Questo protocollo consente di visualizzare gli embrioni di topo mentre si sviluppano. Ciò consente di studiare la cardiogenesi precoce in dettaglio. Come scattare immagini fisse di embrioni falsi, l'imaging dal vivo dà pieno accesso al processo dinamico di studio nello sviluppo embrionale.
Le competenze richieste per l'imaging della vita sono difficili da comprendere dalla pubblicazione di solo testo. Guardare un'altra persona che lo fa è essenziale per imparare. Per iniziare, tagliare pezzi di filo di tungsteno lunghi un centimetro e affilarli da 0,02 a 0,05 millimetri di diametro immergendo la punta del filo in una soluzione satura di nitrato di sodio.
Per preparare i capillari di vetro a gomito, posizionare il punto medio di un capillare di vetro standard di un millimetro su un accendino bunsen per tre-sei secondi, tirando lentamente da entrambe le estremità fino a quando il capillare diventa sottile e flessibile. Quindi, rompere il capillare a metà e riscaldarlo brevemente per produrre una curva di 90 gradi a due centimetri dalla punta. Ho visto un pezzo di polimetilmetacrilato che misura circa sette millimetri di lunghezza, quattro millimetri di larghezza e due millimetri di spessore.
Tenere il pezzo di metacrilato usando una morsa da banco, quindi praticare fori personalizzati trasversalmente attraverso l'intero pezzo. Ruotare lentamente il trapano applicando una pressione bassa ma costante. Utilizzare una lima fine per smussare il bordo del supporto e regolarne le dimensioni.
Inoltre, creare una leggera pendenza sui bordi del supporto per facilitare il posizionamento dell'embrione. Posizionare il supporto finito in un piatto con acqua distillata per risciacquarlo. Sotto il microscopio stereo, controllare il supporto per vedere se i fori contengono polvere di perforazione.
Se è presente polvere, utilizzare aghi di tungsteno per rimuoverlo. Per sterilizzare il supporto, posizionarlo in un tubo conico pieno di acqua distillata e sonicare per 20 minuti con una potenza minima di 20 watt. Estrarre l'utero da un giorno embrionale eutanasia 6,75 a 7,5 topo gravido e metterlo su una salvietta di carta asciutta e pulita.
Quindi, tagliare l'utero, inserendo la punta delle forbici sottili dal lato mesometriale e facendo scorrere la lama per esporre i decidui e trasferirli sul mezzo di dissezione. Sezionare gli embrioni, mantenendo intatto il cono ectoplacentare. Quindi, staccare la membrana del Reichter, lasciandone parte sulla regione embrionale extra.
Per mantenere caldo il mezzo di dissezione, sostituirlo ogni 10 minuti. Inoltre, sezionare decidui in gruppi di tre o quattro mantenendo il resto in un mezzo di dissezione posto in bagno a 37 gradi Celsius. Posizionare immediatamente gli embrioni sezionati in un terreno di coltura.
Selezionare gli embrioni con le caratteristiche di fluorescenza desiderate utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza e posizionarli nella provetta contenente il terreno di coltura nell'incubatore di coltura cellulare per recuperare per due ore prima dell'imaging. Dopo aver acceso tutti i componenti del microscopio, inclusi computer, software e laser, accendere il controller di anidride carbonica e impostarlo al 7%Posizionare una goccia di grasso siliconico ad alto vuoto su un piatto da 35 millimetri con un fondo di rivestimento in vetro. Posizionare il supporto sopra la goccia e premere delicatamente per immobilizzarlo.
Per il montaggio degli embrioni, trasferire da due a tre embrioni dall'incubatrice al piatto con un supporto. Usando un paio di pinze e un ago di tungsteno affusolato, impostare gli embrioni nei fori. Utilizzare l'ago per agganciare l'embrione dal cono ectoplacentare e inserirlo in un foro di dimensioni corrispondenti.
Spostare con cautela il piatto contenente gli embrioni e il supporto sulla piastra del microscopio. Abbassare l'obiettivo fino a formare un menisco liquido all'interfaccia dell'obiettivo medio. Dopo aver messo a fuoco l'embrione, montare la camera di incubazione e sigillarla attorno all'obiettivo usando del nastro adesivo.
Utilizzando un'acquisizione dal vivo nel software di controllo del microscopio, regolare l'uscita laser e i livelli di guadagno. Quindi, coprire il mezzo con olio di paraffina gocciolando lentamente sull'obiettivo. Imposta una registrazione time-lapse.
Imposta un intervallo da cinque a 10 minuti con uno spazio Z da tre a cinque micron tra le pile. Lascia uno spazio vuoto sopra lo Z-Stack per anticipare la crescita dell'embrione. Un minimo di 50 micron, aggiungendo 30 micron per ogni ora in cui l'acquisizione non sarà supervisionata.
Abilitare l'opzione di salvataggio automatico per consentire la supervisione dell'acquisizione da un computer per consentire la regolazione delle dimensioni dello Z-Stack, se necessario, per adattarsi all'area di interesse all'interno del fuoco. Viene mostrato lo sviluppo del cuore dell'embrione di tutto il corpo vivo mediante imaging multifotonico. Al giorno embrionale 7.5, la fluorescenza venosa è presente in tutto l'ectoderma neurale, con alcuni nuclei positivi nel mesoderma splancnico ed extra embrionale.
Dopo quattro ore, i progenitori endoteliali attivano le vene e si assemblano per formare il tubo endocardico e le aorte sottostanti, che diventano strutture chiuse dopo sette ore. Fare attenzione durante la rimozione della membrana del Reichter. Può essere davvero attaccato all'embrione, specialmente nelle fasi di prevacillazione.
Durante la rimozione, prova a pizzicare la membrana dalla regione extra embrionale.
