Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Douglas Goetz (Dipartimento di chimica e biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Fabian Benencia (Dipartimento di Scienze Biomediche, Ohio University) per le discussioni penetranti e la revisione del manoscritto. Ringraziamo anche il Dott. Christopher Huppenbauer per utili discussioni tecniche (W. Nuhsbaum Inc.). Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation (CBET-1.106.118) e il National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

1. Installazione del software <ol><li> Acquistare StreamPix 5 software Multi-Camera con modulo SimulPix o altri software di imaging in grado di raccogliere e combinare immagini catturate dalle telecamere in bianco e nero CCD. </li><li> Requisiti minimi per StreamPix 5 includono: Un PC dotato di processore Core 2 Duo a 2,4 GHz o superiore con 2 GB di RAM o superiore. Una fotocamera supportata IEEE digitale o analogico e frame grabber compatibile. XP/7/Vista di Windows a 32 o 64 bit. Un monitor con risoluzione 1.024 x 768 o superiore. Una scheda grafica con buone prestazioni in 2D (OCU espresso 16x o superiore è consigliato) e 7.200 RPM disco rigido per la registrazione con configurazione RAID-O. </li></ol> 2. L&#39;installazione del sistema Dual Camera Capace di due colori simultanea in tempo reale Imaging <ol><li> Collegare lo splitter DC2 fotometrici delle emissioni, o simile dispositivo frazionamento delle emissioni doppia fotocamera, al microscopio facendo scorrere l&#39;adattatore DC2 C-mount nella porta video del microscope tale che l&#39;alloggiamento della dicroico sul dispositivo è accessibile. </li><li> Inserire due telecamere in bianco e nero CCD in femmine di C-mount 1 e femmina C-mount 2. Telecamere identiche sono preferibili. Telecamere simili possono essere utilizzati, ma la compatibilità dipende hardware interno, soprattutto il sensore d&#39;immagine CCD. </li><li> Utilizzare software di imaging per visualizzare immagini da entrambe le fotocamere. I passi seguenti (2.3.1 - 2.3.4) si applicano a StreamPix 5 con modulo SimulPix e devono essere adattati per altri software di imaging multi-camera. <ol><li> Aprire StreamPix 5 e selezionare &quot;workspace&quot; nella barra multifunzione compito. </li><li> Apri &quot;gestore di lavoro&quot; che si trova all&#39;estrema destra dello schermo e selezionare &quot;nuova area di lavoro&quot;. </li><li> Dopo aver nominato una macchina fotografica, seguire il software richiede di selezionare un grabber da un elenco pre-popolato. Selezionare il grabber corrispondente al modello di fotocamera e ripetere per il secondo lavoro della fotocamera. Per l&#39;area di lavoro risultante dalla fusione, ripetere ancora una volta, ma &quot;tutte le telecamere sono in uso&quot; errore messaggio apparirà. Questo messaggio è normale. </li><li> Una volta caricato il lavoro risultante dalla fusione, assegnare le telecamere dal lavoro 1 e 2 di lavoro per l&#39;area di lavoro risultante dalla fusione nel pannello di aggancio che si trova sul lato destro dello schermo di visualizzazione. </li></ol></li><li> Allineare le telecamere del sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera. <ol><li> Allineare telecamere in campo chiaro o contrasto di fase con la griglia di calibrazione fornito dal produttore con obiettivo Planapo 40X (o superiore). </li><li> Invia luce per gli oculari del microscopio, posizionare la griglia di calibrazione rivestito metallico che è stato fornito dal produttore sul palco microscopio, e piazza la griglia sul palco microscopio. </li><li> Portare