Vorremmo ringraziare il laboratorio di A. Hadjantonakis (Sloan-Kettering Institute) e il laboratorio di L. Niswander (U of Colorado at Denver) per un parere utile con le tecniche di dissezione e la cultura. Questo lavoro è stato sostenuto da NRSA NS059562 a JDG e RO1NS05897 di MER, in collaborazione con L. e J. Niswander Nadeau (Institute for Systems Biology).

1. Preparazione di terreni di coltura - tutti i reagenti sono elencati nella tabella 1 <ol><li> Scongelare siero ratto maschio a 37 ° C. </li><li> Calore Disattiva siero di ratto per 30 minuti a 55 ° C </li><li> Centrifugare siero ratto a 10K per 5 minuti a temperatura ambiente </li><li> Rimuovere il surnatante 50:50 e mescolare con fenolo-rosso senza DMEM w / glucosio </li><li> Sterilizzare i media usando un filtro da 0,45 um siringa </li><li> Almeno 1 ml di media / embrione deve essere preparato </li></ol> 2. Isolamento dell&#39;utero dalla diga incinta <ol><li> Utilizzando le procedure approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC), la diga incinta viene prima anestetizzato e poi sacrificati per dislocazione cervicale </li><li> Sterilizzare l&#39;addome con il 70% EtOH </li><li> Pinch un piccolo sentiero di pelle lungo la linea mediana, appena sopra la linea capezzolo, con una pinza grande e aperto l&#39;addome sotto il tuo pinze con le forbici di grandi dimensioni. Fare attenzione a non danneggiare le strutture internes </li><li> Usa la tua forbici per tagliare lateralmente dalla apertura iniziale verso entrambi i lati del mouse in modo che l&#39;intero addome è aperto </li><li> Intestini e cuscinetti di grasso in eccesso possono spesso oscurare l&#39;utero e questi dovrebbero essere spostati da parte in modo che la parte superiore dell&#39;utero e delle ovaie può essere osservato da ogni lato </li><li> Pizzicare la parte superiore dell&#39;utero sotto le ovaie e utilizzare le forbici per separare l&#39;utero dal grasso, il taglio da un capo dell &#39;utero all&#39;ovaio altri </li><li> Estrarre l&#39;utero con il forcipe e posto in una capsula di Petri con soluzione salina </li></ol> 3. Rimozione di embrioni dall&#39;utero <ol><li> Risciacquare l&#39;utero con soluzione fisiologica per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare il grasso in eccesso dall&#39;esterno </li><li> Trasferire su un piatto pulito, con temperatura ambiente. Tyrodes salina per migliorare la visualizzazione </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, separare ogni embrione utilizzando piccole forbici o, se necessario, sottile (# 5) pinze a cura sbucciare l&#39;utero a parte. </li> &lt;li&gt; Inserire una pinza sottile nello spazio tra la parete uterina e la decidua e staccare la parete uterina, facendo attenzione a non forare l&#39;embrione </li></ol> 4. Rimozione di decidua da embrioni <ol><li> Orientare la decidua modo che la parte più scura (placenta) è rivolto verso di voi </li><li> Fare un&#39;incisione con il forcipe, lungo la linea che separa la parte oscura della decidua dalla parte più leggera, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità </li><li> Completa la separazione della placenta dalla parte superiore del sacco vitellino, facendo attenzione a non strappare la ectoplacental cono (EPC). A questo punto dovreste essere in grado di visualizzare la membrana REICHERTS sul sacco vitellino </li><li> Continuare a rimuovere l&#39;intero decidua (più leggero porzione) facendo attenzione a non forare il sacco vitellino </li><li> Premere leggermente e rimuovere il REICHERTS da peeling lontano dalla EPC. Se l&#39;EPC è danneggiato o separato dal sacco vitellino, gli embrioni non riuscirà a girare normalmente da E8.5-E9.5 </li><li&gt; Con il REICHERTS rimosso l&#39;embrione deve essere facilmente visibile attraverso il sacco vitellino e può essere messo in scena da somities conteggio. </li></ol> 5. Configurazione del sistema cultura <ol><li> Tagliare l&#39;estremità di una pipetta di trasferimento di plastica con le forbici per aumentare il diametro dell&#39;apertura in modo che un embrione può essere pipettati senza danneggiare il sacco vitellino </li><li> Riempimento di bottiglie rullo pulito con 1 ml di supporti per embrione. A seconda del tipo di bottiglie a rulli utilizzati un massimo di 3-6 embrioni possono essere caricati in ogni bottiglia. </li><li> Trasferire gli embrioni usando il tuo pipetta taglio