Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni R01DE018138 dal National Institutes of Health (PX) e, in parte, dal Programma Virginia Commonwealth Research presidenziale Incentive University (PRIP) 144602-3 (PX). Ringraziamo Drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang per l&#39;assistenza con la costruzione di mutanti genoma di larghezza. Ringraziamo anche il Core Facility DNA della Virginia Commonwealth University per il sequenziamento del DNA.

1. Primer design <ol><li> Primer sono progettati utilizzando script in casa in base alla S. sanguinis SK36 genoma sequenza. Tre serie di primer, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 sono progettati per l&#39;amplificazione del-1 kb di sequenza a monte del gene target, l&#39;APHA-3 encoding gene per la resistenza alla kanamicina (Km r) e la proteina 3 1 -kb sequenza a valle del gene bersaglio, rispettivamente (Figura 1). Tra questi primer, F1 e R3 sono progettati utilizzando ePrimer3 nel EMBOSS insieme di programmi ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) per amplificare regioni fiancheggianti monte oa valle del target gene. Primer gene specifico, R1 e F3, sono progettati in base al 5 &#39;e 3&#39; sequenze del gene bersaglio. Primer R1 ed F3 contengono 25 coppie di basi sequenze adattatore alla fine il loro 5 &#39;che sono complementari al APHA-3gene. Le temperature di fusione di ciascun primer sono stati progettati per essere il più vicino possibile a 60 ° C per consentire l&#39;uso di una temperatura di ricottura uniforme per tutte le reazioni di PCR in formato a 96 pozzetti. </li><li> F1, R1, R3 F3 e primer sono sintetizzati in piastre a 96 pozzetti basato su un ordine gene. Ciascuna piastra contiene un tipo di primer nell&#39;ordine stesso gene. Diluire i primer in piastra a 96 pozzetti fondo lavorando ad una concentrazione finale di 10 pM per l&#39;amplificazione PCR usando una pipetta multicanale. </li></ol> 2. High-throughput amplificazione PCR e purificazione <ol><li> Per amplificare elevato throughput 1-kb a monte oa valle del bersaglio S. geni sanguinis, assemblare una miscela cocktail PCR in ghiaccio in 15 ml tubo conico contenente 1640 microlitri DDH 2 O, 250 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ml di miscela di mm 10 dNTP, 100 pl di 50 mM MgSO4, 100 pl di 10 ng / mL S. sanguinis SK36 DNA genomico e 10 microlitri Platinum Taq DNA polimerasirase alta fedeltà e trasferimento 23 microlitri della miscela in ciascun pozzetto di piastra a 96 pozzetti PCR usando una pipetta multicanale. Trasferire 1 ml di ciascuna F1 e R1 (o F3 e R3) da 10 pM di lavoro piastre di primer alla piastra PCR usando pipetta multicanale. Sigillare la piastra PCR ed eseguire amplificazione a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 54 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1,5 min. </li><li> Preparare 1% gel contenente bromuro di etidio con 48 carico multicanale raccordo pipetta pozzi. Miscelare 4 microlitri prodotto PCR con 1 ml di tampone di caricamento 5xDNA sulla piastra a 96 pozzetti e caricare i campioni su gel di agarosio utilizzando un 10-microlitri pipetta multicanale. Eseguire elettroforesi a 135 V per 30 minuti. Esaminare la banda su gel con documentazione UVP e sistema di analisi. </li><li> Purificare il prodotto PCR da 96 PureLink kit di purificazione PCR utilizzando centrifugazione secondo le istruzioni del produttore. Per eluizione del DNA, aggiungere 40 microlitri sterile DDH 2 O al pozzo del binding piastra. </li><li> Scegliere a caso diversi amplificati purificati sulla piastra di esaminare le concentrazioni di DNA mediante spettrofotometro NanoDrop. Regolare la concentrazione di ampliconi su piastra a ~ 10 ng / mL. </li><li> Un plasmide contenente cassette chilometri r viene digerito con EcoR I come template PCR. Il plasmide digerito viene purificato per QIAquick kit di purificazione PCR e il DNA plasmide lineare viene regolata alla concentrazione finale di 10 ng di DNA / pl. Montare 25 miscela microlitri per amplicone km cassetta r compresi 16,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 pM F2, 1 ml di 10 pM R2, 1 ml DNA plasmidico lineare e 0,1 microlitri fedeltà Platinum Taq DNA polimerasi alta. Effettuare amplificazione PCR a 94 ° C per 1 min, e 30 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 1 min. Esaminare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio all&#39;1%. Poola maggior parte della cassetta degli ampliconi km r da 10 individuali PCR purificato dal kit QIAquick purificazione PCR. Regolare la concentrazione amplicone a 10 ng / mL. </li><li> Per ottenere il lineare finale amplicone PCR ricombinante, tre ampliconi PCR vengono combinati tra microlitri 1 (in quantità circa pari-molare) in una piastra PCR così come templato PCR. Altri componenti della PCR è aggiunto anche 14,4 microlitri DDH 2 O, 2,5 microlitri 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ml di miscela di mm 10 dNTP, 1 ml di 50 mM Mg SO 4, 1 ml di 10 mM F1, 1 ml di 10 microM R3, 0,1 microlitri Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà. Amplificazione PCR viene eseguita a 94 ° C per 2 min, 30 cicli di 94 ° C per 30 sec a 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min. </li><li> Esaminare gli ampliconi della PCR su gel di agarosio. Purificare e quantificare gli ampliconi della PCR come descritto sopra. Congelare gli ampliconi della PCR ricombinati a -20 ° C. </li></ol> 3. Comcompetente Celle Preparazione <ol><li> Todd Hewitt Broth è preparato, pH regolato a 7,6 con NaOH 10 N, riscaldato a ebollizione e poi raffreddata a temperatura ambiente e sterilizzato usando