Vorremmo ringraziare il Dott. Evan Newell e il Dr. Sean Bendall per il feedback. Vorremmo anche ringraziare DVS Sciences e il Dr. Sean Bendall per un campione delle Multi-lantanidi contenenti perline di polistirene. Siamo grati per il finanziamento dal NIH Grant 2 U19 AI057229.

Tutti i campioni di cellule per la CyTOF devono essere fissate e permeabilizzate. Questo consente una maggiore entrata del iridio contenente DNA intercalante, e impedisce anche lisi cellulare durante il lavaggio con acqua MilliQ e gradini risospensione immediatamente prima di iniettare nel citometro massa. 1. Start-up del citometro Messa <ol><li> Aprire il programma CyTOF software. Selezionare Impostazione dello strumento. Nella scheda Cage Card, andate nell&#39;angolo in basso a destra e fare clic su Riscaldatore &quot;ON&quot;. Accendere il riscaldatore almeno 15 minuti prima del tempo desiderato per dare il tempo sufficiente per il mantello della camera spray per raggiungere i 200 ° C. </li><li> Sostituire il bianco Norm-Ject siringa da 3 ml nella pompa siringa con una siringa piena d&#39;acqua fresca MilliQ. </li><li> Pulizia nebulizzatore. Backflush il nebulizzatore, utilizzando la siringa e il tubo per tirare 5% citranox 2-3 volte sia attraverso la porta più piccola introduzione liquido e più grande è la porta di introduzione di gas. Ripetere il risciacquo con acqua MilliQ to rimuovere citranox residuo. </li><li> Controllo per confermare che le luci sul pannello frontale del CyTOF sono accesi come in figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. Spie del pannello CyTOF prima della messa in servizio. <ol start="5"><li> Aprire la valvola del serbatoio di gas argon. Questo dovrebbe causare la luce &quot;ARGON&quot; sulla parte anteriore per accendere. </li><li> Collegare il nebulizzatore per il make-up di ingresso del gas. Svitare il make-up tubo connettore del gas e togliere la gomma nera o-ring e il bianco pezzo conico di plastica. Nota ampio &quot;nocche&quot; sul gambo porta di introduzione di gas del nebulizzatore. Posizionare il connettore sulla porta di introduzione di gas. Posizionare il nero o-ring sull&#39;estremità del porto gas e forzare l&#39;o-ring oltre la parte più larga dello stelo porta. Posizionare il pezzo bianco conico in plastica sulla parte superiore con l&#39;estremità più stretta ha sottolineato, e avvitarla al make-up tubo del gas. </li><li&gt; Collegare il nebulizzatore al tubo introduzione liquido. Inserire con cautela la tubazione piccola nell&#39;apertura all&#39;estremità del nebulizzatore. Ci saranno due fermate, simili nel sentire alle fermate su una micropipetta. Prima premere fino ad incontrare resistenza luce, la fine del tubo piccolo dovrebbe essere alla fine del tratto rettilineo del vetro. Secondo, premere di più per forzare la fine del tratto rettilineo del vetro ulteriormente nel raccordo e serrare la vite di fissaggio per sigillare. Inserire l&#39;estremità del nebulizzatore nell&#39;apertura bianco nel mantello riscaldante. </li><li> Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, premere il tasto &quot;Avvio Plasma&quot;. Dal momento che il nebulizzatore è già inserito, premere il tasto &quot;OK&quot;. Il software si accende il refrigeratore, avviare il flusso di gas, e accendere un plasma. Il rilevatore di tensione salirà. Ci sarà una finestra pop-up che dice &quot;plasma sequenza di avvio è stato completato correttamente&quot; quando hai finito, premere il tasto &quot;OK&quot;. Nuove luci dovrebbe essere nel pannello frontale (figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. Spie del pannello CyTOF dopo plasma acceso e start-up completato con successo. <ol start="9"><li> Accensione pompa a siringa. Nell&#39;angolo in alto a destra, premere il pulsante verde &quot;play&quot; per avviare la pompa a siringa e iniziare a liquido che scorre attraverso il tubo e schizzi fuori del nebulizzatore. Le impostazioni di default per siringhe sono 3 ml di acqua. Affinché campione da fluisce attraverso il loop del campione, la pompa a siringa deve essere