Gli autori ringraziano Linda Turner per l&#39;assistenza con la preparazione microbiologica. RZ e LGW sono stati finanziati dall&#39;Istituto Rowland ad Harvard e CGB è stato finanziato come studioso di una Fondazione CAPES, Scienza Senza Frontiere Programma, Brasile (Processo # 7340-11-7)

1. Setup and Data Acquisition <ol><li> Far crescere una cultura di Streptococcus ceppo V4051-197 (nuoto liscio), le cellule in KTY medio da congelato magazzino 22. Incubare in un agitatore rotativo notte a 35 ° C e 150 rpm, a saturazione. </li><li> Inoculare 10 ml di mezzo fresco KTY con 500 microlitri della cultura satura. Incubare per un ulteriore 3,5 ore a 35 ° C e 150 rpm fino a quando le cellule raggiungono una densità ottica di circa 1,0 a λ = 600 nm (circa 5 x 10 8 cellule / ml). </li><li> Diluire 1:400 in mezzi freschi per ottenere la concentrazione finale di cellule mobili. </li><li> Su un vetrino da microscopio, fare un anello di grasso (per esempio da una siringa riempita di vaselina) di circa 1 mm di altezza e una goccia della soluzione campione al centro. Inserire un vetro di copertura sulla parte superiore e premere leggermente ai bordi per sigillare quella che liquido è in contatto sia con vetrino e coprioggetto. La camera del campione risultante dovrebbe essere around 100-200 micron di profondità. </li><li> Posizionare la camera di campione nel microscopio con il vetro di copertura rivolto verso il basso, e con attenzione, per evitare la formazione di bolle d&#39;aria nell&#39;olio tra vetro e lente. </li><li> Fuoco il microscopio sulla superficie inferiore della camera del campione, e portare il condensatore a concentrarsi. </li><li> Spegnere l&#39;illuminazione standard e posizionare la testina LED dietro l&#39;apertura del condensatore del microscopio. Impostare il LED di alimentazione alla massima potenza. </li><li> Chiudere l&#39;apertura del condensatore a sua misura massima e, se necessario, spostare il LED relativo supporto fino a quando l&#39;illuminazione è centrata sul diaframma lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Accendere il computer e la macchina fotografica, e reindirizzare tutta la luce alla porta macchina fotografica del microscopio. Regolare il frame rate e la dimensione dell&#39;immagine nel software di acquisizione immagini. </li><li> Rendere il tempo di esposizione telaio il più breve possibile, pur mantenendo un buon contrasto. Controllare un&#39;intensità istogramma dell&#39;immagine per assicurare che l&#39;immagine non è saturated o sottoesposta. </li><li> Se necessario, riorientare il microscopio in modo tale oggetto di interesse è leggermente sfocato (tipicamente del 10-30 micron). L&#39;oggetto e il piano focale dovrebbe essere nello stesso mezzo (cioè il piano focale dovrebbe trovarsi all&#39;interno della camera del campione). </li></ol> 2. Ricostruzione Il primo passo di elaborazione dati è riorientare numericamente un fotogramma video di una serie di diverse profondità, producendo una pila di immagini. Software di facile utilizzo per fare questo possono essere trovate qui: <a href="http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html">http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html</a> insieme a esempio immagini (acquisite utilizzando un microscopio invertito, e una immersione in olio lente obiettivo 60X) e un file di scena per il raggio tracciato rendering. <ol><li> Inserire il telaio di interesse e rispettiva background come file immagine separati, nelle caselle relative sull&#39;interfaccia. Una immagine di sfondo è una cornice che fAirly rappresenta lo sfondo del video, in assenza dell&#39;ologramma, e verrà utilizzato per sopprimere qualsiasi rumore schema fisso che potrebbe interferire con la localizzazione ologramma e analisi. </li><li> Inserire i valori nelle caselle di impostazioni globali sul lato sinistro dello schermo prima di eseguire il programma. I primi tre sono i parametri dello stack di uscita: la posizione assiale del primo telaio (&#39;Start focus&#39;), numero di strati dello stack ricostruita (&#39;Numero di passi&#39;); distanza assiale tra ogni fetta dello stack (&#39;Step size&#39;) . </li><li> Per ricostruire oggetti con le giuste proporzioni, la dimensione del passo dovrebbe essere la stessa dimensione della spaziatura tra pixel laterale. Immettere la frequenza di campionamento laterale della fotocamera (spaziatura 1/pixel) nella casella &#39;Pixel / micron&#39;, la lunghezza