Questo protocollo utilizza CAR-T umane e cellule tumorali e dimostra accuratamente le tossicità associate alla somministrazione di CART19. Pertanto, ricapitolando ciò che è stato osservato nella clinica. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa piattaforma è che fornisce un modello traducibile e clinicamente rilevante in cui vengono utilizzate cellule T umane e cellule tumorali.
Questo modello non solo consente una valutazione efficiente delle tossicità associate a CART19, ma ci consente anche di capire meglio come possiamo superare queste tossicità attraverso migliori strategie di trattamento. Per iniziare, monitorare i topi somministrati a CART19 due volte al giorno per valutare eventuali cambiamenti nel loro benessere, come debolezza motoria, corpo curvo e perdita di peso corporeo. Una volta che i topi sviluppano debolezza motoria e riduzione del peso, raccogliere il loro sangue periferico per analizzare il carico tumorale.
E condurre l'isolamento del siero per le citochine, come descritto nel manoscritto. Dopo l'isolamento, conservare le provette di microcentrifuga sierica a 80 gradi Celsius e utilizzare il cera per analizzare le chemochine e le citochine utilizzando il test multiplex. Per l'imaging MRI, mescolare 120 microlitri di gadolinio con 880 microlitri di soluzione salina e caricare in una siringa da insulina da un millilitro.
Iniettare 100 microlitri della soluzione preparata per via intraperitoneale in ciascun topo. Anestetizzare il mouse e posizionarlo sulla sonda della culla compatibile con il roditore. Quindi agganciare i denti alla barra del morso.
Tirare la testa del mouse nella bobina del volume di 25 millimetri e regolare il cono del naso legato al sistema di anestesia isoflurano. Stringere la manopola della barra del morso per mantenere la posizione per tutta la durata della scansione. Per la valutazione della respirazione, collegare la sonda di un dispositivo di monitoraggio della respirazione vicino al diaframma e fissarla con nastro chirurgico.
Mantieni la frequenza respiratoria tra 20 e 60 respiri al minuto in modo che le condizioni dei topi rimangano stabili. Inserire la sonda animale nel foro piccolo all'interno del sistema MRI per piccoli animali a foro verticale e regolare la testa dell'animale al centro della bobina. Utilizzando la serratura, fissare l'apparecchio in posizione verticale e collegare lo strumento al computer.
Quindi, apri il software ParaVision per impostare le posizioni di scansione e i tipi di scansioni. Determinare le posizioni sagittali e assiali ottimali mantenendoli coerenti per tutti i gruppi sperimentali. Per raccogliere i dati MRI pesati in T1, utilizzare una sequenza multi-slice pesata T1 e multi-eco con un tempo di ripetizione di 300 millisecondi, un tempo di eco di 9,5 millisecondi, un campo visivo di 4,00 X 2,00 X 2,00 centimetri e una matrice di 192 X 96 X 96.
Per le immagini MRI pesate in T2, utilizzare una sequenza multi-fetta e multi-eco con parametri simili. Una volta completate le scansioni, rimuovere la sonda dal foro ed estrarre delicatamente il mouse rimuovendo i denti dalla barra del morso. Dopo aver estratto i dati dal software, utilizzare il software di analisi per la quantificazione e il rendering del volume 3D delle regioni di iperintensità CD19 + popolazioni di cellule tumorali sono state confrontate tra topi trattati con CART19 e topi non trattati utilizzando la citometria a flusso.
Una significativa riduzione del peso è stata osservata nei topi trattati con cellule CART19. La perdita di peso è considerata un sintomo della comparsa di CRS, che è correlata alle tossicità associate alle cellule CART. Un test multiplex ha rivelato l'espressione di citochine e chemochine nel siero dei topi NSG prima e dopo la somministrazione di CART19.
Le immagini pesate con T2 hanno rivelato prove di edema e possibile infiltrato infiammatorio durante la neuroinfiammazione nei topi trattati con CART19. Mentre la risonanza magnetica pesata in T1 ha mostrato un miglioramento del contrasto all'interno del parenchima cerebrale, indicando un aumento della permeabilità vascolare. Le ricostruzioni tridimensionali del cervello dei roditori sono state assemblate sulla base di regioni di iperintensità T1 corrispondenti alla permeabilità vascolare, che rende il volume di perdita di gadolinio nel cervello.
È importante ricordare che il monitoraggio fisico giornaliero dei topi dopo la somministrazione di CART19, insieme al sanguinamento periferico, sarà il miglior indicatore per procedere con la risonanza magnetica per valutare completamente eventuali cambiamenti nel cervello indicativi di CRS o neurotossicità. Questa tecnologia è ampiamente applicabile ad ulteriori terapie con cellule CAR-T e consentirà agli scienziati di testare in modo efficiente le potenziali tossicità derivanti da nuove cellule CAR-T. Questo modello proposto è un trampolino di lancio per comprendere come le tossicità associate alle cellule CAR-T possono essere monitorate, trattate e utilizzate per convalidare nuovi modelli di cellule CAR-T.