la griglia a fuoco. </li><li> Spostare, ma non rimuovere, l&#39;alloggiamento dicroici per allineare la telecamera 1 (fotocamera bypass). Visualizzare la griglia senza binning e senza autoscaling. Mettere a fuoco l&#39;immagine utilizzando la ghiera di messa a fuoco sulla porta C-mount 1. </li><li> Spingere l&#39;alloggiamento dicroico in dual channel dispositivo di acquisizione completamente, in modo che l&#39;immagine è divisa dal dicroico per entrambe le telecamere. </li><li> Allentare le tre 5/64 &quot;set viti e ruotare la seconda fotocamera sulla femmina C-mount 2 fino l&#39;orientamento della griglia è identica in entrambe le immagini. Usando la manopola di regolazione della messa a fuoco su C-mount porta 2, portare l&#39;immagine dalla telecamera 2 a fuoco. </li><li> Finalizzare l&#39;allineamento con l&#39;immagine combinata nell&#39;area di lavoro risultante dalla fusione del software di imaging. Questo permette di vedere un pseudocolore overlay tempo reale delle due immagini della griglia di calibrazione. Regolare le posizioni dell&#39;immagine combinati utilizzando solo la manopola R / L sul lato destro del DC2. Regolare la manopola finché confine verticale destro / sinistro delle immagini è allineato con precisione. </li><li> Usare la manopola U / D per regolare l&#39;allineamento su / giù della seconda immagine fino a quando le barre orizzontali della griglia siano allineati correttamente. </li><li> Se durante l&#39;allineamento su / giù una leggera rotazione della telecamera si verifica, correggere questo problema svitando le tre 5/64 &quot;sch polliciws per la fotocamera da 2 e ruotare fino a quando l&#39;immagine visualizzata è allineato correttamente. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione delle cellule tumorali per piastra Parallel flusso Sezione Adesione saggio <ol><li> Culture BT-20 cellule di carcinoma mammario in mezzo minimo essenziale (MEM) addizionato a mezzo completo con 10% di siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C e 5,0% di CO 2, come precedentemente descritto 2. </li><li> Cellule tumorali raccolta con un trattamento diluito tripsina e contare le cellule con un emocitometro. </li><li> Lavare e sospendere le cellule a 10 7 cellule / ml in 0,1% di albumina di siero bovino (BSA) in DPBS con calcio e magnesio (DPBS +). </li><li> Diluire anticorpi primari, topo purificato anti-CD24 umano e di ratto purificato HECA-452 (antigeni anti-sialofucosylated), a una concentrazione ottimale predeterminata in 0,1% BSA DPBS +. Incubare le cellule per 30 min 9, 10. </li><li> Centrifugare le cellule a 1.200 giri per ottenere un pellet di cellule. Aspivotare un anticorpo primario, e lavare le cellule due volte con 0,1% BSA DBPS +. </li><li> Diluire anticorpi secondari, di capra anti-topo IgG AlexaFluor 568 (emissione di max, 603 nm), e di capra anti-topo IgM AlexaFluor 488 (emissione di max, 519 nm), a una concentrazione ottimale predeterminata in 0.1% BSA DPBS +. Incubare le cellule per 30 min. </li><li> Lavare le cellule due volte e sospendere in 0,1% BSA DPBS + a 10 6 cellule / ml a 0,1% BSA DPBS +. </li></ol> 4. Preparazione del reattivo substrato per la piastra Parallel flusso Sezione Adesione saggio <ol><li> Collegare due tratti separati di tubi per condotti di aspirazione e di mandata della camera di flusso a piatti paralleli che si inserisce all&#39;interno di un piatto di coltura tissutale da 35 mm. Un tubo si collega al serbatoio di cellule marcate sospese in 0,1% BSA DPBS + e l&#39;altro alla pompa siringa, che si ritirerà fluido ad una