d&#39;onda illuminazione e indice di rifrazione medio negli ultimi due caselle. Valori di default del programma sono appropriate per ricostruire i dati di esempio. </li><li> Premere il tasto &#39;Flip Z-gradient&#39; se il centro del object è scuro in ologramma (vedi esempio telaio 2005 e la sezione di discussione per maggiori dettagli). </li><li> Controllare il filtro passa-banda sullo stato / off (di default è on). Questo filtro passabanda opzionale, situata in una scatola sotto l&#39;interruttore gradiente-flip, è responsabile per la soppressione del contributo di pixel rumorosi. Il filtro passa-banda è applicato ad ogni fetta immagine immediatamente dopo generazione. </li><li> Controllare l&#39;interruttore di uscita intermedia stati on / off (di default è on). Fasi di analisi intermedia sono scritti in due video in uscita, come non compresso file avi:. Il primo è lo stack riorientato (nome file che termina in &#39;_stack.avi&#39;), il secondo è lo stack dopo l&#39;operazione gradiente assiale (nome file che termina in &#39; _gradient.avi &#39;). Idealmente, questo secondo pila conterrà l&#39;oggetto di interesse ha evidenziato come un oggetto luminoso su uno sfondo scuro. </li><li> Dopo aver impostato tutti i parametri, premere &#39;Run&#39; nella finestra principale. La cornice selezionata viene visualizzata nel riquadro principale del software. </li><li> Utilizzare l&#39;ingrandimento strumento di vetro trovato nella barra degli strumenti a sinistra l&#39;immagine per ingrandire (click sinistro) e zoom out (Shift + click sinistro). Utilizzare lo strumento rettangolo sulla barra degli strumenti per selezionare una regione di interesse (ROI). Cattura il maggior numero di frange del ologramma possibile all&#39;interno del rettangolo, in modo da ottimizzare la ricostruzione. </li><li> Premere il tasto &#39;Processo&#39; per generare i due stack di immagine. Ispezionare le pile risultanti utilizzando ImageJ (che può essere ottenuto gratuitamente presso <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). Se l&#39;oggetto di interesse può essere chiaramente visto nella pila di immagini gradiente, procedere al passaggio successivo per estrarre le coordinate dell&#39;oggetto. </li></ol> 3. Rendering <ol><li> Oltre telaio rifocalizzazione, questo programma può individuare la x, y, z coordinate per ogni voxel in oggetto di interesse. Premere il pulsante &#39;Feature Extraction&#39; per abilitare questa funzione. </li><li> Immettere un percorso, inclusa l&#39;estensione (per esempio: c: home output.inc), per ilUscita coordinate file. Selezionare &#39;stile POV-Ray&#39; nella casella &#39;stile coordinata di uscita&#39;. Questo fa sì che il programma di scrivere un file oggetto che può essere visualizzato utilizzando il pacchetto software raytracing libero POV-Ray (che può essere ottenuto da <a href="http://www.povray.org/">http://www.povray.org/</a> ). </li><li> Rielaborare le immagini come al precedente punto 2. Il programma fornirà una serie di (x, y, z) coordina nel ROI selezionata, scritto nel nome del file nella &#39;uscita coordinate&#39; box. Estrazione di coordinate dell&#39;oggetto richiede molto più tempo rispetto alla generazione stack. </li><li> Assicurarsi che il file POV-Ray campione (fornito con il codice ricostruzione) si trova nella stessa cartella il file delle coordinate appena generati. Modificare il file pov di esempio. E sostituire il nome del file tra virgolette sulla linea # Include &quot;MYFILE.inc&quot; , con il nome del file di dati generati dalla ricostruzione del codice. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Esegui&#39; in POV-Ray per il rendering di un&#39;immagine bitmap. Tegli posizione della telecamera, l&#39;illuminazione e le opzioni di texture sono solo alcune delle personalizzazioni possibili in POV-Ray, vedere la documentazione in linea per i dettagli. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il passo più importante in questo protocollo sperimentale è la cattura accurata di immagini da un setup sperimentale stabile. Con scarsi dati di base, ad alta ricostruzione fedeltà è quasi impossibile. E &#39;anche importante evitare lenti dell&#39;obiettivo con un elemento di contrasto di fase interna (visibile come un anello scuro quando guardando attraverso il posteriore dell&#39;obiettivo), in quanto questo può degradare l&#39;immagine ricostruita. L&#39;oggetto di interesse deve essere sufficientemente lontana...

