MA è stato sostenuto da una borsa di studio di Schrödinger Fondo austriaco della scienza (FWF, J3086-B11) e ringrazia il Max-Planck-Società per il sostegno finanziario e amministrativo. GS e JH sono stati sostenuti dalla scienza e la tecnologia Fondo Vienna (WWTF, LS13-030).

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The authors declare that they have no competing financial interest.

Misurazione interazioni proteina-proteina in situ è altamente auspicabile soprattutto quando si tratta di interazioni a bassa affinità, come TCR-pMHC vincolante 11. Questo perché il on-rate e la stabilità di tali interazioni sono significativamente influenzati dalle circostanze particolari avviene il legame. Approcci di imaging basato FRET-minimamente invasivi sono quindi in linea di principio perfettamente adatto per tali compiti, ma implicano una serie di ostacoli che devono essere superati prima. Il rumore generato da autofluorescenza cellulare limita la sensibilità delle misurazioni e deve pertanto essere mantenuto al minimo. Microscopia TIRF serve questa esigenza molto bene 12 ma richiede la funzionalizzazione di vetro diapositive, idealmente sotto forma di un planare-oggetti sostenuto doppio strato lipidico decorato con proteine ​​di scelta 13-15. Un altro vantaggio di un approccio in parte di ricostituzione è che i partner FRET ricombinante doppio strato-residente può essere molto mORE facilmente etichettati in uno, site-specific modo quantitativo e razionale con fluorofori più piccoli e più brillanti di quanto sarebbe possibile con proteine ​​di superficie espresso cellulari. TCR sono contrassegnati con ricombinante SCF V s, che non influenzano il riconoscimento delle cellule T, come è stato testato in precedenza 2. Inoltre, la composizione proteica della SLB, per esempio la densità pMHCs e la scelta dei fattori accessori può essere regolata alle proprie esigenze specifiche. Abbiamo già effettuato esperimenti con diverse densità di pMHCs stimolanti, ma non abbiamo rilevato differenze significative nella 2D-k off e 2D-K D 2. Finora qui il riconoscimento di molecole MHC di classe II è stato trattato solo, soprattutto a causa della natura della loro cleft legame peptidico, che è aperto alle due estremità ed accoglie pertanto peptidi più grandi compreso un linker per il fissaggio fluoroforo. In alcuni casi tale approccio potrebbe funzionare anche per l&#39;etichettatura MHC class io molecole 16, ma molta cautela da adottare per verificarne l&#39;utilizzo negli esperimenti. La sensibilità di cellule T verso antigeni, che può essere misurata mediante saggi di proliferazione delle cellule T, così come la cinetica di legame pMHC-TCR misurata in vitro mediante risonanza plasmonica di superficie non dovrebbe essere influenzata dall&#39;aggiunta del linker e fluoroforo per il peptide. In alternativa, MHC classe I assumono molecole possono essere etichettate in modo sito-specifico con l&#39;introduzione di una cisteina spaiato all&#39;interno della sequenza della catena pesante (osservazioni non pubblicate). Con l&#39;uso di opportune sonde molecolari alcuna interazione proteina-proteina sinaptica può in linea di principio essere studiato in modo qui descritto. Tali sonde, ad esempio, SCF V s o Progettato Proteine ​​Ankyrin Ripeti (DARPins) 17, dovrebbero essere monovalenti e dovrebbe legare il loro obiettivo in modo stabile senza influenzare l&#39;interazione di interessi. Naturalmente, informatio strutturalen è altamente desiderabile per la progettazione razionale della sonda ma non assolutamente necessario. Quando si stabilisce un nuovo paio di partner FRET, si consiglia di registrare ed analizzare FRET in massa prima. Siti di attaccamento etichette possono essere variate sensibilmente per massimizzare il segnale FRET e anche per verificare che i rendimenti misurati FRET variano in base alla distanza tra colorante. Una volta che il sistema è ottimizzato, singola molecola FRET segnali possono essere registrati limitando l&#39;etichettatura del grande abbondanza FRET partner 10-30% e sbianca la bassa abbondanza FRET compagno fino a quando le singole molecole sono risolvibili nel campo dell&#39;illuminazione. Ultimo ma non meno importante si deve rilevare che SLB ravvicinamento alcuni, ma non tutti gli aspetti di una membrana plasmatica fisiologico. Qualità come membrana curvatura e flessibilità, compartimentazione dominio, riarrangiamenti citoscheletrici e motilità cellulare, nonché una elevata varietà di proteine ​​di membrana di superficie espressi non sono rappresentate da SLB ma possono influenzare tegli elabora sotto inchiesta. Sarà necessario molto sforzo per essere investito per stabilire le modalità di imaging che permette di seguire in interazioni proteina-proteina con una risoluzione di singola molecola nelle sinapsi fisiologici, che sono inaccessibili per l&#39;imaging TIRF.