polistirene 0,22 micron filtro 4. Aggiungere 300 microlitri inattivato al calore cavallo sieri (concentrazione finale di 2,5%) a 11,7 ml di brodo Todd Hewitt in 15 ml tubo conico per compensare TH + HS media. Aliquotare TH + HS medie in 2 ml e 10 ml in provette. </li><li> Inoculare 5 l di brodo S. sanguinis SK36 congelati a -80 ° C in 2 ml di terreno TH + HS e incubare la coltura durante la notte con capping ermeticamente a 37 ° C, accompagnata da pre-incubando il 10 ml-TH + tubo HS. </li><li> Dopo una notte, trasferire 50 microlitri cultura in 10 ml TH + HS e incubare la provetta a 37 ° C per 3 ore (corrispondente a OD 660 di 0,07-0,08), immediatamente utilizzando per la trasformazione. </li></ol> 4. Trasformazione cellulare e selezione antibiotica <ol><li> Aggiungere 2 ml di 70 ng S. sanguinis SK36 compeTence peptide stimolante (CSP) e 2 microlitri lineare amplicone PCR ricombinante (~ 50 ng) per provette Eppendorf a 96-well blocco e li pre-riscaldare a 37 ° C. Trasferire 330 ml di 3 ore-incubato SK36 cultura in ogni provetta. Incubare a 37 ° C per 1 ora. Sostituire il DNA con sterile DDH 2 O come controllo. </li><li> Posizionare il blocco di ghiaccio e la diffusione 100 pl di ogni trasformazione in Brain Heart Infusion (BHI) piastra di agar con 500 mg / ml di kanamicina. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 d in condizioni microaerobiche. </li></ol> 5. Conferma Mutant e stoccaggio <ol><li> Per ciascun mutante di sostituzione, casualmente prendere due singole colonie, inoculare la colonia in 5 ml BHI contenente 500 ug / ml di kanamicina e incubare l&#39;inoculo microaerobically notte a 37 ° C. Crioconservare ciascuna cultura in 30% glicerolo a -80 ° C </li><li> Per esaminare se il mutante contenente la sostituzione del gene previsto, eseguire colonia PCR per ciascun mutante con F1 e R3primer in piastra a 96 pozzetti PCR. Circa 1-microlitri dalla coltura durante la notte colonia individuale viene usato come stampo di DNA in 25 microlitri PCR-amplificazione reazione. PCR viene eseguita a 94 ° C per 5 min, 35 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 68 ° C per 3,5 min, ed infine 68 ° C per 4 min. </li><li> Per identificare con precisione a doppia banda mutanti o contaminante ampliconi PCR, esame della PCR mediante elettroforesi per 4 ore su&gt; 12 cm al 2% su gel di agarosio con colorazione con etidio bromuro. In questa condizione elettroforesi su gel di agarosio, le ampliconi con ≥ 100 bp differenza sono stati chiaramente identificati. Quando le bande risultanti dalla amplificazione della cassetta r chilometri e di tipo selvatico gene sono anticipati per differire di &lt;100 bp, viene utilizzato un primer T1 interna per determinare se un gene di tipo selvatico può essere rilevato mediante PCR. </li><li> Ad ulteriore conferma l&#39;eliminazione, gli ampliconi sono purificati da PureLink 96 kit di purificazione PCR e sequenziati utilizzando il primer P1 chesi lega alla cassetta r chilometri. Mantieni solo mutanti corrette confermate mediante sequenziamento. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Per ridurre al minimo i possibili effetti polari della sostituzione di un gene esogeno gene mirata con antibiotici sui geni vicini, due passi vengono presi mentre innesco iniziale di progettazione. Per la maggior parte dei geni eliminati, il primer R1 e F3 sono progettati per eliminare la regione codificante da 6 bp dopo il codone di inizio di 30 bp prima del codone di stop. Gli ultimi 30 paia di basi sono conservati per proteggere potenziale sito di legame ribosomiale utilizzato dal gene adiacente valle. La regione tra...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nomi</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogo #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti (opzionale)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer R2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P1</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer P2</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequenza: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA polimerasi</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA polimerasi ad alta fedeltà</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Con enzimi di restrizione</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytical americana</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarosio</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Cervello Infusion Cuore</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siero di cavallo</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Siero di cavallo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH brodo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Brodo Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 kit di purificazione PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR Purification Kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0,22 micron filtro polistirolo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiologia bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrifuga da banco</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall leggenda RT plus micropiastra rotore</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gel Documentazione</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubatore</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet di Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet di Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipette multicanale</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Termociclatore</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