Linea digitale microscopia olografica (DIHM) permette veloce l&#39;imaging tridimensionale di campioni microscopici, quali microrganismi nuoto 1,2 e sistemi di materia morbidi 3,4, con modifiche minime a una configurazione microscopio standard. In questo documento viene fornita una dimostrazione pedagogica di DIHM, incentrata su software sviluppato nel nostro laboratorio. Questo documento contiene una descrizione di come impostare il microscopio, ottimizzare l&#39;acquisizione dei dati, ed elaborare le immagini registrate per ricostruire i dati tridimensionali. Il software (basato in parte su software sviluppato dalla DG Grier e altri 5) e immagini di esempio sono disponibili gratuitamente sul nostro sito web. Fornire una descrizione dei passaggi necessari per configurare il microscopio, ricostruire i volumi tridimensionali da ologrammi e rendere i volumi risultanti di interesse utilizzando un raggio gratuito tracing pacchetto software. L&#39;articolo si conclude con una discussione di fattori che incidono sulla qualità della ricostruzione, E un confronto di DIHM con metodi concorrenti. Anche se DIHM stato descritto qualche tempo fa (per una revisione generale dei suoi principi e sviluppo, vedi Kim 6), la potenza di calcolo necessaria e la competenza di elaborazione delle immagini hanno sinora in gran parte limitato l&#39;uso di gruppi di ricerca specializzati con una particolare attenzione allo sviluppo dello strumento. Questa situazione sta cambiando alla luce dei recenti progressi nella tecnologia informatica e fotocamera. Computer desktop moderni possono facilmente far fronte con la trasformazione e sui requisiti di archiviazione dati; telecamere CCD o CMOS sono presenti nella maggior parte dei laboratori di microscopia e del software necessario è effettuata liberamente disponibile su internet da gruppi che hanno investito tempo nello sviluppo della tecnica. Vari sistemi sono stati proposti per l&#39;imaging la configurazione di oggetti microscopici in un volume di campione tridimensionale. Molti di questi sono tecniche di scansione 7,8, in cui una pila di immagini viene registrata dalla mechanically tradurre il piano dell&#39;immagine attraverso il campione. Confocale a scansione microscopia a fluorescenza è forse l&#39;esempio più familiare. Tipicamente, un colorante fluorescente viene aggiunto a un oggetto fase per raggiungere un livello accettabile di contrasto campione, e la disposizione confocale utilizzato per localizzare spazialmente emissione fluorescente. Questo metodo ha portato a progressi significativi, per esempio nel campo della scienza colloidale in cui è consentito l&#39;accesso alla dinamica tridimensionale di sistemi affollati 9-11. L&#39;uso di etichettatura è una differenza importante tra la microscopia confocale e DIHM, ma le altre caratteristiche delle due tecniche sono paragonabili. DIHM ha un vantaggio significativo in velocità che l&#39;apparecchio ha parti in movimento. Gli specchi a scansione meccanica in sistemi confocale pongono un limite superiore sul tasso di acquisizione dei dati - in genere circa 30 fotogrammi / sec per immagine pixel a 512 x 512. Una pila di tali immagini da diversi piani focali può essere ottenuta con fisicamente transldall&#39;uso della fase del campione o lente obiettivo tra i fotogrammi, portando ad una velocità di acquisizione finale di circa un volume al secondo per uno stack frame 30. In confronto, un sistema olografico basato su una moderna fotocamera CMOS in grado di catturare 2.000 fotogrammi / sec con le stesse dimensioni e la risoluzione dell&#39;immagine, ogni fotogramma viene elaborato `in linea &#39;per dare uno snapshot indipendente dal volume del campione. Per ribadire: campioni fluorescenti non sono richiesti per DIHM, anche se un sistema è stato sviluppato che esegue la ricostruzione olografica di un soggetto fluorescente 12. Nonché informazioni sul volume tridimensionale, DIHM può anche essere utilizzato per fornire immagini a contrasto di fase quantitative 13, ma che non rientra nell&#39;ambito della discussione qui. Immagini di dati Raw DIHM sono bidimensionali, e per certi aspetti sembrano immagini al microscopio normali, anche se fuori fuoco. La differenza principale tra DIHM e microscopia a campo luminoso norma risiede negli anelli di diffrazione che circondano oggetti in il campo visivo; questi sono a causa della natura della illuminazione. DIHM richiede una fonte più coerente del campo luminoso - tipicamente un LED o laser. Gli anelli di diffrazione nell&#39;ologramma contengono le informazioni necessarie per ricostruire una immagine tridimensionale. Ci sono due approcci principali per l&#39;interpretazione dei dati DIHM; rifocalizzazione montaggio e numerica diretta. Il primo approccio è applicabile nei casi in cui la forma matematica del modello di diffrazione è noto in anticipo 3,4; questa condizione è soddisfatta da una piccola manciata di oggetti semplici come sfere, cilindri, e ostacoli mezzo aereo. Raccordo diretto si applica anche nei casi in cui la posizione assiale dell&#39;oggetto è noto, e l&#39;immagine può essere montato utilizzando una tabella di look-up di modelli di immagini 14. Il secondo approccio (rifocalizzazione numerico) è invece più generale e si basa sull&#39;utilizzo degli anelli di diffrazione dell&#39;immagine ologramma bidimensionale a ricostruire numericamente il campo otticoun numero di (arbitrariamente distanziati) piani focali in tutto il volume del campione. Esistono diversi metodi correlati per fare questo 6; questo lavoro utilizza il Rayleigh-Sommerfeld indietro tecnica di propagazione come descritto da Lee e Grier 5. L&#39;esito di questa procedura è una pila di immagini che riproducono l&#39;effetto di modificare manualmente il piano focale del microscopio (da qui il nome `rifocalizzazione