ai media pieni di bottiglie rullo, riporto quanto Tyrodes meno possibile per non diluire i media </li><li> Fissare il tappo di gomma (tappo) per la parte superiore della bottiglia di vetro rullo </li><li> Inserire il rullo di bottiglie nel tamburo cultura rullo in modo che una tenuta stagna è formata tra la spina e il tamburo </li><li> Una volta che tutte le bottiglie sono stati attaccati, e qualsiasi slot vuoti nel tamburo sono stati sigillati wtappi in gomma esima, attivare il rullo </li><li> Aperto di CO 2 e O 2 serbatoi e regolare a circa 2 bar, in modo che la valvola di scarico sta rilasciando una bolla al secondo. Per E8.5-E10 embrioni, il 20% O 2 e il 5% di CO 2 dovrebbe essere usato. </li><li> Assicurarsi che l&#39;incubatore è impostato a 37 ° C e coprire o chiudere l&#39;incubatore in modo che gli embrioni siano al riparo dalla luce. </li><li> Gli embrioni devono essere controllati periodicamente per valutare il loro sviluppo con l&#39;aggiunta di somities, la progressione della svolta, e l&#39;estensione della chiusura del tubo neurale </li><li> Dopo 2-3 ore di cultura, gli inibitori farmacologici o altri trattamenti possono essere aggiunti ai media </li><li> Il disegno dello studio dovrebbe comprendere i controlli, come veicolo o analoghi inattivi di reagente studio. </li></ol> 6. Valutare lo sviluppo dopo la coltura degli embrioni intero <ol><li> Spegnere il gas, arresto a rullo e rimuovere bottiglie da incubatore </li><li> Embrioni trasferimento a Tyrodes o PBS in una capsula di Petri per la valutazione sotto stereomicroscopio </li><li> Il sacco vitellino dovrebbe apparire simili a palloncini, un battito cardiaco dovrebbe essere visibile e la frequenza cardiaca deve essere&gt; 120 battiti al minuto, e la circolazione dovrebbe essere evidente </li><li> Embrioni fotografia prima della rimozione sacco vitellino, se necessario, </li><li> Rimuovere sacco vitellino da embrione, tagliando un foro vicino l&#39;EPC e lanciando il sacco vitellino e amnios sopra la testa e groppa dell&#39;embrione. </li><li> Il cordone ombelicale può essere tagliato per separare il sacco vitellino dall&#39;embrione, e il sacco vitellino può essere utilizzata per la genotipizzazione l&#39;embrione, se necessario. </li><li> Esaminate l&#39;embrione per numero somite e difetti del tubo neurale, come pieghe del cranio aperto, chiusura incompleta del viso e / o un neuropore aperto caudale. Gli embrioni possono essere allestita secondo la classificazione Theiler di cambiamenti morfogenetici multiple ( <a href="http://genex.hgu.mrc.ac.uk/Databases/Anatomy/MAstaging.html">http://www.emouseatlas.org/ Emap / home.html</a> ) Ancora una volta, un archivio fotografico disviluppo embrionale è utile. </li></ol> 7. Note <ol><li> Una dissezione di alta qualità è essenziale, perché ogni nick o lacrime nel sacco vitellino impedirà di svolta e di successo inibire il normale sviluppo. L&#39;EPC possono essere danneggiati durante la rimozione della membrana di Reichert (RM), e se l&#39;EPC è anche parzialmente separato dal sacco vitellino, gli embrioni non si sviluppano normalmente. Tuttavia, la rimozione incompleta della RM può causare embrioni per stare insieme e / o RM possono invadere le cellule in coltura e restringono l&#39;espansione sacco vitellino, entrambi che impedirebbe il normale sviluppo. </li><li> Pinze pulite e nitide sono il segreto per ottenere una dissezione bene, perché forcipe opaco o piegato rendere la procedura molto più difficile. Depositi di proteine ​​su strumenti porterà a danni ai tessuti. </li><li> Pulito, bottiglie di vetro sterile sono essenziali anche per evitare che gli embrioni di attaccarsi alla parete laterale e di essere danneggiati. Prima di iniziare l&#39;esperimento, le bottiglie devono essere scrubbed con acqua e sapone, risciacquati in dH 2 O, microonde e con una piccola quantità di acqua in ogni bottiglia fino a quando l&#39;acqua bolle. Bottiglie vengono poi risciacquati con il 70% EtOH e lasciato asciugare all&#39;aria. </li><li> Lavorare il più velocemente possibile, perché la prima l&#39;embrione può essere trasferito ai media cultura e riscaldato di nuovo a 37 ° C la sopravvivenza migliore. </li><li> Dissezione completa l&#39;intera cucciolata prima di trasferire tutti gli embrioni alle bottiglie rullo in modo che ogni embrione è a temperatura ambiente per la stessa quantità