periodicamente cambiato quando si esaurisce di acqua. Nella parte superiore dello schermo, vi è un contatore che indica quanto liquido è fluito dalla pompa a siringa. La pompa a siringa si arresta quando il contatore raggiunge &quot;3,000&quot; o lo stantuffo raggiunge la fine della siringa. Quando si riempie la siringa, è necessario premere &quot;stop&quot;, piuttosto che il pulsante blu &quot;pausa&quot; per azzerare il contatore. </li></ol>e &quot;&gt; 2. Taratura giornaliera della Messa citometro <ol><li> Il citometro massa avrà bisogno di circa 20 minuti per ottenere un caldo, plasma stabile prima della calibrazione. Lo scopo dei passi di sintonia è quello di massimizzare il segnale desiderato di Tm169 o Tb159 mantenendo &quot;Gd155&quot; (ossido; La139 + O16) segnale sotto il 3% del valore più elevato. Fare clic sul pulsante di acquisizione Impostazioni per aprire la finestra Impostazioni di acquisizione dati. Nella scheda analiti, fare clic sulla tabella periodica per aprire il pannello di selezione isotopo. Selezionare gli isotopi in sintonia soluzione DVS Sciences indicato nel manuale, quindi fare clic su &quot;salva&quot;. </li><li> Fare clic sul Isotopi Per Lettura pulsante per aprire la Massa () Per la finestra di lettura. Selezionare &quot;Impulsi Conte&quot;, e ridimensionare l&#39;asse y inserendo un nuovo numero e premendo il tasto &quot;enter&quot;. </li><li> Riempire una verde 1 ml Norm-Ject siringa con la soluzione messa a punto. Ruotare il selettore di porta di campionamento per &quot;caricare&quot;, iniettare 450 ml di soluzione messa a punto, quindi ruotare il selettore su &quot;iniettare&quot;. Nella scheda massa di calibrazione del Acquisit dati<html> ione finestra delle impostazioni, premere il tasto &quot;Esegui&quot; per monitorare quali sono le masse che scorre. Il lato sinistro della finestra è minore massa, mentre il lato destro è maggiore massa. Nota: ci sarà già segnali nella regione 9400-9800 TOF, a causa di isotopi xenon nel gas argon (Figura 3). Attendere fino a quando la soluzione messa a punto isotopi iniziano ad apparire come strisce in questa schermata (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Messa scheda della finestra di calibrazione, mostrando livelli di fondo per vari isotopi dopo la soluzione di lavaggio e risciacquo con acqua. La regione intorno a TOF 9400-9800 corrisponde allo xeno isotopi del gas argon, e deve essere sempre presente. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 4 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4. Calibrazione finestra scheda di massa, mostrando strisce verticali per i vari isotopi in soluzione messa a punto DVS. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <ol start="4"><li> Torna alle Massa () Per la lettura finestra e premere il tasto verde &quot;Play&quot; in alto a sinistra. Ogni isotopo selezionata al passo 2.1 è rappresentata da una linea di colore diverso. Il valore predefinito asse X è &quot;Time&quot;, in sec. Monitorare i livelli dei diversi isotopi fino a quando non sono stabili. </li><li> Regolazione della corrente. Nella scheda Parametri della Acquisizione Dati finestra Impostazioni, selezionare &quot;Current&quot; dal menu a discesa. Sia start = 0, finitura = 10, valore step = 0.5, tempo di assestamento = 200, e premere il tasto &quot;Salva&quot;. Fare clic su Indietro Messa (i) Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L&#39;asse x è ora &quot;corrente&quot;. Nota in cui i segnali del picco isotopi (Figura 5), e r<html> ecord. Nella scheda DAC Setup Canali della finestra di configurazione dello strumento, scorrere verso il basso su &quot;Current&quot; e digitare il nuovo valore. Premere il tasto &quot;Imposta valore reale attuale&quot;, poi &quot;salva&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Profilo di sintonizzazione corrente. <ol start="6"><li> Regolazione del gas di reintegro. Cambia menu a discesa di &quot;Make-up di gas.