numerica &#39;). Una volta che è stata generata una pila di immagini, la posizione del soggetto nel volume focale deve essere ottenuta. Una serie di euristica di analisi delle immagini, come ad esempio la varianza intensità locale o contenuto di frequenza spaziale, sono stati presentati per quantificare la nitidezza di messa a fuoco in diversi punti del campione 15. In ogni caso, quando una particolare metrica immagine è ingrandita (o minimizzata), l&#39;oggetto è considerato a fuoco. A differenza di altri programmi che cercano di identificare un piano focale particolare se un oggetto è &#39;a fuoco&#39;, il metodo in questo lavoro individua points che si trovano dentro l&#39;oggetto di interesse, che possono giungere attraverso una vasta gamma di piani focali. Questo approccio si applica ad una vasta gamma di argomenti ed è particolarmente adatto per estesi, campioni debolmente-Scattering (oggetti fase), come colloidi astiformi, catene di batteri o flagelli eucariotici. In tali campioni il contrasto dell&#39;immagine cambia quando l&#39;oggetto passa attraverso il piano focale; un&#39;immagine sfocata ha un centro luce se l&#39;oggetto è su un lato del piano focale e un centro scuro se è dall&#39;altra. Oggetti pura fase hanno poco o nessun contrasto quando esse si trovino esattamente nel piano focale. Questo fenomeno di inversione contrasto è stato discusso da altri autori 16,17 ed è infine dovuto alla fase Gouy anomalia 18. Questo è stato introdotto in forma più rigorosa nel contesto di olografia altrove, dove vengono valutati i limiti della tecnica, la tipica incertezza in posizione è dell&#39;ordine di 150 nm (circa un pixel) in EACh direzione 19. Il metodo della fase anomalia Gouy è uno dei pochi regimi DIHM ben definiti per determinare la struttura di oggetti estesi in tre dimensioni, ma comunque alcuni oggetti sono problematici per ricostruire. Gli oggetti che si trovano direttamente lungo l&#39;asse ottico (indicando la telecamera) sono difficili da ricostruire con precisione, incertezze nella lunghezza e la posizione dell&#39;oggetto diventano grandi. Questa limitazione è in parte dovuta alla profondità bit ristretta dei pixel di registrazione dell&#39;ologramma (il numero di livelli di grigio distinti che la fotocamera può registrare). Un&#39;altra configurazione problematica si verifica quando l&#39;oggetto di interesse è molto vicino al piano focale. In questo caso, le immagini reali e virtuali dell&#39;oggetto sono ricostruiti in prossimità, dando luogo a campi ottici complessi che sono difficili da interpretare. Un secondo, leggermente meno importante preoccupazione qui è che le frange di diffrazione risultanti occupano meno del sensore di immagine, e questo inf grossolana graniormazione porta ad una ricostruzione più povera qualità. In pratica, un filtro gradiente semplice viene applicato ai volumi ricostruiti tridimensionali per rilevare forti inversioni intensità lungo la direzione di illuminazione. Regioni dove l&#39;intensità cambia rapidamente dal chiaro allo scuro, o viceversa, vengono quindi associati con le regioni di scattering. Oggetti debolmente di scattering sono ben descritti come una collezione non interagenti di tali elementi 20, questi contributi individuali somma per dare il campo diffuso totale che è facilmente invertita utilizzando il retro metodo di propagazione di Rayleigh-Sommerfeld. In questo lavoro, l&#39;intensità tecnica gradiente assiale viene applicato a una catena di cellule Streptococcus. I corpi cellulari sono oggetti di fase (la specie E. coli ha un indice di rifrazione misurato 21 per essere 1.384 alla lunghezza d&#39;onda λ = 589 nm; ceppo Streptococcus è probabilmente simili) e appaiono come una catena ad alta intensità di blob collegati in thè stata applicata e volume del campione dopo il filtro gradiente. Soglia e includono metodi di estrazione standard applicati a questo volume filtrato consentono l&#39;estrazione di pixel volumetrici (voxel) corrispondenti alla regione all&#39;interno delle cellule. Un particolare vantaggio di questo metodo è che permette la ricostruzione non ambigua di posizione di un oggetto in direzione assiale. Metodi simili (almeno, quelli che registrano ologrammi vicino all&#39;oggetto, impressi attraverso un obiettivo microscopio) soffrono di essere in grado di determinare il segno di questo spostamento. Anche se il metodo di ricostruzione Rayleigh-Sommerfeld è anche l&#39;accesso indipendente in questo senso, l&#39;operazione di sfumatura permette di discriminare tra oggetti deboli fase sopra e sotto il piano focale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="780">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:180px;">Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Corp.</td>
			<td style="width:147px;"> </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:180px;">LED</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">M660L3</td>
			<td style="width:267px;">emission wavelength &#955;=660 nm, linewidth approximately 20 nm </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">LED power supply</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM2T2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Thread Adapter</td>
			<td style="width:187px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:147px;">SM1A2</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">Frame Grabber board</td>
			<td style="width:187px;">EPIX </td>
			<td style="width:147px;">PIXCI E4 </td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:180px;">High-Speed CMOS camera</td>
			<td style="width:187px;">Mikrotron</td>
			<td style="width:147px;">MC-1362</td>
			<td style="width:267px;"> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digital inline holographic microscopy (dihm) of weakly-scattering subjects

