Ringraziamo Lee Tuddenham (IBMC, Strasburgo) per amplificare e titolazione MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Strasburgo) per il permesso di utilizzare la struttura animale dell&#39;Istituto di Virologia. Il sostegno finanziario da INSERM, Université de Strasbourg e Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) è riconosciuto. La partecipazione iniziale di Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante la loro progetto Master è inoltre riconosciuto.

1. Preparazione della sospensione virale <ol><li> Ottenere il ceppo Smith di MCMV esprimere luciferasi (MCMV-Luc 15) dal laboratorio di Ulrich Koszninowski. In questo ricombinante, il gene della luciferasi è inserito nel locus IE2 del genoma MCMV. </li><li> Per amplificare MCMV-Luc, infettare un midollo linea di cellule stromali osseo murino (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) con MCMV a diversa molteplicità di infezione (MOI, 0,001-1) 16. Per questo, aggiungere virus di cellule coltivate in mezzo privo di siero a 37 ° C. Dopo un&#39;ora, rimuovere il supernatante e sostituirlo con DMEM supplementato con 10% siero fetale di vitello (FCS). Cinque giorni dopo, raccogliere il terreno di coltura e di conservare delle aliquote a -80 ° C fino a nuovo uso. </li><li> Titolazione della sospensione virale mediante test placca. <ol><li> Dividere 3T3 (ATCC # CRL-1658) in una piastra a 24 a 40.000 cellule / pozzetto in 1 ml di DMEM supplementato con 10% FCS contenente penicillina (200 UI / ml) e steptomycin (200 mg / ml) E incubare 24 ore a 37 ° C. </li><li> Preparare diluizioni seriali (10 -1 a 10 -8) di una aliquota di MCMV sospensione in DMEM e infettare cellule bersaglio (3T3) con 200 ml di diluizione dopo rimuovere coltura cellulare. Incubare per 1 ora a 37 ° C. Aggiungere 1 ml di Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (v / v) gentamicina, 200 IU / ml di penicillina, 200 mg / ml streptomicina, 8 g / L Carbossimetilcellulosa) e incubare 5 giorni a 37 ° C. </li><li> Fissare le cellule aggiungendo 200 microlitri 10% di formaldeide (diluizione della formaldeide con acqua dovrebbe essere fatto in una cappa chimica per evitare inalazioni tossiche) in ciascun pozzetto e incubando 6 ore a temperatura ambiente. Togliere terreno di coltura + fissatore pipettando fuori e aggiungere 200 kit di colorazione delle cellule microlitri (1% di cristallo viola (w / v) in etanolo al 20%). Prima dell&#39;uso, diluire 1 parte con 9 parti di acqua Milli-Q. Incubare 2 minuti a temperatura ambiente, lavare la piastra 3-4x immergendola in acqua, lasciate asciugare e contare il numero di placche con un binocolo. </li></ol></li> &lt;li&gt; Diluire MCMV-Luc in DMEM per ottenere 50 PFUs in 50 microlitri e lasciare in ghiaccio fino a nuovo uso. Utilizzando inoculums virali più elevate induce letalità prima che i neonati raggiungano 2-3 settimane di età. Nella nostra esperienza, 500 PFUs causato mortalità nel neonato ogni 5 a 7 giorni dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 2. Iniezione di neonati <ol><li> Quando i neonati (4-20 hr-topi) sono disponibili, manipolare la lettiera e le feci della gabbia con i guanti prima di maneggiare con cura i cuccioli per evitare la contaminazione con gli odori &quot;estranei&quot; che sottolineare la madre e indurre il rigetto dei cuccioli . </li><li> Eseguire un&#39;iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina (29 G) come mostrato nella Figura 1A. Tenere il neonato con la pelle dorsale. Con il lato ventrale, introdurre l&#39;ago sotto la zampa anteriore e spingere delicatamente per via sottocutanea per raggiungere la cavità peritoneale (un po &#39;sotto l&#39;ombelico). Al momento Iniettare 1% Blu di metilene diluito in DPBS e monitoriamo la sopravvivenza di practice la tecnica prima di eseguire le infezioni virali. Dal blu di metilene è chiaramente visibile durante il processo di iniezione, si consiglia di eseguire questa iniezione di &quot;allenamento&quot; prima di garantire un&#39;adeguata distribuzione della sospensione virale nella cavità intraperitoneale. </li><li> Eliminare le gocce di sangue molto piccoli che possono sorgere e posizionare il nuovo neonato nella gabbia. </li></ol> 3. Imaging in vivo <ol><li> Il giorno 7, di gestire i neonati con la stessa cautele come accennato in precedenza. Iniettare per via intraperitoneale una miscela di anestetici (4 mg / ml di ketamina, 0,8 mg / ml xilazina) e luciferina (0,15 mg / g di peso corporeo) in 50 microlitri in ciascun animale. Peso medio corporeo degli animali è di 1-2 g e la dose di anestetici per animale è: ketamina 40 mcg, xylazina 8 mcg Attendere 12-15 minuti fino a quando luciferina raggiunge il suo massimo di emissione. Questo deve essere determinato in anticipo e dipende dal provider luciferina e il sistema di imaging utilizzato. </li><li> Mentre i cuccioli sono anesthetized, le tag per l&#39;identificazione futuro e raccogliere un piccolo pezzo di tessuto che può quindi essere utilizzato per future genotipizzazione se si utilizzano animali mutanti. </li><li> Collocare i cuccioli nel sistema di imaging ed eseguire acquisizione della luce emessa dal corpo intero. Sette giorni dopo l&#39;infezione, il virus si è replicato in numerose copie negli organi bersaglio come fegato, reni, polmoni e delle ghiandole salivari, pertanto, la durata dell&#39;esposizione dovrebbe essere breve. Nel nostro caso, eseguiamo l&#39;acquisizione per 10 a 20 secondi (Figura 1B). La piattaforma nella camera di acquisizione del dispositivo di imaging deve essere riscaldato per evitare un eccessivo raffreddamento della temperatura corporea degli animali anestetizzati. Inoltre, è utile per ottenere immagini a bassa risoluzione di vari animali all&#39;interno di un ciclo di acquisizione e poi, risalire la piattaforma più vicino alla lente della fotocamera in modo da concentrarsi su una parte di un particolare animale o di un organo isolato dopo la dissezione. Il software deve consentire rapidi cambiamentidei parametri (tempo di esposizione, distanza campione / obiettivo, sensibilità), la quantificazione di regioni definite di interesse e il futuro di esportazione di immagini istantanee. </li><li> Per acquisire segnale luminoso da solo la testa, coprire il corpo dei neonati sdraiato lateralmente con una spessa, carta scura che maschera i fotoni emessi al livello degli organi dove avviene la replicazione virale elevata (fegato, polmoni, ghiandole salivari) ed effettuare acquisizione di 5 a 10 min (Figura 1C). Eseguire acquisizione del lato opposto dell&#39;animale nelle stesse condizioni. </li><li> Reintrodurre i cuccioli nella gabbia e posizionare una lampada riscaldante in alto per evitare un eccessivo raffreddamento dei neonati anestetizzati. Monitorare regolarmente il recupero post-anestetico. Con la dose indicata, anestesia attualmente dura 30 min. </li><li> Ripetere la stessa procedura nei giorni 9, 11 e 14. Nei giorni 11 e 14, modificare la dose di anestetici (6 mg / ml di ketamina, 1,2 mg / ml xylazina). </li></ol>