&quot; Sia start = 0.55, fine = 0,95, valore step = 0.05, tempo di assestamento = 200. Premere salvare. Tornare alla Massa () Per la finestra di lettura e avviare la riproduzione. L&#39;asse x è ora &quot;Make-up gas&quot; portata. Registrare in cui i segnali del picco isotopi. Osservare il rapido aumento del segnale &quot;Gd155&quot; verso la fine (Figura 6). Tornare alla configurazione DAC Canali scheda, scorrere fino a &quot;Make-up gas&quot;, e immettere il nuovo valore. Premere il tasto &quot;Imposta valore reale attuale&quot;, poi &quot;salva&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Make-up profilo regolazione gas. <ol start="7"><li> Registrazione del rapporto desiderato isotopo ossido vs. Fare una seconda iniezione di 450 ml di soluzione di messa a punto. Nella scheda Parametri, selezionare &quot;Time&quot; dal menu a discesa, per non start = 0, end = 10, valore step = 1, tempo di assestamento = 200. Premere il tasto &quot;salva&quot;. Clicca su &quot;play&quot; a Massa () Per la lettura finestra. Dopo le linee di stabilizzazione (figura 7), usare il cursore per leggere il valore nelle caselle in alto a sinistra per Tm169 o Tb159 (valore maggiore) e anche il valore &quot;Gd155&quot; (&lt;3% del valore più elevato). Questi valori possono anche essere salvati in un file di messa a punto per riferimento futuro. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Misura di intensità di soluzione di ottimizzazione del segnale dopo l&#39;ottimizzazione del gas corrente e Make-up. <ol start="8"><li> Pulizia di samloop di PLE. Iniettare 3 ml di acqua MilliQ attraverso il loop del campione, seguita da 500 microlitri di soluzione di lavaggio DVS. Monitorare lo stato di avanzamento della pulizia premendo il tasto &quot;run&quot; nella scheda Calibrazione Messa. Lavare fino l&#39;intensità delle striature (Figura 4) inizia a diminuire, quindi seguire da 3 ml di acqua MilliQ e monitor fino a livelli di sfondo (Figura 3). </li></ol> 3. Esempi di lavoro <ol><li> Aprire la finestra di acquisizione. Impostazioni predefinite: fare analisi = On-The-Fly, segnale per l&#39;analisi = Doppio, calibrazione del doppio conteggio dei dati =. Riduzione del rumore è stato selezionato. Qualsiasi di questi può essere cambiato se desiderato. Immettere il nome del file. Tutti i file devono essere salvati nella :/ E / unità. </li><li> Impostazione dei ritardi di acquisizione. Ci sarà un leggero ritardo nella registrazione eventi cellulari di circa 30 secondi a causa della lunghezza del tubo tra il loop campione e il nebulizzatore. Pertanto, la somma totale di &quot;ritardo Acquisition&quot; e &quot;Detector stritardo capacità &quot;deve essere di almeno 30 secondi. stabilità ritardo rilevatore deve essere di almeno 20 secondi. </li><li> Impostazione tempo di raccolta dei dati. &quot;Il tempo di acquisizione&quot; è il numero di secondi che si desidera eseguire il vostro campione. Riempire l&#39;intero ciclo di 450 microlitri del campione richiede 600 secondi per il completamento. Si suggerisce che 50-100 sec essere aggiunto alla fine del tempo di funzionamento per minimizzare campione riporto. </li><li> Risospensione del campione. Per ridurre al minimo l&#39;accumulo di sali in macchina, si suggerisce che almeno due lavaggi in acqua MilliQ essere fatto al termine della colorazione cellulare, seguita da una risospensione finale in acqua MilliQ. Il volume di acqua MilliQ usato per risospendere il pellet cellulare varia a seconda del numero di celle e iniziato con il recupero delle cellule dopo la procedura di colorazione intera. Un buon punto di partenza è 10 6 (partenza) cellule / ml. Dopo la risospensione, filtrare attraverso un colino per eliminare cella aggregati. </li><li> Campione di partenza correre. Immettere un nuovo nome di file per il campione corrente.