portata specificata. </li><li> Collegare una linea di vuoto nella camera di flusso 1. </li><li> Posizionare la camera di flusso sopra da 35 mm di coltura tissutalesh contenente un monostrato di cellule ovariche di criceto cinese che esprimono E-selectina (CHO-E). Cellule CHO-E sono state coltivate in terreno MEM completo a 37 ° C e 5,0% di CO 2 2. </li><li> Regolare la camera di flusso e / o guarnizione camera di flusso per garantire un&#39;adeguata tenuta di vuoto 1. </li><li> Ritirare liquido dal serbatoio, il monitoraggio del gruppo di camera di flusso per la corretta tenuta e nessuna prova visiva di formazione di bolle d&#39;aria 1. </li><li> Mettere assieme camera di flusso su microscopio (Leica DMI 6000B) 1. </li></ol> 5. Due colori Acquisizione Immagine <ol><li> Potenza di una sorgente di luce compatta Leica EL-6000, o un dispositivo simile, per generare luce ad alta intensità e di coppia in una guida di luce. Utilizzare un microscopio invertito a passare questa luce attraverso un filtro combinazione cubo, vale a dire G / R (verde / rosso) Filtro cubo, per eccitare fluorofori di colore desiderata / intensità. </li><li> Assicurarsi abitazioni dicroico è in posizione di lavoro corretta (depresso) enon è in modalità bypass. </li><li> Operare microscopio in modalità fluorescenza e seleziona il corretto cubo filtro a fluorescenza (verde / rosso). </li><li> Determinare il tempo di esposizione e guadagno in camera 1 (rossa; 620 ± 60 nm) e fotocamera da 2 (verde, 535 ± 40 nm). <ol><li> Premere il dicroici per ottenere immagini in entrambi i canali di emissione di rosso e verde. Utilizzare un saggio camera di flusso con cellule marcate con solo il fluoroforo rosso, e ottenere un&#39;immagine nel canale rosso regolando il tempo di esposizione della telecamera 1 in &quot;live&quot; impostazioni del software di imaging. </li><li> Far corrispondere il tempo di esposizione della fotocamera da 2 per il tempo di esposizione della fotocamera 1. Se un&#39;immagine è osservata nel canale verde, artefatti sanguinare-through sono presenti e tempo di esposizione in entrambe le telecamere deve essere ridotto. </li><li> Mantenere il tempo di esposizione equivalente a macchina 1 e 2 telecamera, ridurre il tempo di esposizione fino al manufatto sanguinare-through non è più visibile nel canale verde. Regolare il guadagno della telecamera 1 per migliorare l&#39;immagine visibility nel canale rosso se necessario. </li><li> Ripetere i punti 5.4.1 - 5.4.3 con cellule marcate solo con il fluorocromo verde, ma definire il tempo di esposizione con fotocamera da 2 a celle di immagine nel canale verde senza artefatti sanguinare-through nel canale rosso raccolti dalla macchina fotografica 1. </li><li> Anticorpi Retitrate se artefatti sanguinare-through non possono essere eliminati 11, o se i tempi di esposizione della fotocamera 1 e fotocamera da 2 sono sostanzialmente diverse tali che fuse le immagini possono essere temporalmente disallineati. </li></ol></li><li> Utilizzare software di imaging per visualizzare le immagini contemporaneamente catturate da due telecamere in bianco e nero CCD nell&#39;esperimento camera di flusso. </li><li> Unisci immagini raccolte da entrambe le telecamere utilizzando il modulo SimulPix di Streampix 5 o un pacchetto software alternativo. </li><li> Utilizzare adeguamenti correzione digitale in SimulPix o software alternativo per allineare spazialmente le immagini fuse, se necessario. Le immagini possono essere corretti con il modulo SimulPix per orizzontale, verticale, e gli adeguamenti rotazione. </li></ol>

