Siamo grati a S. Taylor per la prestazione del pLPCX-istoni H2-GFP plasmide. Ringraziamo R. Mertelsmann per il supporto continuo. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Semina di U2OS a base di ciclina B-SNAP cellule Reporter (Clone 11 celle 6) su vetrini per microscopio Camera <ol><li> Tripsinizzare subconfluenti cellule giornalista SNAP che sono stati autorizzati a crescere in modo asincrono in fase di log per almeno 48 ore. </li><li> Lavorare con 8 camere e microscopio (distribuzione costante di cellule). </li></ol> Per la semina di cellule su 8 camere microscopio e ad una distribuzione costante su tutta la superficie della camera di microscopio, centrifuga 10.000 cellule e risospendere in 350 pl di rosso fenolo terreno privo crescita normale (integrato con 10% siero fetale bovino, penicillina / streptomicina e sodio piruvato). Trasferire sospensione cellulare alla camera microscopio (Figura 2). Lavorare con 8 camere e microscopio (densità cellulare massima al centro). Per la semina di cellule ad una densità superiore al centro del chamb microscopioer, caricare la camera con 300 ml di rosso fenolo terreno privo di una crescita normale. Aggiungere 5.000 cellule attenzione al centro della camera microscopio (Figura 2). Lavorare con ben 96 piatti speciali ottiche (distribuzione costante di cellule). Per la semina di cellule su piastre da 96 pozzetti ad una distribuzione costante su tutta la superficie del pozzetto, centrifugare 5000 e risospendere le cellule in 300 microlitri di rosso fenolo terreno privo di crescita normale. Trasferire la sospensione cellulare di una piastra a 96 pozzetti. A seconda del numero totale di cellule contenenti pozzetti necessari, regolare il numero di cellule e il volume totale del mezzo di sospensione (Figura 2). Lavorare con ben 96 piatti speciali ottiche (densità cellulare massima al centro). Per la semina di cellule su piastre a 96 pozzetti, aggiungere con cautela 1.500 cellule in 15 ml di rosso fenolo terreno privo di crescita normale in un smalL goccia al centro di ogni pozzetto per ottenere restrizione della crescita cellulare al centro del pozzetto (Figura 2). <ol start="3"><li> Permettono cellule seminate a crescere per almeno 18 ore in condizioni standard di coltura cellulare (37 ° C, umidità 100%, 5% CO 2). </li></ol> 2. Colorazione di cellule Reporter con substrato SNAP <ol><li> 30 min prima dell&#39;inizio della procedura di colorazione permettono aliquote di rosso fenolo terreno privo crescita normale riscaldare fino a 37 ° C. </li><li> Per una facile manipolazione del substrato SNAP (nel nostro caso TMR stella) sciogliere stella TMR in DMSO per ottenere una concentrazione nella soluzione stock di 400 pM, che può essere conservato a -20 ° C. </li><li> Prima della colorazione, diluire 0,5 ml di soluzione TMR magazzino stella in 200 pl di rosso fenolo terreno privo crescita normale (37 ° C) per ottenere una concentrazione finale di 1 pM etichettatura. </li><li> Estrarre il supporto di normale crescita delle cellule in modo asincrono in crescita e incubare in lAbeling media per 25 minuti in condizioni di coltura standard. </li><li> Rimuovere etichettatura celle medie e lavare quattro volte con rosso fenolo mezzo privo crescita normale (37 ° C). Incubare le cellule in 300 microlitri di rosso fenolo terreno privo crescita normale (37 ° C) per 30 min. Prima del trasporto al microscopio sostituire il mezzo fresco con rosso fenolo terreno privo crescita normale (37 ° C) per rimuovere residui di substrato SNAP non legato. </li><li> Cellule di trasporto al microscopio in una scatola di polistirolo su un pre-riscaldato (37 ° C) blocco termico per ridurre al minimo variazione di temperatura. </li></ol> 3. Misurazione dell&#39;intensità di fluorescenza <ol><li> Due ore prima dell&#39;analisi regolare la temperatura della camera climatica a 37 ° C in modo secco per portare l&#39;intera microscopio con tutti i suoi componenti alla temperatura desiderata. Pre-riscaldamento prima di impostare l&#39;umidità è importante per