Oggetti debolmente di scattering, come piccole particelle colloidali e la maggior parte delle cellule biologiche, si incontrano spesso in microscopia. Infatti, una serie di tecniche sono state sviluppate per visualizzare meglio questi oggetti di fase; contrasto di fase e DIC sono tra i metodi più diffusi per migliorare il contrasto. Tuttavia, la posizione di registrazione e la forma in direzione out-of-imaging-plane rimane difficile. Questa relazione introduce un semplice metodo sperimentale per determinare con precisione la posizione e la geometria di oggetti in tre dimensioni, utilizzando la microscopia olografica digitale inline (DIHM). In generale, il volume del campione accessibile è definita dalla dimensione del sensore telecamera nella direzione laterale, e la coerenza illuminazione nella direzione assiale. Volumi di campione tipiche vanno da 200 micron x 200 micron x 200 micron con illuminazione a LED, per5 millimetri x 5 mm x 5 mm o superiore in illuminazione laser. Questa luce di illuminazione è configurato in modo che le onde piane sono incidenti sul campione. Oggetti nel volume del campione poi diffondono la luce, che interferisce con la luce unscattered per formare modelli di interferenza perpendicolare alla direzione di illuminazione. Questa immagine (l&#39;ologramma) contiene le informazioni profondità richiesta per ricostruzione tridimensionale, e può essere catturata su un dispositivo di imaging quali uno CMOS o CCD. Il metodo Back Propagation Rayleigh-Sommerfeld è impiegato per rifocalizzare numericamente immagini al microscopio, e una semplice euristica di imaging basata sulla fase Gouy anomalia viene utilizzato per identificare spargendo oggetti all&#39;interno del volume ricostruito. Questo metodo semplice e robusto risulta in un, misura univoca senza modello della posizione e forma degli oggetti in campioni microscopici.