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Genome. 17, 398-406 (2006).</li><li>Juanjuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+for+congenital+CMV+infection+and+hearing+impairment.">Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment.</a> Virol. J. 8, 70 (2011).</li><li>Koontz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+development+of+the+brain+after+focal+herpesvirus+infection+of+the+central+nervous+system.">Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system.</a> J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).</li><li>Bantug, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+lymphocytes+control+murine+cytomegalovirus+replication+in+the+central+nervous+system+of+newborn+animals.">CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals.</a> J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).</li><li>Wells, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+welfare+and+the+3Rs+in+European+biomedical+research.">Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).</li><li>Sacher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cell+types+in+cytomegalovirus+infection+in+vivo.">The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo.</a> Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).</li><li>Lutarewych, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+and+titration+of+murine+cytomegalovirus+in+a+continuous+bone+marrow-derived+stromal+cell+line+(M2-10B4).">Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4).</a> J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).</li></ol>

Gli autori dichiarano assenza di competizione interesse finanziario. Dichiarazione etica Gli animali sono stati mantenuti in condizioni esenti da organismi patogeni nella funzione di cura degli animali della Institut d&#39;Immunologie et d&#39;Hématologie. Manipolazione dei topi e delle procedure sperimentali sono state condotte in conformità con la legge francese per la protezione di animali da laboratorio. La procedura è stata approvata dal servizio veterinario della Prefettura du Bas-Rhin (Francia) con il numero di autorizzazione A-67-345.

Utilizzando la tecnologia di imaging in vivo per monitorare MCMV-Luc diffusione in topi neonati, siamo stati in grado di osservare la diffusione virale nel cervello di animali mutanti, al contrario di wild-type. Ulteriore dissezione dell&#39;animale e di imaging ex vivo del cervello ha confermato la presenza del virus luminescente nel sistema nervoso centrale. Inoltre, abbiamo anche effettuato immunoistochimica (non mostrato) su sezioni sottili cerebrali con un anticorpo specifico per la prote...