Una comprensione più fondamentale di come le cellule T riconoscono antigeni richiede guardando al posto giusto, cioè, all&#39;interno della sinapsi immunologica formato tra la cellula T e APC. Qui, cinetica di legame molecolari non solo sono determinate dalle proprietà intrinseche biochimiche dei partner di interazione coinvolti ma dipendono in larga misura parametri cellulari, che includono forze cellulari, architettura membrana e interazioni laterali tra proteine ​​di membrana e vincoli geometrici specifici sinapsi 3. Approcci biochimici sono limitati in potere risolvente quanto richiedono l&#39;interruzione di almeno una delle membrane sinaptiche coinvolte. Per questo motivo una metodologia di imaging basato FRET-è stato sviluppato per monitorare vincolante del TCR di pMHCs antigeniche 2. Qui le cellule T sono decorati con un ricombinante e il sito-specifico etichettati TCRβ-reattiva singola catena frammento di anticorpo (SCF V) e confrontati con il piano<html> ar bistrati di vetro supportato lipidi (SLB), che ospitano MHC di classe II molecole caricate con un peptide antigenico fluorescente, molecole costimolatorie e proteine ​​di adesione. Synaptic vincolante tra dye-marcato TCR e tingere marcati risultati pMHC in FRET, che possono essere monitorati su una massa e livello di singola molecola per fluorescenza a riflessione totale interna (TIRF) microscopia. In questo articolo viene spiegato in dettaglio come utilizzare SLB per saggiare le sinapsi delle cellule T, verificare la loro integrità attraverso un cellule T saggio di calcio-flux funzionale, condotta FRET misurazioni in massa e con sensibilità singola molecola, e analizzare i dati acquisiti. Le raccomandazioni sono offerti per la produzione di proteine ​​adeguatamente conformati necessarie per doppio strato funzionalizzazione. Per informazioni più specifiche per quanto riguarda la formazione di doppio strato e l&#39;installazione di un microscopio TIRF adatto prega di fare riferimento a un accesso pubblico JoVE aggiuntivo di pubblicazione pubblicato back to back 4. tenda &quot;&gt; Natura di SLB SLB Functionalizable possono essere facilmente generati dalle vescicole unilamellari (SUV) che contengono le due lipidi 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-gylcero-3-fosfocolina (breve: POPC, 90-99%) e sn 1,2-dioleoyl- - glycero-3 - {[N (5-ammino-1-carbossipentil) iminodiacetico acido] succinil} (breve: DGS NTA-Ni, 1-10%). SUV sparsi su vetrini puliti per formare una contigua planare doppio strato 4. DGS-NTA-Ni serve ad ancorare le proteine ​​polyhistidine-tag tramite complesso-formazione polyhistidine mediata con il sintetico NTA-Ni-gruppo contenente testa (Figura 1A). Per stabile associazione uno tipicamente sostituisce il dominio transmembrana e la coda citoplasmatica nativo della proteina di adesione ICAM-1 e la molecola di costimolazione B7-1 con un tag contenente dodici istidine (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (Figura 1B) . La classe II molecola IE k peptide-caricato contiene due catena polipeptidica membrana-embedded (α e β)S. I transmembrana / domini citoplasmatici di entrambe le catene devono essere sostituiti con un tag contenente sei istidine ogni (IE k α β 6H 6H o IE k -2x6H). In alternativa, estendendo la α-catena con dodici istidine e lasciando il dominio extracellulare del β-chain untagged (dando luogo a IE k α β 12H 0H o IE k -12H) dà luogo a risultati soddisfacenti (Figura 1B). Etichettatura site-specific di pMHCs E &#39;importante per etichettare il pMHC stechiometricamente e sito-specifico per essere in grado di convertire i rendimenti misurati FRET in vincolante equilibrio costanti significative. Ciò può essere ottenuto mediante l&#39;etichettatura chimica di un peptide sintetico che viene caricata nella fessura-peptide di legame di istidina-marcato ricombinante MHC di classe II molecole 2,5. Il peptide comprende tutti i residui del epitopo T-cellulare come well come una breve C-terminale linker (GGS), seguita da cisteina (ad esempio nel falena citocromo c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GTECH, il linker è segnato in grassetto). Questo cisteina viene utilizzato per etichettare il peptide stechiometricamente con l&#39;uso di derivati ​​maleimide-dye. A questo punto particolare attenzione dovrebbe essere dedicata alla verifica dye accoppiamento quantitativa al peptide-cisteina contenenti. HPLC-purificazione della addotto peptide-dye è raccomandata e deve essere seguita da spettrometria di massa Elettrospray. Eventuali masse registrate corrispondenti al reagente peptide (senza tintura) riflettono l&#39;etichettatura incompleta. Se questo è vero, il peptide-HPLC purificato deve essere sottoposto a turni consecutivi di colorante etichettatura fino a quando l&#39;etichettatura