Per dimostrare le capacità di DIHM, esperimenti sono stati eseguiti su una catena di batteri Streptococcus. La catena stessa misurato 10,5 millimetri lungo, ed era composta di 6-7 cellule sferico cilindrico (due delle cellule della catena sono vicini a dividere) con diametri nell&#39;intervallo 0,6-1 micron. Figure 1a e 1b mostrano l&#39;interfaccia principale della ricostruzione e del software di rendering. Esempi del procedimento rifocalizzazione numerico si vedono nella <st...

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Digital Inline Holographic Microscopy DIHM of Weakly-scattering Subjects

Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico.

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) dei soggetti debolmente di scattering

Weakly-scattering objects, such as small colloidal particles and most biological cells, are frequently encountered in microscopy. Indeed, a range of ...

digital-inline-holographic-microscopy-dihm-weakly-scattering

Research

JoVE Journal

Biology

Digital Inline Holographic Microscopy (DIHM) of Weakly-scattering Subjects

12.1K Views.  Harvard University.  Le posizioni tridimensionali di oggetti debolmente scattering possono essere identificati univocamente tramite linea digitale microscopia olografica (DIHM), che comporta una modifica minore ad un microscopio standard. Il nostro software utilizza un semplice euristica di imaging accoppiato con Rayleigh-Sommerfeld back-propagation cedere la posizione tridimensionale e la geometria di un oggetto fase microscopico. 

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Determining heat and mechanical pain threshold in inflamed skin of human subjects

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific nociceptive and inflammatory biochemicals in humans. In this article we will show pain-testing paradigms that are often used in tandem with microdialysis procedures. Combining pain tests with microdialysis provides the critical link between behavioral and biochemical data that allows identifying key biochemicals responsible for generating and propagating pain.
Two models of evoking pain in inflamed skin of human study participants are shown. The first model evokes pain with aid of heat stimuli. Heat evoked pain as described here is predominantly mediated by small, non-myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (C-fibers). The second model evokes pain via punctuated pressure stimuli. Punctuated pressure evoked pain is predominantly mediated by small, myelinated peripheral nociceptive nerve fibers (A-delta fibers). The two models are mechanistically distinct and independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations involved in pain signaling.
Heat pain is evoked with aid of the TSA II, a commercially available thermo-sensory analyzer (Medoc Advanced Medical Systems, Durham, NC). Stimulus configuration and delivery is handled with aid of specific software. Thermodes vary in size and shape but in principle consist of a metal plate that can be heated or cooled at various rates and for different periods of time. Algorithms assessing heat-evoked pain are manifold. In the experiments shown here, study participants are asked to indicate at what point they start experiencing pain while the thermode in contact with skin is heated at a predetermined rate starting at a temperature that does not evoke pain. The thermode temperature at which a subject starts experiencing pain constitutes the heat pain threshold.
Mechanical pain is evoked with punctuated probes. Such probes are commercially available from several manufacturers (von Frey hairs). However, the accuracy of von Frey hairs has been criticized and many investigators use custom made punctuated pressure probes. In the experiments shown here eight custom-made punctuated probes of different weights are applied in consecutive order, a procedure called up-down algorithm, to identify perceptional deflection points, i.e., a change from feeling no pain to feeling pain or vice versa. The average weight causing a perceptional deflection constitutes the mechanical pain threshold.

Algorithms assessing heat and mechanical pain thresholds in experimentally inflamed skin of human study subjects are shown. The two pain testing paradigms independently examine nociceptive processing by the two major peripheral nerve fiber populations transmitting pain, i.e., non-myelinated C fibers and small myelinated A-delta fibers.

Determinazione calore e soglia del dolore meccanico in pelle infiammata dei soggetti umani

In a previous article in the Journal of Visualized Experiments we have demonstrated skin microdialysis techniques for the collection of tissue-specific ...

Ricerca

Biologia

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

In vivo clonale Monitoraggio di staminali ematopoietiche e cellule progenitrici Contrassegnato da cinque proteine ​​fluorescenti che utilizzano confocale e microscopia Multiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetico-Activated Cell Sorting strategie per isolare e purificare Synovial cellule staminali mesenchimali liquido derivato da un modello di coniglio

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

Micron-scala Phenotyping tecniche di mais fasci vascolari basato su x-Ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.