evitare danni condensazione e successiva al microscopio. </li><li> Regolare t umidità dell&#39;ariao 60% e CO 2 al 5% prima dell&#39;inizio dell&#39;analisi. </li><li> Avviare il software di acquisizione di scansione ^ R e definire le impostazioni standard (vedi tabella 1). </li><li> Definire le posizioni dei pozzetti da analizzare. </li><li> Definire il At (tempo di ciclo di acquisizione) e il numero assoluto di cicli di acquisizione. </li><li> Se l&#39;analisi di un maggior numero di pozzi è desiderato, selezionare autofocus hardware, altrimenti è sufficiente utilizzare solo software autofocus. </li><li> Avviare l&#39;acquisizione e supervisione per i primi due cicli di acquisizione. Il microscopio si concentrerà sul istoni H2-GFP segnale, con successiva acquisizione di una prima immagine in quel canale prima del filtro viene modificata e la corrispondente immagine viene acquisita stella TMR (Figura 3). Questo viene quindi ripetuto per tutte le posizioni all&#39;interno di un pozzo e per ciascuno dei pozzetti da esaminare, prima di ripetere nuovamente il ciclo successivo. </li></ol> 4. Analisi di Proteolytic u profilicantare Scan ^ R <ol><li> Avviare il software di analisi Scan ^ R e analizzare le immagini con i nuclei delle cellule, come visualizzato mediante istoni H2-GFP, definito come l&#39;oggetto principale, tramite una soglia in base all&#39;intensità del segnale e un algoritmo spartiacque per aiutare a separare cellule vicine. Una sotto-oggetto costituito da un nucleo con il citoplasma deve essere creato per l&#39;analisi TMRstar. (Proprietà importanti dell&#39;oggetto principale sono posizioni X e Y, l&#39;ora e la massima e media intensità di BPA per l&#39;oggetto principale e l&#39;intensità totale diviso per area per il subobject TMRstar.) Questo processo di analisi può richiedere diverse ore a causa di dati di grandi dimensioni quantitativi. </li><li> Cambiare modalità di tracciare per visualizzare la media subobject TMR stella intensità di fluorescenza nel tempo (tracce cellulari), assegnato a oggetti analizzati principali (Figura 4). Il numero di cellule da esaminare può essere ridotto dal gating su tali misure di durata almeno 140 cicli e ad alta intensità massima di H2-GFP. Guardandoa un numero maggiore di cellule permette un rappresentante prima e vista obiettivo (Figura 4). </li><li> Selezionare una traccia di cellule di visualizzare istoni H2-GFP e TMR stella fluorescenza simultaneamente a livello di singola cellula (Figura 5A). </li><li> Utilizzando il tasto destro del mouse su una cella di interesse e generare una galleria di foto esportabile per l&#39;illustrazione delle istone H2-GFP e ciclina B-SNAP stella TMR per ogni punto di volta. </li><li> Passare alla modalità di popolazione del software ^ Scan Analisi R e porta la regione in cui è rappresentata la cella di interesse nella proprietà vs X Y punto (Figura 5B). </li><li> Applicare una nuova finestra diagramma a punti per la regione gated e visualizzare significa TMR stella intensità di fluorescenza nel tempo (Figura 5C). </li><li> Esportazione dei dati (tempo e l&#39;intensità di fluorescenza) in Microsoft Excel per il calcolo ulteriore. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Ficoure 5D e 5E illustrano cinetica ciclina B, rappresentata da una intensità TMR stella curva di fluorescenza, di una cellula che avviene con la mitosi normale senza segni di disallineamento cromosomico (Figura 5E). Su compattazione del citoplasma seguente suddivisione involucro nucleare (NEBD, come indicato dal triangolo rosso), TMR stella intensità di fluorescenza mostra un aumento brusco finché la finestra isomorfi (zona luminosa nel diagramma) viene raggiunta quando la cellula entra prometafase 6. Intensità di fluorescenza rimane ad un livello stabile finché procede cellulari attraverso profase e metafase e quindi inizia a scendere rapidamente una volta tutti i cromosomi hanno stabilito una piastra stabile metafase (Figura 5D e 5E). Questo calo precede la separazione dei cromosomi durante