<ol>
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M., Neelamegham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+complexes+formed+following+the+binding+of+anti-platelet+factor+4+(CXCL4)+antibodies+to+CXCL4+stimulate+human+neutrophil+activation+and+cell+adhesion.">Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion.</a> Blood. 112 (4), 1091-1100 (2008).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera ha la risoluzione spaziale, temporale e ottica necessarie a catturare immagini di alta qualità in applicazioni dove cella o movimento molecolare è rapido. Nel generare i risultati rappresentativi, parametri del sistema duale splitting emissione telecamera, incluse le impostazioni software e le impostazioni della fotocamera, sono stati ottimizzati per ottenere una sequenza immagine fusa in cui rotolamento e cellule aderenti sono spazialmente e temporalmente alli...

Metodi per l&#39;analisi di molecole sulla superficie cellulare, come immunostaining, impiegano sonde coniugate chimicamente per fluorofori, permettendo la rilevazione di molecole bersaglio. Cellule vive e saggi di adesione cellulare basati sul flusso idrodinamico sono tipicamente registrate con telecamere CCD monocromatico per catturare processi fisiologici a livello cellulare e / o molecolare 1, 2. Queste telecamere sono estremamente sensibili, consegnare frame rate veloci (superiori a 30 fotogrammi al secondo), e di fornire risoluzione temporale eccezionale (a causa di frame rate veloci e tempi di esposizione brevi). Tuttavia, le telecamere monocromatiche possono catturare solo un singolo canale di emissione (rilevare un singolo fluoroforo) per raccogliere immagini. Sistemi splitting emissione fotocamera singoli possono essere incorporati per catturare canali multipli emissione ma spesso riducono il campo visivo e richiedono lo stesso tempo di esposizione per l&#39;imaging tutti i canali. Per catturare lo spettro di colori da cellule marcate con multipLe fluorofori, una telecamera a colori può essere utilizzata come alternativa. Tuttavia, telecamere a colori non sono generalmente in grado di fornire la risoluzione temporale desiderato per l&#39;imaging cellulare dal vivo in alcune applicazioni. Un altro dispositivo di imaging è necessaria per applicazioni in cui è vantaggioso immagine cellule scena a più lunghezze d&#39;onda, pur mantenendo un&#39;elevata risoluzione temporale. Un&#39;applicazione sperimentale principale è la camera di flusso piastra di saggio adesione parallelo, in cui le cellule sono perfusi in condizioni fisiologicamente rilevanti sopra un substrato potenzialmente reattivi 1, 3. Le cellule in flusso che esprimono specifiche molecole della superficie cellulare possono aderire e rotolano sul substrato, come un monostrato di cellule che esprimono molecole di adesione o proteine ​​della matrice extracellulare-superficie adsorbito 4, 5. Celle di laminazione possono subire movimento di rotazione e traslazione in frazioni di secondo. Caratteristiche molecolari di rotolamento e cellule aderenti, ad esempio gruppi di molecole di superficie cellulare, hanno anche il potenziometroal di sottoporsi riorganizzazione attiva sulla superficie cellulare. Così, sistemi di imaging devono fornire una risoluzione temporale eccezionale (30 fotogrammi al secondo o superiore e &quot;vicino allo zero&quot; tempi di esposizione) per generare una sequenza di immagini che illustra la progressione passo-passo di cellula rotolamento 6, 7. Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera sono in grado di soddisfare queste esigenze di imaging di cellule marcate con più fluorofori. Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera divisi e canali del filtro di fluorescenza in due fotocamere simili per catturare simultaneamente due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo, pur mantenendo l&#39;intero campo visivo. Questa tecnologia consente il confronto diretto delle immagini catturate in tempo reale in ciascun canale e permette all&#39;utente di passare rapidamente tra i modelli di fotocamere con differenti capacità di imaging. Questa funzione è utile per effettuare regolazioni alle impostazioni di cattura immagine in una macchina fotografica che meglio consentono al sistema di catturarefluorofori con diverse intensità, durata e coefficienti di estinzione 8. Accoppiato con software di imaging, sistemi splitting emissione telecamere doppi permettono la registrazione in tempo reale di saggi imaging delle cellule vive a lunghezze d&#39;onda multiple e possono aumentare saggi in vitro che utilizzano fluorescenza per studiare il comportamento cellulare.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent/Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BT-20 cells</td>
 <td>ATCC</td>
 <td>HTB-19</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHO-E cells</td>
 <td>Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MEM </td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30024.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FBS</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH30396.03</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-streptomycin</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SV30031.01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>SH30028.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPBS+</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>14080-055</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BSA</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HECA-452 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555946</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-human CD24 monoclonal antibody</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>555426</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A21212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A11004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td>
 <td>Q Imaging</td>
 <td>RET-EXi-F-M-12-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC2 Emission Splitter</td>
 <td>Photometrics</td>
 <td>DC2 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td> DMI6000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streampix 5 software</td>
 <td>Norpix</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneously capturing real-time images in two emission channels using a dual camera emission splitting system: applications to cell adhesion

