare o motilità cellulare un passo sbiancamento veloce dovrebbe mirare per, che riduce al minimo il tempo che passa tra il primo donatore FRET (prima accettore sbiancamento) e la seconda acquisizione immagine FRET donatore (dopo FRET accettore candeggio). Si raccomanda di utilizzare una potente fonte di luce laser del FRET accettore di eccitazione lunghezza d&#39;onda al fine di minimizzare illuminazione e sbiancanti volte. Al contrario, nel metodo di misura sensibilizzata emissione FRET (b) il donatore FRET è eccitato e l&#39;emissione del accettore FRET è osservata nel canale FRET accettore. Le variazioni di segnale accettore FRET possono essere registrate nel tempo, ma di emissione del donatore FRET nel canale accettore rosso-spostato (termed bleedthrough) e FRET accettore cross-eccitazione tramite eccitazione del donatore devono essere determinati con precisione e sottratto dal canale accettore FRET registrato. Per questo i corrispondenti FRET donatore e ti agiti immagini accettore devono essere spazialmente allineati. Rilevamento di singola molecola (sm) FRET eventi Con l&#39;uso di laser come sorgente di eccitazione, una macchina fotografica sensibile e microscopia TIRF rumore attenuato la fluorescenza di fluorofori singoli sia facilmente rintracciabile nel tempo. Simile è vero per la rilevazione di eventi smFRET intermolecolari. Tuttavia, le complicanze possono essere causati da bleedthrough donatore FRET e cross-eccitazione del accettore FRET, e, quindi, grande attenzione deve essere presa durante la regolazione delle densità fluoroforo nell&#39;esperimento smFRET. Nel protocollo di seguito (sezione del protocollo 4) il TCR è stato scelto come FRET donatore in alta abbondanza e pMHC come accettore FRET in condizioni di scarsa abbondanza. Per attenuare FRET donatore bleedthrough sufficientemente, decorare 10-30% dei TCR con SCF fluorescenti V e 90-70% dei TCR con SCF non fluorescente V. Qui il canale accettore FRET è stato scelto come canale di singola molecola, perché è confocale con la singola molecola FRET canale. Questo aiuta ad allineare eventi smFRET con singola molecola FRET accettori, che è alla base della convalida smFRET. Estrazione off-tariffe sinaptiche attraverso misure smFRET Photobleaching sia FRET donatore e accettore FRET devono essere contabilizzate quando si estrae l&#39;emivita di interazioni di singola molecola FRET tracce. Il numero di FRET-segnali osservabili all&#39;inizio del loro aspetto come singola coppia donatore-accettore N (0) si riduce nel tempo sia unbinding del photobleaching complesso e del recettore-ligando. Il numero di sopravvivere complessi in un dato momento N (t) può essere matematicamente espresso come segue: Nel termine photobleaching exp (-t / τ candeggina) il tempo t è descritta dal prodotto del numero di osservazioni n e il tempo t illuminazione malato a causa della, modalità di osservazione discreta non continuo (cioè, sbiancamento si verifica solo durante illuminazione ). All&#39;interno exp- cinetica termine (t / τ off) il tempo t è il prodotto del numero di osservazioni e n t ritardo per una singola osservazione FRET (cioè, unbinding cinetica accade continuamente). Equazione 1 può essere espresso come: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Il τ termine candeggina / τ ill describes il numero di osservazioni finché non si verifica sbianca ed è definito come il valore atteso &lt;n candeggiare&gt; della sua funzione esponenziale. Equazione 2 può essere semplificata come segue: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Il valore di aspettazione &lt;n (t ritardo)&gt; il numero di frame N (t) con osservabili FRET-eventi dopo il tempo t è determinata direttamente dall&#39;esperimento. Dipende dal tempo impostabile tra osservazioni (t lag) scelti per l&#39;esperimento ei valori sconosciute per τ off (l&#39;inverso del off-rate k off) e &lt;n candeggiare&gt;, il valore di aspettazione di numero di osservazioni prima che si verifichi lo sbiancamento . Pertanto, il calcolo del valore atteso &lt;n (t lag)&gt; per almeno due valori di t <sub&gt; ritardo permette la determinazione sperimentale di &lt;n candeggina&gt; e T si spegne. Estrazione valori sinaptici 2D-K D attraverso misurazioni basate FRET- Misurazione TCR occupazione una, vale a dire il rapporto tra TCR legati e TCR totale, è fondamentale per la determinazione dei valori sinaptiche 2D-K D. Secondo l&#39;equazione 4 questo termine è direttamente proporzionale alla misurata FRET cedere finché TCR serve come donatori FRET e pMHCs come accettori FRET. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> con una capienza = TCR, C = fattore di conversione C è una costante che dipende dal sistema FRET e fluorofori utilizzati. Può essere determinato sperimentalmente come mostrato di seguito. A può essere convertito in un 2D-K D secondo l&#39;equazione 5 quando ildensità iniziale di ligandi TCR prima dell&#39;aggiunta di cellule T a doppio strato è noto. Questo è a causa della elevata mobilità delle proteine ​​SLB iscritti e anche perché SLB fornire un serbatoio quasi inesauribile di ligandi 2. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> con [iniziale pMHC] = densità iniziale pMHC prima dell&#39;aggiunta di cellule T Con le equazioni 4 e 5 si può ora facilmente determinare il sinaptica 2D-K D tra TCR e pMHC. Questo è più affidabile fatto con le misure di FRET basati sul recupero dei donatori dopo accettore sbiancamento (vedi paragrafo 3.1 del protocollo). Tuttavia, per misurare C il rapporto tra l&#39;intensità FRET I Fret (corretto per lo sfondo, bleedthrough donatore FRET e FRET accettore cross-eccitazione) e TCR occupazione una deve essere determinato. Per questo, unoha bisogno di conoscere il rapporto R tra l&#39;intensità media di fluorescenza di fluorofori singoli TCR-associati FRET donatore (ad esempio Cy3 o AF555) sm Mi struggo donatore e l&#39;intensità media di singola molecola Fret eventi sm I tasto. R dipende dal sistema FRET in questione, e filtri di emissione telecamera utilizzato per il rilevamento della fluorescenza. Il TCR occupazione a può poi essere determinata direttamente secondo l&#39;equazione 6. <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = sm Mi struggo donatore / sm I Fret R è stato determinato come 1,45 per il sistema H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 porta a: a = massa Mi struggo / bulk I TCR-Cy3 • 1.45 Il rapporto tra l&#39;occupazione e TCR un rendimento FRET può essere determinata FRET donatore recuperarey dopo accettore sbiancamento. Per questo entrambi i parametri sono tracciati uno contro l&#39;altro per un numero TCR microcluster come mostrato nella Figura 4A .La pendenza della regressione lineare indica il fattore di conversione C (dall&#39;equazione 4). Come mostrato nella Figura 4A, C equivale per (a) V H57 scf - Cy3 / Cy5 pMHC-sistema FRET e (b) la configurazione del sistema microscopio applicato a 1.995. Il TCR occupazione a può essere facilmente dedurre come segue: Occupazione TCR a = FRET cedere • 1.995

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

La registrazione di calcio intracellulare attraverso il fura-2 calcio colorante nonché l&#39;analisi cellulare successiva per verificare la potenza stimolatorio e quindi la funzionalità di SLB sono mostrati in Figura 4. Come risulta evidente, i livelli di calcio aumentano in cellule T (espressa come normalizzata fura-2 340nm / 380nm rapporto con basale essere 1) immediatamente non appena si sistemano sulle SLB stimolanti. I livelli di calcio ritornano ai livelli basali poco dopo l&#39;aggiunta di un anticorpo che blocca pMHCs da TCR impegno e che termina l&#39;attivazione delle cellule T. Figura 6 illustra un tipico esperimento coinvolge recupero donatore accettore FRET dopo candeggio, che viene impiegato per misurare la resa FRET e che serve per calcolare i valori 2D-K D (mostrato in Figura 4). Si prega di notare l&#39;aumento di intensità dei donatori FRET, che rappresenta TCR etichettato via AF555, dopo una rapida e completa ablazione della FRET unSpecie cceptor (qui: AF647 associato con pMHCs). Inoltre è evidente il forte riduzione canale FRET, cioè, il canale FRET-accettore FRET sotto eccitazione donatore, dopo FRET accettore candeggio. Il segnale restante appena visibile corrisponde a preoccuparsi bleedthrough donatore. I rendimenti FRET all&#39;interno dei singoli microcluster TCR o intere sinapsi sono calcolati sulla base dei valori di intensità misurati indicati (Figura 6B). La figura 7 illustra una traiettoria e lasso di tempo di una singola molecola FRET evento visibili in due tempi. Come indicato sopra nell&#39;introduzione tale comportamento è causato da entrambi decadimento sinaptica TCR-pMHC vincolanti e photobleaching. Per discriminare