è considerata quantitativa. Si noti che la spettroscopia di massa MALDI-TOF deve essere evitata in quanto questo metodo comporta la radiazione laser per il campione di ionizzazione. Questo trattamento disintegra fluorofori sensibili collegate prima messa peptide viene letto e quindi underrepre<html> gradi senta di dye-coniugazione. Etichettatura indiretta ma site-specific di TCR cellule legato con l&#39;utilizzo di monovalente singola catena frammenti F V E &#39;ancora difficile da collegare tinture per cellulare proteine ​​di superficie associato di cellule viventi in modo site-specific. Per superare questo ostacolo per TCR-superficie esposta, una versione monovalente singola catena (SCF V) dai geni del TCRβ -reactive anticorpo monoclonale H57-197 2 è stato costruito. La struttura cristallina di questo anticorpo in complesso con il TCR permette di progettare razionalmente una versione, in cui un residuo di serina in prossimità del C-terminale del peptide associato MHC (cui è collegato il corrispondente partner di tintura FRET) è sostituito con un residuo di cisteina. Questo mutante cisteina serve poi come accettore per tinture coniugazione (Figura 2). Metodologie di registrare FRET nt &quot;&gt; valori FRET Bulk sono più adatti a verificare il rapporto tra scelte distanze inter-dye e FRET efficienza misurati in questo TCR-pMHC sistema 2 vincolante. Inoltre, le misure di FRET rinfusa rivelano differenze qualitative e quantitative in sinaptiche affinità TCR-pMHC ( vedere di seguito e la sezione protocollo 3.2). Vari approcci per quantificare l&#39;efficienza FRET sono stati introdotti nella letteratura 6. In questo articolo viene registrata tramite FRET (a) recupero del donatore dopo accettore candeggio, e via (b) sensibilizzati FRET emissione accettante. Il primo metodo (a) richiede l&#39;uso di un accettore FRET facilmente fotodecolorate, e un donatore, che è piuttosto fotostabile. Inoltre, è importante garantire che l&#39;accettore fotodecolorate non è più in grado di tempra fluorescenza del donatore. Come lo stesso canale di rilevamento (donatore) è usato per la quantificazione, senza fattori di correzione di und senza aberrazioni cromatiche devono essere considerati, che rende questa metodologia semplice ed affidabile. Tuttavia, le misure quantitative non possono essere ripetuti nello stesso punto del campione e le variazioni di FRET non possono essere registrati nel corso del tempo. Per evitare effetti causati dalla diffusione molecolare o motilità cellulare un passo sbiancamento veloce dovrebbe mirare per, che riduce al minimo il tempo che passa tra il primo donatore FRET (prima accettore sbiancamento) e la seconda acquisizione immagine FRET donatore (dopo FRET accettore candeggio). Si raccomanda di utilizzare una potente fonte di luce laser del FRET accettore di eccitazione lunghezza d&#39;onda al fine di minimizzare illuminazione e sbiancanti volte. Al contrario, nel metodo di misura sensibilizzata emissione FRET (b) il donatore FRET è eccitato e l&#39;emissione del accettore FRET è osservata nel canale FRET accettore. Le variazioni di segnale accettore FRET possono essere registrate nel tempo, ma di emissione del donatore FRET nel canale accettore rosso-spostato (termed bleedthrough) e FRET accettore cross-eccitazione tramite eccitazione del donatore devono essere determinati con precisione e sottratto dal canale accettore FRET registrato. Per questo i corrispondenti FRET donatore e ti agiti immagini accettore devono essere spazialmente allineati. Rilevamento di singola molecola (sm) FRET eventi Con l&#39;uso di laser come sorgente di eccitazione, una macchina fotografica sensibile e microscopia TIRF rumore attenuato la fluorescenza di fluorofori singoli sia facilmente rintracciabile nel tempo. Simile è vero per la rilevazione di eventi smFRET intermolecolari. Tuttavia, le complicanze possono essere causati da bleedthrough donatore FRET e cross-eccitazione del accettore FRET, e, quindi, grande attenzione deve essere presa durante la regolazione delle densità fluoroforo nell&#39;esperimento smFRET. Nel protocollo di seguito (sezione del protocollo 4) il TCR è stato scelto come FRET donatore in alta abbondanza e pMHC come accettore FRET in condizioni di scarsa abbondanza. Per attenuare FRET donatore bleedthrough sufficientemente, decorare 10-30% dei TCR con SCF fluorescenti V e 90-70% dei TCR con SCF non fluorescente V. Qui il canale accettore FRET è stato scelto come canale di singola molecola, perché è confocale con la singola molecola FRET canale. Questo aiuta ad allineare eventi smFRET con singola molecola FRET accettori, che è alla base della convalida smFRET. Estrazione off-tariffe sinaptiche attraverso misure smFRET Photobleaching sia FRET donatore e accettore FRET devono essere