Multicolore immunofluorescenza microscopia per rilevare specifiche molecole nella membrana cellulare può essere accoppiato con saggi camera di flusso piastra paralleli a studiare i meccanismi che regolano l&#39;adesione cellulare in condizioni di flusso dinamico. Per esempio, le cellule tumorali marcate con fluorofori multipli possono essere perfusi sopra un substrato potenzialmente reattivi per modellare meccanismi di metastasi del cancro. Tuttavia, i sistemi un&#39;unica telecamera multi-canale e videocamere a colori presentano carenze in acquisizione delle immagini per analisi in tempo reale delle cellule vive. Per superare queste limitazioni, abbiamo utilizzato un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera per catturare simultaneamente in tempo reale sequenze di immagini di cellule fluorescente nella camera di flusso. Lunghezza d&#39;onda del filtro sistemi di scissione delle emissioni doppia fotocamera definito spazia in due fotocamere CCD monocromatiche, così contemporaneamente catturare due immagini identiche ma spazialmente specifico fluoroforo. Successivamente, psuedocolored immagini una canali sono combinati in un unicoin tempo reale fusa sequenza che può rivelare più molecole bersaglio sulle cellule muoversi rapidamente in una regione di interesse.

Una camera di flusso piatto saggi di adesione parallelo è stato utilizzato per dimostrare un sistema di splitting delle emissioni doppia fotocamera che, contemporaneamente catturato sequenze di immagini in tempo reale in due canali di emissione (Figura 1). Il sistema di splittaggio emissione fotocamera dual rilevato BT-20 cellule che sono state fluorescente con anti-CD24 umano e HECA-452 (rilevamento di antigeni sialofucosylated) anticorpi monoclonali e anticorpi secondari appropriati (Figura 2...

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Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera per due colori microscopia a fluorescenza generano in tempo reale sequenze di immagini con risoluzione ottica e temporale eccezionale, un requisito di alcuni saggi cellulari in tempo reale tra cui saggi di adesione cella di flusso piastra paralleli. Quando il software viene utilizzato per unire le immagini provenienti dai canali di emissione acquistati contemporaneamente, sequenze di immagini pseudocolored sono prodotti.

Contemporaneamente Catturare immagini in tempo reale in due canali di emissione Utilizzando un Splitting sistema Dual Camera Emissione: Applications to Cell Adhesion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

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JoVE Journal

Bioengineering

9.5K Views.  Ohio University.  Sistemi di suddivisione delle emissioni doppia fotocamera per due colori microscopia a fluorescenza generano in tempo reale sequenze di immagini con risoluzione ottica e temporale eccezionale, un requisito di alcuni saggi cellulari in tempo reale tra cui saggi di adesione cella di flusso piastra paralleli. Quando il software viene utilizzato per unire le immagini provenienti dai canali di emissione acquistati contemporaneamente, sequenze di immagini pseudocolored sono pr...