<html> Spegnere la valvola loop del campione per &quot;caricare&quot;, iniettare il campione, tornare a &quot;iniettare&quot;, poi clicca su &quot;Esegui&quot; nella finestra di acquisizione. </li><li> Registrazione di eventi cellulari. Le cellule saranno rappresentati nella finestra istantanea come le collezioni di marchi orizzontali in ogni verticale isotopo / marcatore canale (Figura 8). Mentre il citometro massa può registrare 1000 cellule / sec, una migliore risoluzione tra gli eventi cellulari di solito si ottiene a 300-500 cellule / sec. Ciò corrisponde ad una media di ~ 1 cellula / aggiornamento dello schermo. Si può richiedere fino a 30 secondi prima che il contatore di eventi cellula inizia a salire. Ciò è dovuto al &quot;On-the-fly&quot; trattamento dei dati, senza le informazioni sugli eventi della cella viene persa. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Finestra Acquisizione durante esempio eseguibile, mostrando righe orizzontali di punti corrispondenti agli elementi associati tre eventi cellulari distinti.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <ol start="7"><li> Qualità degli eventi cellulari. Nota uno sfondo striature in ciascun canale isotopo, così come il tasso di eventi cella. Il citometro massa riconosce un &quot;evento cella&quot; come un certo aumento del segnale di sopra del fondo, così il segnale di fondo in metallo libera o non legata anticorpi possono alterare l &#39;&quot;evento cella&quot; count. Inoltre, l&#39;esecuzione cellule ad una concentrazione troppo elevata può causare un aumento del numero di eventi doppietto. Sfondo può essere diminuito da lavaggi supplementari o diluizione della cella. Doppietti può essere minimizzata diluizione cellulare maggiore, a costo di tempo di esecuzione maggiore. </li><li> Finitura di acquisizione dati. Quando il tempo di acquisizione è stato raggiunto, la raccolta dei dati finirà. Ci sarà un po &#39;di ritardo prima di una finestra pop-up con un &quot;OK&quot; appare, ancora una volta, ciò è dovuto a &quot;On-the-Fly&quot;, l&#39;elaborazione dei dati. Acquisizione del campione può anche essere fermato Prematurely premendo il pulsante &quot;Stop&quot;. In questo caso, tutti gli eventi cellulari già registrati saranno contati e trasformati in file di output. </li><li> Iniezione di almeno 500 ml di acqua MilliQ tra ciascun campione minimizza il carryover campione. </li></ol> 4. Pulizia della macchina dopo l&#39;uso <ol><li> Soluzione di lavaggio. Dopo che il campione finale è gestito e il loop del campione lavato con acqua, iniettare 450 ml di soluzione di lavaggio nel loop del campione. Monitorare il rilascio di metallo libero nella scheda massa di calibrazione della finestra di acquisizione dei dati delle impostazioni come indicato al punto 2.8 (Figura 9). Quando il segnale di metallo libero comincia a diminuire, lavare con 3 ml di acqua MilliQ e monitorare fino livelli di fondo sono raggiunti. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Messa scheda della finestra di calibrazione, durante la post-ciclo di pulizia con la soluzione di lavaggio DVS. Le strisce verticali in regione TOF 9800-11000 sono anticorpi del marchio di isotopi viene rimossa dalla macchina. Le strisce verticali intorno TOF 11500 corrispondono ai due isotopi intercalatore Ir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . 5. Spegnimento della macchina <ol><li> Nella scheda controller RFG della finestra di configurazione dello strumento, selezionare &quot;Stop Plasma&quot;. Quando la procedura è completa, ci sarà una finestra pop-up che chiede di rimuovere il nebulizzatore. Premere il tasto &quot;OK&quot;. Nella scheda Cage Card, spegnere il riscaldatore. Chiudere la valvola sulla fornitura di argon. </li><li> Rimozione del nebulizzatore. Rimuovere il nebulizzatore dalla camera di spruzzo con attenzione tirando indietro. Svitare il tubo di introduzione del campione da 1,6 Step e mettere da parte. Svitare il make-up di introduzione di gas per allentare un po &#39;, quindi tirare fuori il nebulizzatore. Lasciando il raccordo avvitato insieme ridurrà le possibilità di losing il nero in gomma o-ring e nero pezzo conico di plastica. </li><li> Pulizia nebulizzatore. Backflush entrambe le porte del nebulizzatore con il 5% citranox utilizzando la siringa e il tubo come indicato al punto 1.3. Store, coperto, nel 5% citranox fino all&#39;utilizzo successivo. </li></ol>