contabilizzate quando si estrae l&#39;emivita di interazioni di singola molecola FRET tracce. Il numero di FRET-segnali osservabili all&#39;inizio del loro aspetto come singola coppia donatore-accettore N (0) si riduce nel tempo sia unbinding del photobleaching complesso e del recettore-ligando. Il numero di sopravvivere complessi in un dato momento N (t) può essere matematicamente espresso come segue: Nel termine photobleaching exp (-t / τ candeggina) il tempo t è descritta dal prodotto del numero di osservazioni n e il tempo t illuminazione malato a causa della, modalità di osservazione discreta non continuo (cioè, sbiancamento si verifica solo durante illuminazione ). All&#39;interno exp- cinetica termine (t / τ off) il tempo t è il prodotto del numero di osservazioni e n t ritardo per una singola osservazione FRET (cioè, unbinding cinetica accade continuamente). Equazione 1 può essere espresso come: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq2.jpg" /> Il τ termine candeggina / τ ill describes il numero di osservazioni finché non si verifica sbianca ed è definito come il valore atteso &lt;n candeggiare&gt; della sua funzione esponenziale. Equazione 2 può essere semplificata come segue: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq3.jpg" /> Il valore di aspettazione &lt;n (t ritardo)&gt; il numero di frame N (t) con osservabili FRET-eventi dopo il tempo t è determinata direttamente dall&#39;esperimento. Dipende dal tempo impostabile tra osservazioni (t lag) scelti per l&#39;esperimento ei valori sconosciute per τ off (l&#39;inverso del off-rate k off) e &lt;n candeggiare&gt;, il valore di aspettazione di numero di osservazioni prima che si verifichi lo sbiancamento . Pertanto, il calcolo del valore atteso &lt;n (t lag)&gt; per almeno due valori di t <sub&gt; ritardo permette la determinazione sperimentale di &lt;n candeggina&gt; e T si spegne. Estrazione valori sinaptici 2D-K D attraverso misurazioni basate FRET- Misurazione TCR occupazione una, vale a dire il rapporto tra TCR legati e TCR totale, è fondamentale per la determinazione dei valori sinaptiche 2D-K D. Secondo l&#39;equazione 4 questo termine è direttamente proporzionale alla misurata FRET cedere finché TCR serve come donatori FRET e pMHCs come accettori FRET. <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq4.jpg" /> con una capienza = TCR, C = fattore di conversione C è una costante che dipende dal sistema FRET e fluorofori utilizzati. Può essere determinato sperimentalmente come mostrato di seguito. A può essere convertito in un 2D-K D secondo l&#39;equazione 5 quando ildensità iniziale di ligandi TCR prima dell&#39;aggiunta di cellule T a doppio strato è noto. Questo è a causa della elevata mobilità delle proteine ​​SLB iscritti e anche perché SLB fornire un serbatoio quasi inesauribile di ligandi 2. <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq5.jpg" /> con [iniziale pMHC] = densità iniziale pMHC prima dell&#39;aggiunta di cellule T Con le equazioni 4 e 5 si può ora facilmente determinare il sinaptica 2D-K D tra TCR e pMHC. Questo è più affidabile fatto con le misure di FRET basati sul recupero dei donatori dopo accettore sbiancamento (vedi paragrafo 3.1 del protocollo). Tuttavia, per misurare C il rapporto tra l&#39;intensità FRET I Fret (corretto per lo sfondo, bleedthrough donatore FRET e FRET accettore cross-eccitazione) e TCR occupazione una deve essere determinato. Per questo, unoha bisogno di conoscere il rapporto R tra l&#39;intensità media di fluorescenza di fluorofori singoli TCR-associati FRET donatore (ad esempio Cy3 o AF555) sm Mi struggo donatore e l&#39;intensità media di singola molecola Fret eventi sm I tasto. R dipende dal sistema FRET in questione, e filtri di emissione telecamera utilizzato per il rilevamento della fluorescenza. Il TCR occupazione a può poi essere determinata direttamente secondo l&#39;equazione 6. <img alt="Equazione 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157eq6.jpg" /> R = sm Mi struggo donatore / sm I Fret R è stato determinato come 1,45 per il sistema H57 scFv- Cy3 / pMHC-Cy5 porta a: a = massa Mi struggo / bulk I TCR-Cy3 • 1.45 Il rapporto tra l&#39;occupazione e TCR un rendimento FRET può essere determinata FRET donatore recuperarey dopo accettore sbiancamento. Per questo entrambi i parametri sono tracciati uno contro l&#39;altro per un numero TCR microcluster come mostrato nella Figura 4A .La pendenza della regressione lineare indica il fattore di conversione C (dall&#39;equazione 4). Come mostrato nella Figura 4A, C equivale per (a) V H57 scf - Cy3 / Cy5 pMHC-sistema FRET e (b) la configurazione del sistema microscopio applicato a 1.995. Il TCR occupazione a può essere facilmente dedurre come segue: Occupazione TCR a = FRET cedere • 1.995

