Gli animali transgenici sono fondamentali per la moderna ricerca biomedica in quanto consentono studi sulla funzione genica negli organismi viventi. Vari metodi di modificazione genetica sono stati applicati negli studi sugli animali. Qui presentiamo una tecnica ampiamente accessibile ed efficace che utilizza vettori lentivirali come strumento per l'incorporazione transgena nel genoma di un embrione di ratto.
Dopo la somministrazione di gonadotropina corionica umana, accoppia ratti femminili Wistar di cinque settimane uno a uno con maschi Wistar sessualmente fertili di tre-10 mesi. Alle otto e alle 10.m del mattino successivo, controllare le femmine per la presenza di una spina vaginale e raccogliere gli ovidotti dalle femmine con un tappo di accoppiamento entro e non oltre le 10 a.m.
in un piatto da collezione contenente mezzo M2 prerifapidito. Una volta raccolti tutti gli ovidotti, trasferire i tessuti in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo M2 preri riscaldato integrato con 0,5 milligrammi per millilitro di ialuronidasi dai teste bovini e posizionare il piatto al microscopio stereo. Utilizzare forcep fini per aprire le pareti dell'ovidotto e premere l'ampolla fino a quando gli embrioni non vengono liberati.
Per facilitare il rilascio degli embrioni dalle cellule cumuli, utilizzare una pipetta di trasferimento del vetro collegata a un tubo aspiratore azionato dalla bocca per pipettare delicatamente gli embrioni su e giù. Quando tutti gli embrioni sono stati rilasciati, lavare le cellule alcune volte in mezzo M2 fresco per rimuovere l'ialuronidasi e i detriti cellulari. Trasferire gli embrioni in singole gocce di 50 microlitri di mezzo M16 pre-equilibrato coperto da olio minerale in un piatto da 60 millimetri.
Quindi posizionare il piatto in un'incubatrice umidificata di 37 gradi Celsius con un'atmosfera di anidride carbonica del 5% fino alla loro iniezione. Per la microiniezione vettoriale lentivirale sotto la zona pellucida degli embrioni a uno stadio cellulare, utilizzare un estrattore di pipetta per preparare capillari di vetro borosilicato di microiniezione con un filamento. Dopo ogni volta che il filamento viene cambiato o viene utilizzato un nuovo capillare di vetro, eseguire un test rampa per impostare i parametri ottimali.
Successivamente, utilizzare una punta del microloader per caricare circa due microlitri di soluzione lentivirale appena scongelata per pipetta di microiniezione sotto una cappa di flusso laminare di biosicurezza. Aggiungere una goccia di 100 microlitri di mezzo M2 al centro del coperchio da una piastra di Petri da 60 millimetri. Coprire il mezzo con olio minerale e montare la pipetta di tenuta e il capillare di microiniezione caricato dal virus su un micromanipolatore.
Posizionare il piatto di microiniezione al microscopio invertito e trasferire da 15 a 20 embrioni a una cellula nella goccia M2 nel piatto di microiniezione. Catturare un embrione con la pipetta di tenuta e utilizzare l'ingrandimento 400 volte superiore e il capillare di vetro per iniettare la soluzione lentivirale sotto la zona pellucida nello spazio perivitellino tenendo il capillare sotto la zona pellucida per un momento dopo la consegna del virus. Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati, utilizzare una pipetta fine per restituire le cellule iniettate al piatto di coltura e riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare fino al loro impianto.
Per preparare le madri adottiva per il trasferimento dell'embrione, accoppiare femmine Sprague-Dawley sessualmente mature con maschi vasectomizzati e controllare le femmine la mattina successiva per una spina vaginale. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al riflesso del pedale nelle femmine anestetizzate con una spina praticabile, applicare un unguento agli occhi dell'animale e radere la pelliccia dal retro di ogni animale. Posizionare il primo ratto in posizione prona su una superficie pulita su una pastiglia riscaldante al microscopio chirurgico.