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	<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li><li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays.">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li><li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain.">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination.">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li><li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8++T+cell+phenotypes.">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li></ol>

Gli autori lavorano entrambi presso il Centro di monitoraggio immunitario umano, un centro di assistenza presso la Stanford University che impone diritti degli utenti esclusivamente per coprire i costi di saggi, tra cui citometria di massa.

Per questi ultimi decenni, la citometria a flusso di fluorescenza è stato un metodo cavallo di lavoro per analizzare cellule singole, sia in termini di espressione di superficie e in saggi funzionali. Tuttavia, i problemi di sovrapposizione spettrale dei coloranti fluorescenti ha limitato il numero di marcatori simultanei. Mentre gli esperimenti che utilizzano più di 12 marcatori simultanei sono stati riportati, l&#39;importo della compensazione necessaria rende tecnicamente difficile. Inv...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa citometro </td><td> DVS Sciences </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di lavaggio </td><td> DVS Sciences </td><td> 201071 </td><td> 0,05% di acido fluoridrico in acqua </td></tr><tr><td> Sintonizzazione soluzione </td><td> DVS Sciences </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, acido nitrico traccia </td></tr><tr><td> Eu contenenti perline di polistirene </td><td> DVS Sciences </td><td> 201073 </td><td> Contiene naturale abbondanza isotopi Eu; perline in dotazione a circa 1 milioni / mL </td></tr><tr><td> Multi-contenenti lantanidi (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - polistirolo perle </td><td> DVS Sciences </td><td> Non ancora disponibile in commercio </td><td> Contiene naturale abbondanza isotopi di lantanidi quotate </td></tr><tr><td> Acido nitrico (concentrato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima traccia-metallo puro ICP-MS di qualità </td></tr><tr><td> Polistirene fondo rotondo tubo con cellule-filtro cap-5 ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> utilizzato per filtrare campioni di cellule prima dell&#39;iniezione </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin siringa 1 ml </td><td> Henke Sass Lupo </td><td> 4010-200V0 </td><td> senza silicone, latex-free </td></tr><tr><td> Norm-Ject siringa 3 ml </td><td> Henke Sass Lupo </td><td> 4010.000V0 </td><td> senza silicone, latex-free </td></tr><tr><td> MilliQ acqua </td><td></td><td></td><td> 18 MW di acqua pura, non deve essere conservato in bottiglie di vetro o di plastica che sono stati lavati con detersivo commerciale (a causa della loro elevati livelli di bario presenti). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> detergente acido </td></tr><tr><td> Gas argon </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999% Ultra-alta purezza </td></tr></tbody></table>

mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a cytof mass cytometer

Negli ultimi anni, l&#39;analisi rapida di singole cellule è comunemente eseguita utilizzando citometria di flusso e anticorpi marcati in fluorescenza. Tuttavia, la questione della sovrapposizione spettrale delle emissioni di fluorofori ha limitato il numero di sonde simultanee. In contrasto, la nuova massa citometro CyTOF da DVS coppie Scienze un liquido a cella singola introduzione di un sistema ICP-MS. 1 Invece di fluorofori, polimeri chelanti contenenti isotopi metallici altamente arricchito sono accoppiati ad anticorpi o altre sonde specifiche. 2-5 A causa della purezza del metallo e la risoluzione di massa del citometro massa, non vi è alcuna &quot;sovrapposizione spettrale&quot; di isotopi vicini, e quindi senza necessità di matrici di compensazione. Inoltre, grazie all&#39;utilizzo di metalli lantanidi, non c&#39;è sfondo biologico e quindi non equivalente di autofluorescenza. Con una finestra massa estende massa atomica 103-203, teoricamente fino a 100 etichette possono essere distinti contemporaneamente. Attualmente, Più di 35 canali sono disponibili utilizzando i reagenti chelante disponibile da DVS Sciences, che consente la dissezione senza precedenti del profilo immunologico dei campioni. 6-7 Svantaggi citometria massa includono il requisito rigido per un isotopo metallico separato per sonda (non equivalente di dispersione in avanti o laterale), e il fatto che si tratta di una tecnica distruttiva (senza possibilità di recupero cernita). L&#39;attuale configurazione del citometro massa ha anche una velocità di trasmissione di cella solo ~ 25%, richiedendo così un numero di ingresso maggiore di cellule. Ottima performance giornaliera del citometro massa richiede diversi passaggi. L&#39;obiettivo fondamentale della ottimizzazione è quello di massimizzare l&#39;intensità di segnale misurata degli isotopi metallici desiderati (M), riducendo al minimo la formazione di ossidi (M 16) che diminuisce l&#39;intensità del segnale e M interferire con qualsiasi segnale desiderato a M 16. Il primo passo è di riscaldare la macchina in un caldo, stabile ICP plasma è stato stabilito. In secondo luogo, le impostazioni per la frequenza del gas corrente e il make-up di flusso deve essere ottimizzata su base giornaliera. Durante il prelievo, il massimo tasso di eventi cella è limitato dal rilevatore efficienza e velocità di elaborazione a 1000 cellule / secondo. Tuttavia, a seconda della qualità di esempio, un più lento tasso di eventi cella (300-500 cellule / secondo) è generalmente auspicabile consentire una migliore risoluzione tra eventi cellule e quindi massimizzare singlets intatte nel doppietti e detriti. Infine, adeguata pulizia della macchina alla fine della giornata aiuta a minimizzare il segnale di fondo per metallo libero.