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td >bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf900 II</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >10227402</td>
			<td>insect cell media for baculo virus production</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10564038</td>
			<td>insect cell media for baculo virus expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>cells for virus production and expansion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Five Cells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>B855-02</td>
			<td>cells for potein expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LB-media</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10000713</td>
			<td>bacterial expression</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate System</td>
			<td>Pall</td>
			<td></td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Centramate cassette 10kDa cutoff</td>
			<td>Pall</td>
			<td>OS010T12</td>
			<td>protein concentartion from large volumes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td >5123</td>
			<td>protein concentartion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >&#196;kta pure 25L</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>29-0182-24</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 200 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5175-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Superdex 75 10/300 GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5174-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mono Q 5/50GL</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5166-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5318-01</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricorn 10/20 column&#160;</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >28-4064-13</td>
			<td>protein purification</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gilson HPLC system</td>
			<td >Gilson</td>
			<td ></td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*250mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000250X212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pursuit XRs C18, 5 &#181;m particle size, 21.2*50 mm column size</td>
			<td >Agilent</td>
			<td >A6000050G212</td>
			<td>purificationof fluorochrome-coupled peptides</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy3 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA23031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cy5 maleimide</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td>PA25031</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td>A-20346</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Alexa Fluor 647 C2 Maleimide</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-20347</td>
			<td>site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fura-2, AM, cell permeant</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >F-1221</td>
			<td>calcium-sensitive dye for cell labeling</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dimethyl sulfoxide</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >151874</td>
			<td>for dissolving fura-2 am</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution plus calcium/magnesium</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >10225362</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine Serum Albumin lyophilized powder</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td>supplement for imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14-4-4S antibody</td>
			<td >affimetrix eBioscience</td>
			<td >14-5980-81</td>
			<td>blocking antibody for H2-I-Ek (recognized by the 5c.c7, 2B4 and AND TCR)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 ml polypropylene round-bottom tube</td>
			<td >Becton Dickinson</td>
			<td >FALCON 352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.22 &#956;m Ultrafree-MC centrifugal filter unit</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >UFC30GV0S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Syringe filter 0.2&#181;m</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >GVWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TetraSpeck Microspheres, 0.1 &#181;m, fluorescent blue/green/orange/dark red</td>
			<td >Life technologies</td>
			<td >T-7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for fura-2-based calcium measurements&#160;</td>
			<td >LEICA</td>
			<td >DMI4000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope for (single molecule) FRET measurements</td>
			<td >LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS</td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >planar supported lipid bilayers</td>
			<td ></td>
			<td >for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640, with L-Glutamine</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >11554416</td>
			<td>T-cell media</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >non-essential amino acid 100X</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SH30238.01</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicillin/streptomycin/L-glutamine 100x</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >12000226</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2-mercaptoethanol</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >M6250</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse interleukin-2 recombinant protein</td>
			<td >BPS Bioscience</td>
			<td >90185-B</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Research Grade Fetal Bovine Serum</td>
			<td >Hyclone</td>
			<td >SV30160.03</td>
			<td>T-cell media supplement</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Origin (analysis program)</td>
			<td >OrigenLab</td>
			<td >http://www.originlab.com/</td>
			<td>non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag])</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring tcr-pmhc binding in situ using a fret-based microscopy assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