l&#39;anafase (punto blu sulla curva). Nel tardo mitosi la cromatina comincia a decondense (barre blu) e la cellula adotta morfologia interfase mentre la curva si avvicina ad una intensità di fluorescenzaplateau che è inferiore alla prima mitosi plateau (Figura 5D e 5E). <table border="1"><tbody><tr><td> Autofocus impostazioni </td><td> Istoni H2-GFP (principali impostazioni di acquisizione degli oggetti) </td><td> Ciclina B-SNAP marcato con TMR stella (Impostazioni di acquisizione) </td><td> Tempo di ciclo di acquisizione Ripetizioni </td></tr><tr><td> Coarse autofocus + / -39 micron 24 strati Belle messa a fuoco automatica + / -5,4 Micron 14 strati </td><td> GFP filtro impostato: Tempo di esposizione: 100 msec Intensità luminosa: 25% </td><td> TRITC filtro impostato: Tempo di esposizione: 150 msec Intensità luminosa: 33,3% </td><td> 2 a 5 min. </td></tr><tr><td> GFP filtro impostato: Tempo di esposizione: 12 msec Intensità luminosa: 12,5% </td><td></td><td></td><td> Fino a 48 ore di analisi continua (limitata dalla ridotta umidità dell&#39;aria del 60%) </td></tr></tbody&gt; </table> Tabella 1. Impostazioni standard come utilizzate per l&#39;analisi di proteolisi ciclina B. Histone H2-GFP è stato utilizzato come struttura di riferimento per definire il piano di messa a fuoco per la misurazione della ciclina B-SNAP intensità di fluorescenza. Intensità di luce durante la procedura di messa a fuoco sono inferiori rispetto alle impostazioni di acquisizione delle immagini per evitare di fototossicità cumulativo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig1.jpg" /> Figura 1. Schematico della misurazione della proteolisi ciclina B attraverso l&#39;espressione di un derivato chimerico ciclina B degradazione con caratteristiche simili alla proteina endogena. Il calo di intensità di fluorescenza dopo pulse-chase etichettatura è una misura di APC / C-attività. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi di celle 8 pozzetti o piastre da 96 pozzetti. Distribuzione regolare deicellule attraverso la superficie del pozzetto è realizzato mediante risospensione in un volume finale di 300 microlitri ed è consigliata, se solo posizioni singola o poche sono definiti manualmente per l&#39;analisi. Arricchimento delle cellule nella regione centrale si ottiene per aggiunta di cellule al centro di pozzetti preriempite o vuoto. Questa tecnica è consigliata in caso di acquisizione di immagini automatizzata in pozzi diversi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig3.jpg" /> Figura 3. Sequenza di acquisizione dei dati. A) Individuazione di istoni H2-GFP è utilizzato per la definizione del piano di messa a fuoco e il controllo di allineamento dei cromosomi durante la mitosi. B) intensità di fluorescenza delle intensità di fluorescenza TMR stella è una misura per la quantità assoluta di pulse-chase marcato ciclina B-SNAP. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante Scan rappresentazione ^ Analisi R basata su software di media TMR Stellaintensità di fluorescenza (intensità TMRstar totale diviso per zona), nel corso del tempo. Selezione di una traccia cella rappresentante (blu). Le immagini corrispondenti (mostrato a destra) consentono la visualizzazione simultanea di istoni H2-GFP (verde) e ciclina B-SNAP (rosso). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4239/4239fig5.jpg" /> Figura 5. A + B) Esempio di gating dei punti che rappresentano una cella di interesse sulla XY-dot plot. C) Visualizzazione della fluorescenza media TMRstar (intensità TMRstar totale diviso per zona) nel tempo con il dot-plot. D + E) Rappresentante curva di intensità di fluorescenza della ciclina B-SNAP con finestra isomorfi (campo brigher nel diagramma) tra NEBD (rottura involucro nucleare) e cromatina decondensazione (barra blu) come generato in Microsoft Excel. Anafase viene indicato con tegli punto blu sulla curva. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4239/4239movie1.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare filmati supplementare</a> .

