Questo protocollo fornisce un elevato throughput e un trucco affidabile per l'analisi NHEJ in grado di determinare la prevalenza e la quantità relativa di mutazioni Indel nelle popolazioni di zanzare geneticamente modificate. Rispetto alla generazione successiva, o sequenziamento Sanger, ddPCR ha tempi di risposta più rapidi per i risultati, che consente un'analisi rapida e completa della variazione genetica sul campo per gli organismi geneticamente modificati. Questo metodo dovrebbe essere generalmente applicabile a tutti i sistemi sperimentali.
A dimostrare la procedura sarà Thai Pham, un ricercatore associato del laboratorio di Yang. Per cominciare, preparare 25 microlitri della PCR a goccia digitale o del mix di campioni ddPCR aggiungendo ddPCR super mix, primer avanti e indietro, sonde HEX o FAM, DNA e acqua nelle proporzioni descritte nel testo. Quindi mescolare accuratamente la reazione vorticosamente.
Utilizzando una pipetta multicanale da 50 microlitri, caricare 20 microlitri della miscela di campioni ddPCR nella fila centrale della cartuccia. Quindi utilizzare una pipetta multicanale da 200 microlitri per caricare 70 microlitri dell'olio nella fila inferiore senza generare bolle in tutta la pipetta. Posizionare la guarnizione, toccando solo i bordi, evitando il centro, l'area concava, quindi posizionare saldamente la piastra nel generatore di gocce e chiudere il coperchio per avviare la corsa.
Per trasferire la miscela ad immersione dalla fila superiore della cartuccia alla piastra a 96 pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale e far cadere 40 microlitri di campione liquido per tre-cinque secondi con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi. Quindi espellere la miscela nel pozzo lentamente per oltre tre secondi con un angolo di 45 gradi, permettendogli di cadere di lato, quindi andare alla seconda fermata della pipetta per espellere completamente il liquido. Utilizzando i termosaldai in lamina, sigillare le piastre per cinque secondi a 180 gradi Celsius.
Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore e impostare le condizioni PCR per le linee guida di caduta NHEJ impostando la denaturazione iniziale a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, impostare 40 cicli di 94 gradi Celsius per 30 secondi per denaturare, 55 gradi Celsius da un minuto alla ricottura e 60 gradi Celsius per due minuti per estendere. Dopo 40 cicli, impostare la tenuta a 98 gradi Celsius per 10 minuti e la tenuta finale a quattro gradi Celsius.
Utilizzare una velocità di rampa di due gradi Celsius al secondo per tutti i passaggi. La temperatura di ricottura varierà, a seconda delle sonde o del primer utilizzato. Posizionare saldamente la piastra nel lettore di gocce con l'A1 etichettato bene in alto a sinistra.
Aprire il programma e impostare la piastra designando FAM come canale di riferimento noto e HEX come quello sconosciuto per ciascun pozzetto. Quindi, modificare il nome per ogni campione. Eseguire l'esperimento di lettura droplet come quantificazione diretta durante il salvataggio del modello.
Designare i parametri sperimentali corretti per l'analisi del software, ovvero informazioni sul campione, super mix, nome del target, tipo di target, canale del segnale uno e canale due. Quindi, impostare la soglia per il conteggio delle goccioline superiore a 10.000 per risultati affidabili. Quindi, controlla il conteggio delle gocce per ogni pozzetto nella scheda dei droplet, assicurandoti che tutti siano superiori a 10.000.
Infine, controlla l'ampiezza 1D per un'efficiente separazione del segnale dai negativi. Nell'editor di piastre, evidenziate l'intera piastra e impostate il tipo di esperimento in modo che venga eliminato. Impostare la destinazione WT come riferimento, designando il canale uno per FAM e il canale due per HEX.
Impostare la destinazione NHEJ come sconosciuta, designando il canale uno per FAM e il canale due come nessuno. Nella scheda Ampiezza 2D, impostare le soglie del cluster con gli strumenti grafico per ogni campione. La coda è normalmente associata al cluster WT per i saggi NHEJ.
Nella scheda rapporto, fai clic sull'icona a forma di ingranaggio in alto a destra del grafico e seleziona l'abbondanza frazionaria per tracciare un punto corrispondente alla percentuale di eventi NHEJ. 15 diversi campioni estratti di 10 zanzare contenevano ciascuno vari alleli NHEJ, sono stati analizzati e identificati utilizzando il test di caduta e i risultati hanno mostrato che tutti i 15 campioni trasportavano alleli Indel al 100%. In un altro esperimento, 11 campioni estratti di zanzare selvatiche e zanzare NHEJ con diverse percentuali di NHEJ sono stati esaminati con questo protocollo ddPCR.
I risultati hanno mostrato che la percentuale identificata era relativamente vicina al rilevamento Indel mediante la tecnica di analisi amplicon. Pipettare lentamente per evitare bolle e lasciare che tutte le goccioline emulsionate gocciolino lungo la parete dei pozzetti.