genome-wide gene deletions in streptococcus sanguinis by high throughput pcr

Trasposone mutagenesi e singolo gene delezione sono due metodi applicati nel genoma knockout gene in 1,2 batteri. Sebbene mutagenesi trasposone è meno tempo, meno costosa, e non richiede informazioni genoma completata, vi sono due punti deboli in questo metodo: (1) la possibilità di un mutanti disparati nella libreria misto mutante che contro-seleziona mutanti con concorrenza diminuita; e (2) la possibilità di inattivazione genica parziale in cui i geni non interamente perdono la loro funzione dopo l&#39;inserimento di un trasposone. Singolo gene delezione analisi può compensare gli svantaggi associati con mutagenesi trasposone. Per migliorare l&#39;efficienza del genoma delezione singolo gene, si cerca di stabilire un high-throughput tecnica di genome-wide delezione del gene singolo utilizzando Streptococcus sanguinis come organismo modello. Ogni delezione del gene costruire in S. sanguinis genoma è progettata per comprendere 1-Kb a monte del gene target, l&#39;APHA-3 gene, che codifica per proteine ​​resistenza alla kanamicina, e 1-kb a valle del gene bersaglio. Tre serie di primer F1/R1, F2/R2 e F3/R3, rispettivamente, sono stati progettati e sintetizzati in un formato a 96 pozzetti per piastra PCR amplificazioni di questi tre componenti di ciascuna delezione costruire. Primer R1 e F3 contengono 25-bp sequenze che sono complementari alle regioni del gene-3 APHA a fine loro 5 &#39;. Una grande scala di amplificazione PCR del gene-3 APHA viene eseguita una volta per tutte la creazione di un singolo gene costrutti di delezione. Il promotore del gene APHA-3 è inizialmente escluso per minimizzare il potenziale effetto polare di cassette kanamicina. Per creare i costrutti genici delezione, alta produttività amplificazione PCR e purificazione sono eseguite in un formato a 96 pozzetti piastra. Un lineare amplicone PCR ricombinante per ogni gene delezione sarà composta da quattro reazioni PCR utilizzando alta fedeltà DNA polimerasi. Il expon inizialefase di crescita preferenziale di S. sanguinis coltivati ​​in brodo Todd Hewitt integrato con 2,5% siero di cavallo inattivato viene usato per aumentare la competenza per la trasformazione di PCR-costrutti ricombinanti. In questa condizione, fino al 20% di S. sanguinis cellule possono essere trasformate utilizzando ~ 50 ng di DNA. Sulla base di questo approccio, 2048 mutanti con singolo gene delezione sono stati infine ottenuti dai 2.270 geni in S. sanguinis esclusi quattro ORF del gene contenute interamente all&#39;interno ORF altri S. sanguinis SK36 e 218 potenziali geni essenziali. La tecnica sulla creazione di costrutti di delezione del gene è un throughput elevato e potrebbe essere facile da usare in tutto il genoma gene delezioni singole per i batteri trasformabili.

Dopo l&#39;amplificazione PCR utilizzando primer F1 e R1, R3 e F3 e, di circa 1 kb a monte ea valle di ciascuna S. sanguinis gene sono stati ottenuti in formato a 96 pozzetti, rispettivamente (Figura 2A). Sotto le condizioni di PCR utilizzando primer disegnati e, un prodotto specifico è stato amplificato da S. sanguinis DNA genomico in ciascuna reazione PCR. Questo risultato indicato i primer erano altamente specifico per gli obiettivi di S. sanguinis. Tramite PCR re-amplific...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Un efficiente genoma unico metodo di mutazione del gene è stata stabilita utilizzando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Come organismo modello. Questo metodo ha ottenuto tramite PCR ad alto throughput ricombinanti e trasformazioni.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

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Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

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