Coprire il topo con un drappo sterile con un piccolo foro tagliato sopra la parte bassa della schiena e fare un'incisione cutanea di circa due centimetri parallela alla colonna vertebrale lombare. Usa forbici affilate per tagliare la parete addominale e usa le forcep per afferrare un cuscinetto di grasso ovarico. Estrarre l'ovaio e l'ovidotto dalla cavità addominale su un pezzo di garza imbevuta di cloruro di sodio allo 0,9%.
Caricare il mezzo M2, tre bolle d'aria e gli embrioni in un capillare di trasferimento. Utilizzare i microscissori per fare una piccola incisione nell'ovidotto tra l'infundibulo e l'ampulla e inserire la punta della pipetta di trasferimento nell'incisione. Espellere delicatamente gli embrioni e le bolle d'aria nell'ovidotto, quindi utilizzare forcep smussate per riposizionare il tratto riproduttivo nella cavità addominale.
Suturare la parete addominale con suture assorbibili di acido poliglicolico e chiudere l'incisione cutanea con clip per ferite e posizionare l'animale in una gabbia pulita su una piastra riscaldante con monitoraggio fino alla piena recumbency. Per vasectomizzare i potenziali compagni, dopo aver preparato il ratto maschio per l'intervento chirurgico come dimostrato, utilizzare il 70% di etanolo e uno scrub chirurgico per disinfettare la pelle sui teste. Premere delicatamente l'addome per esporre i teste nel sacco scrotale e coprire il topo con un drappo sterile con un piccolo foro sul sito chirurgico e utilizzare forbici scrotali per fare un'incisione di 0,5 centimetri nel mezzo del sacco.
Spingere con cura il testicolo a sinistra e individuare i deferenti vas tra il testicolo e la linea mediana come un condotto bianco con un singolo vaso sanguigno. Utilizzare le forcep dell'orologiaio per estrarre delicatamente i deferenti vas dal sacco scrotale e tenere il vaso con le forcep, utilizzare forbici fini per rimuovere un frammento di un centimetro dal condotto. Ripetere la procedura per il secondo testicolo come appena dimostrato e chiudere la pelle con suture assorbibili di acido poliglicolico.
Quindi posizionare il topo in una gabbia pulita su una piastra riscaldante con monitoraggio fino alla piena rimostranza. In questo esperimento rappresentativo in cui singoli embrioni sono stati iniettati più volte, otto ratti sono nati da embrioni che sono stati iniettati due volte, tre dei quali sono stati confermati per trasportare il transgene. Uno dei fondatori non ha trasferito il transgene alla prole e tre femmine adottiva sono state utilizzate per ogni configurazione sperimentale.
L'approccio scelto ha permesso la generazione di linee di ratto transgeniche stabili che esprimevano la proteina di fusione TDP-43-eGFP sotto il controllo della sinapsi neuronale in un promotore in tutto il sistema nervoso centrale. La transgenesi a base di lentivirus ha portato ad un inserimento di una singola copia del transgene come dimostrato dalla PCR quantitativa. Quando questo metodo è stato utilizzato per altri vettori lentivirali, è stato osservato un tasso di sopravvivenza di circa il 90%.
La percentuale di embrioni sopravvissuti alle iniezioni pronucleari era significativamente inferiore. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che i ratti femmine in gravidanza possono essere utilizzati come madri adottive con un'efficienza comparabile. In particolare, i dati numerici analizzati per singoli cicli di microiniezione indicavano che l'efficacia dell'impianto dipendeva direttamente dal numero di iniezioni in un embrione e indirettamente dalla carica virale.
L'utilizzo di vettori lentivirali garantisce l'integrazione genomica e la trasmissione del transgene e facilita un elevato tasso di sopravvivenza degli embrioni micromanipulati anche quando vengono eseguite iniezioni subdermiche multiple. Questa procedura può essere effettivamente applicata ad altre specie e può essere considerata un'alternativa per la transgenesi convenzionale.