Citomegalovirus umano (HCMV/HHV-5) è un membro della famiglia di β-herpesvirus. HCMV è altamente prevalente, patogeno opportunista che di solito è acquisito durante primi anni di vita come un&#39;infezione asintomatica 1. Come tutti i virus erpetici, HCMV persiste per tutta la vita dell&#39;ospite cui sistema immunitario strettamente controlla la replicazione virale. Gli episodi di riattivazione virale per lo più si verificano in individui immunocompromessi, come i pazienti di trapianto che assumono farmaci per prevenire il rigetto del trapianto 2. Negli adulti, HCMV è anche stato collegato a glioblastomi 3. Inoltre, HCMV è un patogeno importante per i neonati con immunità immaturo 4-6. L&#39;infezione primaria nello sviluppo del feto o il neonato, può avere gravi conseguenze. HCMV infezione è la causa infettiva più comune di difetti congeniti alla nascita e disturbi infantili nei paesi sviluppati. Si stima che l&#39;incidenza di infezione da HCMV neonatale colpisce 0,5-1% of tutti i nati vivi tra i quali il 5-10% soffrirà di sintomi gravi, come la microcefalia o ipoplasia cerebellare. Inoltre, il 10% dei neonati con infezione virale subclinica sarà poi sviluppare sequele che porta a ritardo mentale, perdita, difetti visivi o il sequestro e l&#39;epilessia 7,8 dell&#39;udito. Al contrario di altri herpesvirus umani come l&#39;herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) che possono essere inoculati nei topi attraverso diverse vie di iniezione 9, la replica citomegalovirus è specie specifico. Questa caratteristica ha gravemente ostacolato le indagini di HCMV patogenesi che vengono eseguite in diversi modelli animali (topo, ratto, cavia, scimmia rhesus) e le rispettive genuini CMVs ospite-specifici. Tutti CMVs presentano somiglianze significative dimensioni del genoma e organizzazione, tropismo tissutale e regolazione dell&#39;espressione genica. Hanno anche indurre patologie simili nei loro rispettivi host. Nonostante la diversità genomica esseretween HCMV e mouse citomegalovirus (MCMV) (50% delle ORF presenti nel virus umano sono identificati nella murino CMV), il modello di topo ha recentemente dimostrato di essere vantaggioso, soprattutto perché ceppi mutanti possono essere testati per la loro capacità di controllare virale replicazione in vivo. Ciò ha portato ad una schermata genetico che ha consentito una stima del numero di geni di topo espresso allo stadio adulto che compongono il &quot;resistome&quot; per questo virus 10. Complessivamente, questo indica che i topi MCMV infettati rappresentano un interessante modello per lo studio delle interazioni ospite-virus negli adulti. L&#39;esplorazione di infezione congenita da CMV è più complessa, perché le differenze di organizzazione strato placentare tra umani e topi compromettono la trasmissione materno-fetale dell&#39;infezione virale nei topi. Recentemente, l&#39;iniezione diretta di MCMV nella placenta il giorno 12.5 di gestazione ha permesso infezione del cervello di topi neonati che hanno portato alla compromissione dell&#39;udito 11. Tuttavia, la maggior investigations ora usano l&#39;iniezione intraperitoneale di 4-20 hr-vecchi neonati di fornire disseminazione sistemica virale che porta a infezione del cervello ematogena, un modello che è più rilevante di quella di una iniezione intracranica. Questo protocollo importanti conoscenze CMV patogenesi e più in particolare, è stato dimostrato che MCMV infezione di neonati risultati nella replicazione virale in cellule neuronali e gliali situate in focolai infiammatori che vengono infiltrati di cellule mononucleate come macrofagi 12. Questo rapporto descrive anche morfogenesi alterata del cervelletto accompagnato con diminuita proliferazione dei neuroni granulari e la migrazione e l&#39;induzione di geni multipli interferone-stimolati. Il ruolo essenziale delle + cellule T CD8 per il controllo di MCMV nel sistema nervoso centrale è stato anche riportato dallo stesso gruppo 13. Un aspetto importante da considerare quando si analizza l&#39;effetto patologica di un microbo è la dinamica del infettareione. Nel caso di MCMV, è particolarmente importante per esplorare e quantificare la progressione di diffusione virale nel cervello di sviluppo al fine di comprendere e anticipare la grandezza delle future lesioni neurobiologiche. Tradizionalmente, la quantificazione della progressione di un&#39;infezione richiede il sacrificio regolare di animali infetti a titolo patogeno nei tessuti, come il cervello, che sono altrimenti inaccessibili. Questo tipo di protocollo viene ora contestata da necessario miglioramento del benessere degli animali e le 3R (ridurre, perfezionare, Replace) principi 14. Utilizzando tecnologie in vivo imaging può consentire una drastica riduzione del numero di animali che sono necessari in esperimenti di infezione in vivo. Qui, segnaliamo e descriviamo una analisi tempo-corso di diffusione virale nel cervello su intraperitoneale MCMV-Luc iniezione per neonati mouse. Utilizzando gli stessi animali, abbiamo seguito e monitorato in vivo i luoghi di intensa VIreplica ral durante un periodo di 2 settimane.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent/Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3523A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>319112</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Insulin needles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-4897</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CentraVet</td>
			<td>Ket 201</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine/Vetranal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>46995</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>P0436500</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Luciferin</td>
			<td>Caliper</td>
			<td>760504</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>gentamycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>carboxymethylcellulose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4888</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>crystal violet</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3886</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IVIS 50</td>
			<td>Caliper/Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