Video: Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Una piattaforma Novel Stretching per applicazioni in cellule e tessuti mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. Biosensors relying on the principle of FRET have enabled real-time visualization of subcellular signaling events in live cells with high temporal and spatial resolution. Here, we describe the application of a genetically encoded Bile Acid Sensor (BAS) that consists of two fluorophores fused to the farnesoid X receptor ligand binding domain (FXR-LBD), thereby forming a bile acid sensor that can be activated by a large number of bile acids species and other (synthetic) FXR ligands. This sensor can be targeted to different cellular compartments including the nucleus (NucleoBAS) and cytosol (CytoBAS) to measure bile acid concentrations locally. It allows rapid and simple quantitation of cellular bile acid influx, efflux and subcellular distribution of endogenous bile acids without the need for labeling with fluorescent tags or radionuclei. Furthermore, the BAS FRET sensors can be useful for monitoring FXR ligand binding. Finally, we show that this FRET biosensor can be combined with imaging of other spectrally distinct fluorophores. This allows for combined analysis of intracellular bile acid dynamics and i) localization and/or abundance of proteins of interest, or ii) intracellular signaling in a single cell.

We provide a detailed protocol to study bile acid dynamics in living cells using a genetically encoded BAS FRET sensor. This Bile Acid Sensor represents a unique tool to study (regulation of) bile acid transport and FXR activation in a wide range of cell types.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

Hand-held Clinical Photoacoustic Imaging System for Real-time Non-invasive Small Animal Imaging

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, we report a combined photoacoustic and clinical ultrasound imaging system by integrating an ultrasound probe with light delivery for small animal imaging. We demonstrate this by showing sentinel lymph node imaging in small animals along with minimally invasive real-time needle guidance. A clinical ultrasound platform with access to raw channel data allows the integration of photoacoustic imaging leading to a handheld real-time clinical photoacoustic imaging system. Methylene blue was used for sentinel lymph node imaging at 675 nm wavelength. Additionally, needle guidance with dual modal ultrasound and photoacoustic imaging was shown using the imaging system. Depth imaging of up to 1.5 cm was demonstrated with a 10 Hz laser at a photoacoustic imaging frame rate of 5 frames per second.

A clinical handheld photoacoustic imaging system will be demonstrated for real-time non-invasive small animal imaging.

Mano clinico fotoacustico sistema di Imaging per Imaging animale piccolo Non-invasivo in tempo reale

Translation of photoacoustic imaging into the clinic is a major challenge. Handheld real-time clinical photoacoustic imaging systems are very rare. Here, ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Microscopia per la determinazione in tempo reale della morfologia a singola cellula nei bioprocessi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). Electrochemically reduced graphene oxide acts as the conducting layer and polyaniline acts as a pH-sensitive layer. The pH-dependent conductivity of polyaniline occurs by doping of holes during protonation and by the dedoping of holes during deprotonation. We found that an ERGO-PA solid-state electrode was not functional as such in fermentation processes. The electrochemically active species that the bacteria produce during the fermentation process interfere with the electrode response. We successfully applied Nafion as a proton-conducting layer over ERGO-PA. The Nafion-coated electrodes (ERGO-PA-NA) show a good sensitivity of 1.71 &#937;/pH (pH 4 - 9) for chemiresistive sensor measurements. We tested the ERGO-PA-NA electrode in real-time in the fermentation of Lactococcus lactis. During the growth of L. lactis, the pH of the medium changed from pH 7.2 to pH 4.8 and the resistance of the ERGO-PA-NA solid-state electrode changed from 294.5 &#937; to 288.6 &#937; (5.9 &#937; per 2.4 pH unit). The pH response of the ERGO-PA-NA electrode compared with the response of a conventional glass-based pH electrode shows that reference-less solid-state microsensor arrays operate successfully in a microbiological fermentation.

Here, we report the protocol for the fabrication of a Nafion-coated, polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide chemiresistive micro pH sensor. This chemiresistor-based, solid-state micro pH sensor can detect pH changes in real-time during a Lactococcus lactis fermentation process.

Produzione di Nafion rivestite, ridotto grafene ossido/Polyaniline Chemiresistive sensore al pH Monitor in Real-Time durante la fermentazione microbica

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...