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	<li>Musacchio, A., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spindle-assembly+checkpoint+in+space+and+time.">The spindle-assembly checkpoint in space and time.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).</li><li>Nasmyth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregating+sister+genomes:+the+molecular+biology+of+chromosome+separation.">Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation.</a> Science. 297, 559-565 (2002).</li><li>Cahill, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+mitotic+checkpoint+genes+in+human+cancers.">Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers.</a> Nature. 392, 300-303 (1998).</li><li>Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+instabilities+in+human+cancers.">Genetic instabilities in human cancers.</a> Nature. 396, 643-649 (1998).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-4892 (2010).</li><li>Schnerch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+APC/C+activity+in+the+presence+of+chromosomal+misalignment+in+unperturbed+cell+populations.">Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations.</a> Cell Cycle. 11, (2012).</li><li>Keppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).</li><li>Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).</li><li>Malureanu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+hypomorphic+mice+fail+to+counteract+de+novo+synthesis+of+cyclin+B1+in+mitosis.">Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis.</a> J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).</li><li>Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+spindle-assembly+checkpoint+response+requires+de+novo+transcription+and+translation+of+cyclin+B1.">Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1.</a> PLoS One. 5, (2010).</li><li>Wolthuis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc20+and+Cks+direct+the+spindle+checkpoint-independent+destruction+of+cyclin.">Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin.</a> A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo qui un live-cell approccio di imaging basata facilitare il monitoraggio simultaneo di proteolisi ciclina B e l&#39;allineamento dei cromosomi. Questo approccio permette lo studio del controllo mitotico negli imperturbabile popolazioni cellulari a livello di singola cellula. Curve di degradazione della ciclina B facilitare intellezioni dirette nell&#39;attività della APC / C e quindi indirettamente riflettere lo stato della SAC 6. Questo approccio, pur calcolato sul...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Reporter linea cellulare </td><td> generato in-house, come descritto 6 </td><td> clonare 11 celle giornalista (U2OS basati ciclina B-cellule che esprimono SNAP) </td><td></td></tr><tr><td> Retrovirale ciclina B-SNAP vettore di espressione </td><td> generato in-house, come descritto 6 </td><td> pLNCX2-ciclina B mut5-SNAP </td><td></td></tr><tr><td> Phenolred senza DMEM </td><td> Gibco </td><td> 21063-029 </td><td> La supplementazione con FCS, piruvato di sodio, penicillina / strepto-mycin richiesta </td></tr><tr><td> SNAP-Cell TMR-Star </td><td> New England Biolabs </td><td> S9105S </td><td> Soluzione madre 400 mM in DMSO </td></tr><tr><td> Speciale Opstics Piatto, 96 pozzetti </td><td> Costar </td&gt; <td> 3720 </td><td></td></tr><tr><td> μ-Slide 8 bene, ibiTreat </td><td> Ibidi </td><td> 80826 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopia unità </td><td> Olimpo </td><td> IX-81 Microscopio inverso con camera climatica </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo </td><td> Olimpo </td><td> UPLSAPO obiettivo 20x (NA 0,75 €) </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Acquisizione software (v.2.2.09) </td><td></td></tr><tr><td> Analisi del software </td><td> Olimpo </td><td> Scan ^ R Software di analisi (v.1.2.0.6) </td><td></td></tr></tbody></table>