La registrazione di calcio intracellulare attraverso il fura-2 calcio colorante nonché l&#39;analisi cellulare successiva per verificare la potenza stimolatorio e quindi la funzionalità di SLB sono mostrati in Figura 4. Come risulta evidente, i livelli di calcio aumentano in cellule T (espressa come normalizzata fura-2 340nm / 380nm rapporto con basale essere 1) immediatamente non appena si sistemano sulle SLB stimolanti. I livelli di calcio ritornano ai livelli basali poco dopo l&#39;aggiunta di un anticorpo che blocca pMHCs da TCR impegno e che termina l&#39;attivazione delle cellule T. Figura 6 illustra un tipico esperimento coinvolge recupero donatore accettore FRET dopo candeggio, che viene impiegato per misurare la resa FRET e che serve per calcolare i valori 2D-K D (mostrato in Figura 4). Si prega di notare l&#39;aumento di intensità dei donatori FRET, che rappresenta TCR etichettato via AF555, dopo una rapida e completa ablazione della FRET unSpecie cceptor (qui: AF647 associato con pMHCs). Inoltre è evidente il forte riduzione canale FRET, cioè, il canale FRET-accettore FRET sotto eccitazione donatore, dopo FRET accettore candeggio. Il segnale restante appena visibile corrisponde a preoccuparsi bleedthrough donatore. I rendimenti FRET all&#39;interno dei singoli microcluster TCR o intere sinapsi sono calcolati sulla base dei valori di intensità misurati indicati (Figura 6B). La figura 7 illustra una traiettoria e lasso di tempo di una singola molecola FRET evento visibili in due tempi. Come indicato sopra nell&#39;introduzione tale comportamento è causato da entrambi decadimento sinaptica TCR-pMHC vincolanti e photobleaching. Per discriminare tra questi due contributi, i tempi di acquisizione sperimentali devono essere variato in durata: mentre fotoscolorimento rimane costante, le variazioni di lunghezza FRET traiettoria evento sono causati solo dalla cinetica di legame. Una quantificazione di tracelengths, w<html> hich costituisce la base per il calcolo di fuori dei prezzi e candeggio mostrati nella Figura 7, sono forniti nelle tabelle da 1 a 3. Determinazione del 2D-K D s richiede la registrazione di massa FRET rendimenti per FRET-donatori TCR etichettati. Con l&#39;uso della costante C sperimentalmente dedotta (figura 4), ​​una resa FRET misurato per un microcluster TCR o un&#39;intera sinapsi può essere convertito nel TCR occupazione a, cioè il rapporto di TCR pMHC-impegnati e totali (Figura 4C) . Con note densità pMHC presenti sul SLB prima dell&#39;aggiunta della cellula T, a valori possono essere utilizzati per determinare i valori 2D-K D (Figura 4D sinaptiche). On-tassi possono essere calcolate con la legge di azione di massa (2D-k on = 2D-k off / 2D-K D) dal sinaptica determinato off-rate e valori 2D-KD. 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53157 / 53157fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. schema schematica del sistema piano-oggetti sostenuto doppio strato lipidico (SLB). (A) SLB sono composte da POPC (90-99%) e il lipide sintetico DGS Ni-NTA (1-10%) e si formano spontaneamente quando le superfici di vetro pulito pagano con piccole vescicole unilamellari (SUV) costituito da lipidi corrispondenti. (B) Una volta formato, tali SLB possono essere funzionalizzati con solubili porzioni polyhistidine-tagged extracellulari derivati ​​da pMHCs, costimolatorie B7-1 proteine ​​e ICAM-1 proteine ​​di adesione, per servire da APC per le cellule T. Per ulteriori informazioni sulla preparazione SLB fare riferimento a Axmann et al. 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig2.jpg" /> Figu<html> re 2. Förster Resonance Energy Transfer basato test per quantificare TCR-pMHC binding in situ. (A) Struttura composita di un TCR complessata con un frammento di catena singola H57 impegnare un pMHC illustra l&#39;approccio basato FRET-descritto. Si noti la breve distanza di circa 41 bis che separa i due fluorofori corrispondenti sottoposti FRET. Siti accettori per fluoroforo maleimmidi sono indicate in verde e rosso. (B) Il principio di rilevare interazioni TCR-pMHC in situ è illustrata. Solo SCF V -decorated TCR e pMHCs (qui k IE), che formano complessi specifici, dar luogo ad un segnale FRET misurabile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;/&gt; Figura 3. cromatogrammi della finale fase di filtrazione gel dando luogo a monomeriche SCF V s e peptide-caricato IE k -2x6H molecole. Assi X rappresentano il volume di ritenzione in ml, assi Y indicano assorbanza a 280 nm in unità arbitrarie (AU) . (A) H57 SCF V sito-specifico marcato con Alexa Fluor 555 maleimmide è stato sottoposto a cromatografia S75 separare colorante non reagito dalla proteina (fase 1.2.5). Frazioni corrispondenti a intervallo di ritenzione 14 a15 ml (linee tratteggiate) rappresentano etichettati monomero H57 SCF V. (B) IE k molecole -2x6H complessati con il titolare ANP-spazio peptide UV-cleavable era stato-UV irradiati, incubate con il sito-specifico Alex 647 maleimmide peptide marcato ed infine sottoposto a cromatografia S200 per separare le proteine ​​peptide libero (passo 1.1.2.4). L&#39;intervallo tra le linee tratteggiate contiene opportunamente piegato e pMHCs monomeriche. (A, B) </sTrong&gt; 0,7 ml campione è stato applicato alla colonna all&#39;inizio del rum (0 ml punto). Frazioni raccolte sono state concentrate. Il rapporto proteine-to-dye è stata determinata photospectrometry prima dialisi contro PBS / 50% glicerolo (per la conservazione a -20 °). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig4.jpg" /> Figura 4. Determinazione 2D-K D s e 2D-k a s. (A) La correlazione tra il rendimento FRET sulla base del recupero dopo donatore accettore candeggio e occupazione TCR è stata misurata sperimentalmente. Occupazione TCR può essere determinato per le singole microcluster TCR come spiegato nel paragrafo 4.2. Una misura lineare di visualizzazione dei dati dalla linea, la pendenza che è uguale al rapporto tra C TCRoccupazione e la resa FRET. C è una costante specifica per il sistema FRET e fluorofori (Cy3 e Cy5 qui) impiegati. In questo esempio ha prodotto 1.988. (B) FRET dati di rendimento sono stati determinati per le singole microcluster TCR (N = 187, temperatura = 24 ° C) attraverso il recupero donatore accettore sbiancamento. Numeri inferiori barre dell&#39;istogramma indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (C) Conversione dei dati mostrati in (B) moltiplicando misurata FRET rese con la costante C determinato in (A). Numeri sotto barre indicano il limite superiore entro l&#39;intervallo. (D) Istogramma (semi-logaritmica, base = 4) raffigurante la distribuzione di 2D-K D s misurato per i singoli microcluster TCR. La mediana 2D-K D è indicato in blu. Numeri sotto barre indicano il limite superiore all&#39;interno dell&#39;intervallo. (E) L&#39;istogramma mostrato in (D) è stato convertito intoa 2D-k su -histogram (semi-logaritmica, base = 4) che impiega il k sinaptica off per 24 ° C (0,41 s -1). La mediana determinato 2D-k sul valore è indicato in blu. I dati sono stati originariamente pubblicati in Huppa et al. 2 e sono visualizzati qui in un nuovo formato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig5.jpg" /> Figura 5. validazione funzionale di SLB impiegato per la stimolazione delle cellule T e di imaging. (A) TCR-transgenici esplosioni cellule T caricate con fura-2 sono stati confrontati con stimolante SLB ospitare pMHCs antigeniche, ICAM-1 e B-7. Cellular emissione fura-2 eccitato a 340 nm e 380 nm così come le immagini sono state registrate DIC. Come indicato, i valori del rapporto di intensità di emissione eccitate a 340 e 380 nm sono mostrati nel pannello di destra. L&#39;aggiunta di pMHC anticorpi bloccanti 14 min nel periodo sperimentale si conclude con una diminuzione dei livelli intracellulari di calcio paragonabile a quella delle cellule T a riposo. (B) Un profilo tipico temporale di rapporti medi Fura-2 in T-cellule contatto SLB stimolazione è caratterizzata da un primo aumento del calcio intracellulare, che è da 2 a 4 volte superiore rispetto a quella delle cellule T non attivati ​​o T-cellule prive dell&#39;antigene dopo blocco mediata da anticorpi. Cerchi verdi indicano i punti temporali illustrati in (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig6.jpg" /> Figura 6. Bulk FRET rendimenti, come misurato attraverso il recupero dei donatori FRET dopo FRET accettatore sbiancamento. <strong&gt; (A) si riporta un esempio di una tipica FRET misurazione sinaptica. Come è indicato sulla sinistra e sulla sommità di una serie di immagini è stato acquisito con l&#39;uso di un divisore di fascio di emissione dando origine ad un donatore FRET e un canale FRET accettore (per informazioni più dettagliate sul beam splitter riferiscono Axmann et al 4). La linea mostrata nell&#39;immagine DIC sinistra indica il limite della sinapsi T-cellule. Si noti la perdita di intensità all&#39;interno del canale accettore FRET così è l&#39;aumento di intensità nel canale donatore FRET dopo FRET accettore sbianca (fase 4). (B) FRET efficienza può essere quantificato come indicato per singole regioni sinaptici o per interi sinapsi. Per l&#39;ispezione, le immagini prima e dopo FRET accettatore di sbiancamento sono riportati con l&#39;uso di due tabelle di ricerca (LUT, verde e fisica). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig7.jpg" /> Figura 7. singola molecola FRET eventi appaiono e scompaiono passi insingle e sono perfettamente allineati con un unico fluoroforo accettore FRET. Viene mostrato il lasso di tempo di singola molecola evento FRET. Immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera retroilluminato EMCCD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53157/53157fig8.jpg" /> Figura 8. Determinazione τ off = 1 / k off da traiettorie smFRET misurati. (A) Le somme cumulative normalizzati di segnali FRET osservabili (derivati ​​da H57 SCF V -AF555 decorate 5c.c7 TCR esplosioni transgenici cellule T che riconosce IE &lt;sup&gt; k / K3-AF647 a 24 ° C) per quattro differenti ritardi temporali (42 msec, 490 msec, 1.007 msec, 1,989 msec) sono stati tracciati in funzione del numero totale di osservazioni. Funzioni in forma mono-esponenziale danno luogo a corrispondenti l&#39;inverso negativo dei valori di aspettativa &lt;n (t ritardo)&gt;. (B) valori di aspettazione sono stati tracciati contro i ritardi t lag e montati utilizzando l&#39;equazione &lt;n (t ritardo)&gt; = τ off / {(t off / &lt;n candeggina&gt;) + t lag} cedere τ off e &lt;n candeggina&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53157/53157fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Misurazione TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzando un microscopio saggio basato FRET-