tra questi due contributi, i tempi di acquisizione sperimentali devono essere variato in durata: mentre fotoscolorimento rimane costante, le variazioni di lunghezza FRET traiettoria evento sono causati solo dalla cinetica di legame. Una quantificazione di tracelengths, w<html> hich costituisce la base per il calcolo di fuori dei prezzi e candeggio mostrati nella Figura 7, sono forniti nelle tabelle da 1 a 3. Determinazione del 2D-K D s richiede la registrazione di massa FRET rendimenti per FRET-donatori TCR etichettati. Con l&#39;uso della costante C sperimentalmente dedotta (figura 4), ​​una resa FRET misurato per un microcluster TCR o un&#39;intera sinapsi può essere convertito nel TCR occupazione a, cioè il rapporto di TCR pMHC-impegnati e totali (Figura 4C) . Con note densità pMHC presenti sul SLB prima dell&#39;aggiunta della cellula T, a valori possono essere utilizzati per determinare i valori 2D-K D (Figura 4D sinaptiche). On-tassi possono essere calcolate con la legge di azione di massa (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) dal sinaptica determinato off-rate e valori 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. schema schematica del sistema piano-oggetti sostenuto doppio strato lipidico (SLB). (A) SLB sono composte da POPC (90-99%) e il lipide sintetico DGS Ni-NTA (1-10%) e si formano spontaneamente quando le superfici di vetro pulito pagano con piccole vescicole unilamellari (SUV) costituito da lipidi corrispondenti. (B) Una volta formato, tali SLB possono essere funzionalizzati con solubili porzioni polyhistidine-tagged extracellulari derivati ​​da pMHCs, costimolatorie B7-1 proteine ​​e ICAM-1 proteine ​​di adesione, per servire da APC per le cellule T. Per ulteriori informazioni sulla preparazione SLB fare riferimento a Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Förster Resonance Energy Transfer basato test per quantificare TCR-pMHC binding in situ. (A) Struttura composita di un TCR complessata con un frammento di catena singola H57 impegnare un pMHC illustra l&#39;approccio basato FRET-descritto. Si noti la breve distanza di circa 41 bis che separa i due fluorofori corrispondenti sottoposti FRET. Siti accettori per fluoroforo maleimmidi sono indicate in verde e rosso. (B) Il principio di rilevare interazioni TCR-pMHC in situ è illustrata. Solo SCF V -decorated TCR e pMHCs (qui k IE), che formano complessi specifici, dar luogo ad un segnale FRET misurabile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. cromatogrammi della finale fase di filtrazione gel dando luogo a monomeriche SCF V s e peptide-caricato IE k -2x6H molecole. Assi X rappresentano il volume di ritenzione in ml, assi Y indicano assorbanza a 280 nm in unità arbitrarie (AU) . (A) H57 SCF V sito-specifico marcato con Alexa Fluor 555 maleimmide è stato sottoposto a cromatografia S75 separare colorante non reagito dalla proteina (fase 1.2.5). Frazioni corrispondenti a intervallo di ritenzione 14 a15 ml (linee tratteggiate) rappresentano etichettati monomero H57 SCF V. (B) IE k molecole -2x6H complessati con il titolare ANP-spazio peptide UV-cleavable era stato-UV irradiati, incubate con il sito-specifico Alex 647 maleimmide peptide marcato ed infine sottoposto a cromatografia S200 per separare le proteine ​​peptide libero (passo 1.1.2.4). L&#39;intervallo tra le linee tratteggiate contiene opportunamente piegato e pMHCs monomeriche. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml campione è stato applicato alla colonna all&#39;inizio del rum (0 ml punto). Frazioni raccolte sono state concentrate. Il rapporto proteine-to-dye è stata determinata photospectrometry prima dialisi contro PBS / 50% glicerolo (per la conservazione a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinazione 2D-K D s e 2D-k a s. (A) La correlazione tra il rendimento FRET sulla base del recupero dopo donatore accettore candeggio e occupazione TCR è stata misurata sperimentalmente. Occupazione TCR può essere determinato per le singole microcluster TCR come spiegato nel paragrafo 4.2. Una misura lineare di visualizzazione dei dati dalla linea, la pendenza che è uguale al rapporto tra C TCRoccupazione e la resa FRET. C è una costante specifica per il sistema FRET e fluorofori (Cy3 e Cy5 qui) impiegati. In questo esempio ha prodotto 1.988. (B) FRET dati di rendimento sono stati determinati per le singole microcluster TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) attraverso il recupero donatore accettore sbiancamento. Numeri inferiori barre dell&#39;istogramma indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (C) Conversione dei dati mostrati in (B) moltiplicando misurata FRET rese con la costante C determinato in (A). Numeri sotto barre indicano il limite superiore entro l&#39;intervallo. (D) Istogramma (semi-logaritmica, base = 4) raffigurante la distribuzione di 2D-K D s misurato per i singoli microcluster TCR. La mediana 2D-K D è indicato in blu. Numeri sotto barre indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (E) L&#39;istogramma mostrato in (D) è stato convertito intoa 2D-k su -histogram (semi-logaritmica, base = 4) che impiega il k sinaptica off per 24 ° C (0,41 s -1). La mediana determinato 2D-k sul valore è indicato in blu. I dati sono stati originariamente pubblicati in Huppa et al. 2 e sono visualizzati qui in un nuovo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. validazione funzionale di SLB impiegato per la stimolazione delle cellule T e di imaging. (A) TCR-transgenici esplosioni cellule T caricate con fura-2 sono stati confrontati con stimolante SLB ospitare pMHCs antigeniche, ICAM-1 e B-7. Cellular emissione fura-2 eccitato a 340 nm e 380 nm così come le immagini sono state registrate DIC. Come indicato, i valori del rapporto di intensità di emissione eccitate a 340 e 380 nm sono mostrati nel pannello di destra. L&#39;aggiunta di pMHC anticorpi bloccanti 14 min nel periodo sperimentale si conclude con una diminuzione dei livelli intracellulari di calcio paragonabile a quella delle cellule T a riposo. (B) Un profilo tipico temporale di rapporti medi Fura-2 in T-cellule contatto SLB stimolazione è caratterizzata da un primo aumento del calcio intracellulare, che è da 2 a 4 volte superiore rispetto a quella delle cellule T non attivati ​​o T-cellule prive dell&#39;antigene dopo blocco mediata da anticorpi. Cerchi verdi indicano i punti temporali illustrati in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. Bulk FRET rendimenti, come misurato attraverso il recupero dei donatori FRET dopo FRET accettatore sbiancamento. <strong&gt; (A) si riporta un esempio di una tipica FRET misurazione sinaptica. Come è indicato sulla sinistra e sulla sommità di una serie di immagini è stato acquisito con l&#39;uso di un divisore di fascio di emissione dando origine ad un donatore FRET e un canale FRET accettore (per informazioni più dettagliate sul beam splitter riferiscono Axmann et al 4). La linea mostrata nell&#39;immagine DIC sinistra indica il limite della sinapsi T-cellule. Si noti la perdita di intensità all&#39;interno del canale accettore FRET così è l&#39;aumento di intensità nel canale donatore FRET dopo FRET accettore sbianca (fase 4). (B) FRET efficienza può essere quantificato come indicato per singole regioni sinaptici o per interi sinapsi. Per l&#39;ispezione, le immagini prima e dopo FRET accettatore di sbiancamento sono riportati con l&#39;uso di due tabelle di ricerca (LUT, verde e fisica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. singola molecola FRET eventi appaiono e scompaiono passi insingle e sono perfettamente allineati con un unico fluoroforo accettore FRET. Viene mostrato il lasso di tempo di singola molecola evento FRET. Immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera retroilluminato EMCCD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinazione τ off = 1 / k off da traiettorie smFRET misurati. (A) Le somme cumulative normalizzati di segnali FRET osservabili (derivati ​​da H57 SCF V -AF555 decorate 5c.c7 TCR esplosioni transgenici cellule T che riconosce IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 a 24 ° C) per quattro differenti ritardi temporali (42 msec, 490 msec, 1.007 msec, 1,989 msec) sono stati tracciati in funzione del numero totale di osservazioni. Funzioni in forma mono-esponenziale danno luogo a corrispondenti l&#39;inverso negativo dei valori di aspettativa &lt;n (t ritardo)&gt;. (B) valori di aspettazione sono stati tracciati contro i ritardi t lag e montati utilizzando l&#39;equazione &lt;n (t ritardo)&gt; = τ off / {(t off / &lt;n candeggina&gt;) + t lag} cedere τ off e &lt;n candeggina&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K Views.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 