use of in vivo imaging to monitor the progression of experimental mouse cytomegalovirus infection in neonates

Citomegalovirus umano (HCMV o HHV-5) è un agente patogeno mortale in individui immunocompromessi. Su infezione congenita o neonatale, il virus può infettare e replicarsi nel cervello in via di sviluppo, che può indurre gravi danni neurologici, tra cui sordità e ritardo mentale. Nonostante il potenziale gravità dei sintomi, le opzioni terapeutiche sono limitate dalla mancanza di un vaccino e l&#39;assenza di una specifica terapia antivirale. Inoltre, una descrizione precisa degli eventi molecolari che si verificano durante l&#39;infezione del sistema nervoso centrale (SNC) è ancora carente dal osservazioni principalmente derivano dalla autopsia dei bambini infetti. Diversi modelli animali, come macaco rhesus CMV, sono stati sviluppati e importanti conoscenze CMV patogenesi nel SNC. Tuttavia, nonostante la vicinanza evolutiva con gli esseri umani, questo modello è stata limitata dalla procedura di inoculazione intracranica usato per infettare gli animali e controistently indurre infezione del SNC. Inoltre, considerazioni etiche hanno promosso lo sviluppo di modelli alternativi, tra i quali l&#39;infezione neonatale di topi appena nati con citomegalovirus topo (MCMV) ha recentemente portato a significativi progressi. Ad esempio, è stato segnalato che l&#39;iniezione intraperitoneale di MCMV a Balb / c neonati porta all&#39;infezione di neuroni e cellule gliali in aree specifiche del cervello. Questi risultati suggeriscono che l&#39;inoculazione sperimentale di topi potrebbe ricapitolare i deficit indotti da HCMV nei bambini. Tuttavia, un&#39;analisi dinamica di MCMV infezione di neonati è di difficile esecuzione a causa classica metodologia richiede il sacrificio di un numero significativo di animali a differenti tempi di analizzare il carico virale e / o parametri immuno-correlati. Per aggirare questo ostacolo e permettere future indagini di animali mutanti rari, abbiamo applicato nella tecnologia di imaging in vivo per eseguire analisi in tempo-corso della viral disseminazione nel cervello a seguito di iniezione periferica di un MCMV ricombinante esprimente luciferasi di C57BL / 6 neonati.

Un esperimento rappresentativo è illustrato in Figura 1. A seguito di iniezione intraperitoneale di 50 PFUs di MCMV-Luc (Pannello A mostra una iniezione simile esercitata con blu di metilene di visualizzare via sottocutanea dell&#39;ago), neonati sono stati anestetizzati e ricevuti simultaneamente 0,3 mg del substrato di luciferasi (Luciferin, compasso). Quindici minuti dopo, gli animali sono stati posti lato ventrale nella camera di acquisizione del IVIS 50 (In Vivo Imaging System, calibro) e la luce ...

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Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Citomegalovirus (HCMV), l&#39;infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato tutta-animale<em&gt; In vivo</em&gt; Di imaging per eseguire analisi in tempo-corso di neonati infettati con un virus luciferasi-ricombinante.

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

14.8K Views.  Université de Strasbourg. Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato tutta-animale In vivo Di imaging per eseguire analisi in tempo-corso di neonati infettati con un virus luciferasi-ricombinante.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

L&#39;uso di diacetato Carboxyfluorescein succinimidile Ester (CFSE) per monitorare la proliferazione dei linfociti

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) il rilevamento di un neuro-invasiva Virus encephalitic

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

Imaging di In Situ Interferon Gamma Production nella Spleen del topo dopo l'infezione da Listeria monocytogenes

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Un saggio ex vivo per studiare Candida albicans Morphogenesi ifale nel tratto gastrointestinale

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...