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

measuring-tcr-pmhc-binding-in-situ-using-a-fret-based-microscopy-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

12.2K Views.  Vienna University of Technology. This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer. 

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

Misura quantitativamente In situ Flussi utilizzando un autorespiratore subacqueo Velocimetry (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Ricerca

Bioingegneria

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in medical diagnostics, and for life detection by robotic missions to other planets and moons of the solar system. Currently, sparse bacterial samples are counted by culture plating or epifluorescence microscopy. Culture plates require long incubation times (days to weeks), and epifluorescence microscopy requires extensive staining and concentration of the sample. Here, we demonstrate how to use off-axis digital holographic microscopy (DHM) to enumerate bacteria in very dilute cultures (100-104 cells/mL). First, the construction of the custom DHM is discussed, along with detailed instructions on building a low-cost instrument. The principles of holography are discussed, and a statistical model is used to estimate how long videos should be to detect cells, based on the optical performance characteristics of the instrument and the concentration of the bacterial solution (Table 2). Video detection of cells at 105, 104, 103, and 100 cells/mL is demonstrated in real time using un-reconstructed holograms. Reconstruction of amplitude and phase images is demonstrated using an open-source software package.

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

Digital holographic microscopy (DHM) is a volumetric technique that allows imaging samples 50-100X thicker than brightfield microscopy at comparable resolution, with focusing performed post-processing. Here DHM is used for identifying, counting, and tracking microorganisms at very low densities and compared with optical density measurements, plate count, and direct count.

Quantificare i microrganismi alle concentrazioni basse usando microscopia digitale oleografica (DHM)

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. The tomato-P. syringae pv. tomato pathosystem is widely used to dissect the genetic basis of plant innate responses and disease resistance. While disease was successfully managed for many decades through the introduction of the Pto/Prf gene cluster from Solanum pimpinellifolium into cultivated tomato, race 1 strains of P. syringae have evolved to overcome resistance conferred by the Pto/Prf gene cluster and occur worldwide.
Wild tomato species are important reservoirs of natural diversity in pathogen recognition, because they evolved in diverse environments with different pathogen pressures. In typical screens for disease resistance in wild tomato, adult plants are used, which can limit the number of plants that can be screened due to their extended growth time and greater growth space requirements. We developed a method to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance, which minimizes plant growth time and growth chamber space, allows a rapid turnover of plants, and allows large sample sizes to be tested. Seedling outcomes of survival or death can be treated as discrete phenotypes or on a resistance scale defined by amount of new growth in surviving seedlings after flooding. This method has been optimized to screen 10-day-old tomato seedlings for resistance to two P. syringae strains and can easily be adapted to other P. syringae strains.

High-Throughput Identification of Resistance to Pseudomonas syringae pv. Tomato in Tomato using Seedling Flood Assay

The seedling flood assay facilitates rapid screening of wild tomato accessions for the resistance to the Pseudomonas syringae bacterium. This assay, used in conjunction with the seedling bacterial growth assay, can assist in further characterizing the underlying resistance to the bacterium, and can be used to screen mapping populations to determine the genetic basis of resistance.

Identificazione ad alto contenuto di velocità effettiva della resistenza a Pseudomonas syringae pv. Pomodoro nel pomodoro utilizzando Seedling Flood Assay

Tomato is an agronomically important crop that can be infected by Pseudomonas syringae, a Gram-negative bacterium, resulting in bacterial speck disease. ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...