Dopo il protocollo di cui sopra dovrebbe realizzare quattro cose. In primo luogo, consentendo un adeguato tempo di riscaldamento per il citometro massa produrrà un caldo, plasma stabile necessario per il segnale ottimale e minima formazione di ossido. Secondo, lavaggio adeguato del citometro massa con acqua e soluzione di lavaggio MilliQ DVS (Figura 9) contribuirà a ridurre i livelli di metallo assorbimento nella tubazione e altre parti della macchina, contribuendo a ridurre fondo durante l&#39;acquis...

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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi

Massa Citometria: Protocollo per l&#39;ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.7K Views.  Stanford University. I passi necessari per la sintonizzazione quotidiana e ottimizzazione delle prestazioni di un citometro massa CyTOF sono descritti. Commenti sulla preparazione del campione ottimale e portata sono discussi

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Estrazione dei lipidi cellulari per analisi mirate Stabile diluizione isotopica cromatografia liquida-spettrometria di massa

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

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Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Ampio campo di microscopia a fluorescenza e citometria di flusso Imaging fluorescente su un telefono cellulare

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Campione strategie di preparazione per la Spettrometria di Massa Imaging di 3D Models Cultura cellulare

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

A Protocol for Bioinspired Design: A Ground Sampler Based on Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, known as the Aristotle's lantern, is a compelling source of bioinspiration with an intricate network of musculature and calcareous teeth that can scrape, cut, chew food and bore holes into rocky substrates. We describe the bioinspiration process as including animal observation, specimen characterization, device fabrication and mechanism bioexploration. The last step of bioexploration allows for a deeper understanding of the initial biology. The design architecture of the Aristotle's lantern is analyzed with micro-computed tomography and individual teeth are examined with scanning electron microscopy to identify the microstructure. Bioinspired designs are fabricated with a 3D printer, assembled and tested to determine the most efficient lantern opening and closing mechanism. Teeth from the bioinspired lantern design are bioexplored via finite element analysis to explain from a mechanical perspective why keeled tooth structures evolved in the modern sea urchins we observed. This circular approach allows for new conclusions to be drawn from biology and nature.

A protocol for bioinspired design is described for a sampling device based on the jaws of a sea urchin. The bioinspiration process includes observing the sea urchins, characterizing the mouthpiece, 3D printing of the teeth and their assembly, and bioexploring the tooth structure.

Un protocollo per bioispirati Design: A terra Sampler Sulla base di Sea Urchin Jaws

Bioinspired design is an emerging field that takes inspiration from nature to develop high-performance materials and devices. The sea urchin mouthpiece, ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Tutto il corpo Imaging Mass Spectrometry da Infrared Matrix-Assisted Laser desorbimento per ionizzazione elettrospray (IR-Maldesi)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Un protocollo per il knockout dei geni multipli nei piccoli organoidi intestinali del mouse usando un concatemer CRISPR

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

Quantificazione simultanea di kynurenine selezionate analizzate dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa in mezzo raccolto da colture cellulari tumorali

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Methods Article

Massa Citometria: Protocollo per l'ottimizzazione giornaliera e campioni di cellule in esecuzione su un citometro Messa CyTOF