studying proteolysis of cyclin b at the single cell level in whole cell populations

Distribuzione uniforme dei cromosomi tra le due cellule figlie durante la divisione cellulare è un prerequisito per garantire la stabilità genetica 1. Imprecisioni in fase di separazione dei cromosomi sono una caratteristica di malignità e associata a progressione della malattia 2-4. Il checkpoint del fuso (SAC) è un meccanismo di controllo mitotico che trattiene le cellule in metafase fino a quando ogni singolo cromosoma ha stabilito un legame stabile bipolare al fuso mitotico 1. La SAC esercita la sua funzione per interferenza con l&#39;attivazione di APC / C subunità Cdc20 di bloccare la proteolisi di securin e ciclina B e quindi la separazione dei cromosomi e uscire mitotico. Attacco improprio dei cromosomi impedisce di mettere a tacere SAC segnalamento e provoca l&#39;inibizione segue da APC / C Cdc20 fino a quando il problema è risolto per evitare missegregation cromosoma, aneuploidia e carcinomi 1. La maggior parte degli studi che hanno affrontato il influence improprio di attaccamento cromosomica su APC / C-dipendente proteolisi ha approfittato di interruzione del mandrino utilizzando depolimerizzante o microtubuli stabilizzazione farmaci di interferire con l&#39;attaccamento cromosomica ai microtubuli. Poiché interferenze con cinetiche microtubuli può influenzare il trasporto e la localizzazione dei regolatori critici, queste procedure sopportare un rischio di indurre effetti artificiali 5. Per studiare come la SAC interferisce con APC / C-dipendente della ciclina B proteolisi durante la mitosi in imperturbabile popolazioni cellulari, abbiamo stabilito un sistema di istoni H2-GFP-base che ha permesso il monitoraggio simultaneo di allineamento metafase dei cromosomi mitotici e proteolisi della ciclina B 6 . Per rappresentare profili proteolitici, abbiamo generato una molecola chimerica B ciclina reporter con una porzione C-terminale SNAP 6 (figura 1). In una reazione di auto-etichettatura, la SNAP-porzione è in grado di formare legami covalenti conalkylguanine-vettori (substrato SNAP) 7,8 (Figura 1). Molecole substrato SNAP sono facilmente disponibili e trasportare un ampio spettro di differenti fluorocromi. Chimerici ciclina B-SNAP molecole diventano etichettati dopo aggiunta della membrana permeabile substrato SNAP al mezzo di crescita 7 (Figura 1). Dopo la reazione di marcatura, l&#39;intensità ciclina B-SNAP fluorescenza gocce in un pulse-chase reazione modo simile e intensità di fluorescenza riflettere livelli di ciclina B degradazione 6 (figura 1). Il nostro sistema facilita il monitoraggio della mitotico APC / C-dipendente proteolisi in un gran numero di cellule (o più popolazioni di cellule) in parallelo. In tal modo, il sistema può essere un valido strumento per identificare agenti / piccole molecole che sono in grado di interferire con l&#39;attività proteolitica in metafase per anafase transizione. Inoltre, come sintesi di ciclina B durante la mitosi è stato recentemente proposto come un mechanis importantim nel promuovere un blocco mitotico nei topi e negli esseri umani, mantenendo stabili i livelli di espressione della ciclina B 9,10, questo sistema ci ha permesso di analizzare proteolisi B ciclina come uno degli elementi di una situazione di equilibrio 6.

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Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

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10.4K Views.  University Medical Center Freiburg. Metafase di anafase transizione viene attivato attraverso la promozione anafase-complesso (APC / C)-dipendente ubiquitinazione e la successiva distruzione della ciclina B. Qui, abbiamo creato un sistema che, a seguito di pulse-chase etichettatura, permette di monitorare ciclina proteolisi B in popolazioni di cellule intere e facilita la rilevazione di interferenza del checkpoint mitotico.

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Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Ricerca

Biologia

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

L&#39;ottenimento di RNA di alta qualità da popolazioni di cellule singole nei tessuti umani cervello postmortem

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Analisi di LINE-1 retrotrasposizione al Nucleo livello singolo

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.