di tempo per evitare di creare qualsiasi discrepanza nella crescita dell&#39;embrione </li><li> Mantenere un ambiente sterile, per evitare la contaminazione batterica delle culture. I nostri esperimenti cultura sono stati effettuati senza antibiotici, ma molti laboratori aggiungere antibiotici alla loro mezzi di comunicazione per prevenire la crescita batterica. Il mezzo dovrebbe apparire più chiaro alla fine dell&#39;esperimento come era all&#39;inizio dell&#39;esperimento. Se il supporto è diventato nuvoloso o c&#39;è un precipitato visibile, è probabile una truffacontaminazione che ha infettato la vostra cultura. </li><li> Lo scambio di gas inefficaci può anche ritardare lo sviluppo degli embrioni, in modo da essere sicuri di avere un regolatore affidabile che garantisce la consegna continua. </li><li> Gli embrioni si sviluppano circa il 50% più lento nella cultura ex vivo, quindi è indispensabile contare somiti per assicurarsi di aver raggiunto l&#39;adeguato livello di sviluppo per il completamento della sperimentazione. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: La comparsa degli embrioni pre-e post-roller cultura è illustrato nella figura 1. Al momento della dissezione, degli embrioni dovrebbe essere in una configurazione intentato (Fig. 1 A, D), dove la coda si trova dietro le pieghe testa. Dopo 36 ore di cultura, gli embrioni devono aver completato girando in modo che siano in C-curva, posizione fetale, in cui la coda è di fronte al capo (Fig. 1B, C, E, F). Manipolazione farmacologica con RhoA inibitore della chinasi (Y-27632), un noto inibitore di estensione convergente duranteneurulazione (Ybot-Gonzalez, 2007), si traduce in un accorciamento degli embrioni lungo il loro asse rostro-caudale (Fig. 1E, F) e inibisce la chiusura del cranio neurale volte. I nostri dati mostrano che dosi crescenti di Y-27632 compromette progressivamente cranica chiusura volte (Figura 2A) e riduce l&#39;asse del corpo (Fig. 2B), in coerenza con il ruolo di valle RhoA segnalazione in neurulazione cranico ed estensione convergente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig1.jpg" /> Figura 1. Aspetto di embrioni culture e di manipolazione con l&#39;inibitore farmacologico Y-27632. (A, D) embrioni Dissected a E8.5 prima della coltura degli embrioni interi (B, E) Gli embrioni in E10 con il sacco vitellino ancora intatto, a seguito 36hrs della cultura rullo. (C, F) Il sacco vitellino è stato rimosso per illustrare il successo di svolta e la chiusura del tubo neurale. Embrioni che sono stati trattati con l&#39;inibitore della chinasi Rho Y-27632 (E, F) non è riuscito a sottoporsi corretta estensione convergente e illustrareun asse del corpo ridotto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3132/3132fig2.jpg" /> Figura 2. Effetto inibitore della chinasi RhoA sul cranio di chiusura del tubo neurale e di allungamento dell&#39;asse. (A) La percentuale di embrioni che sono stati in grado di chiudere con successo la loro pieghe cranica (NTC% = percentuale di chiusura del tubo neurale) viene confrontato con la dose di Y-27632 aggiunto al mezzo di coltura. (B) La distanza tra vescicola otica e arti anteriori è stato notevolmente ridotto a dosi crescenti di Y-27632 (p &lt;.05).

<ol>
	<li>Cockroft, D. L., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+culture+of+post+implantation+embryos.">Dissection and culture of post implantation embryos.</a> Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. , (1990).</li><li>Gray, J. D., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+folate+supplementation+from+Crooked+tail+and+other+NTD-prone+mutant+mice.">Mechanistic insights into folate supplementation from Crooked tail and other NTD-prone mutant mice.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 85, 314-321 (2009).</li><li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Atlas of Mouse Development. , (1992).</li><li>Ybot-Gonzalez, P., Savery, D., Gerrelli, D., Signore, M., Mitchell, C. E., Faux, C. H., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension,+planar-cell-polarity+signalling+and+initiation+of+mouse+neural+tube+closure.">Convergent extension, planar-cell-polarity signalling and initiation of mouse neural tube closure.</a> Development. 134, 789-799 (2007).</li><li>Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interactions,+folate+metabolism+and+the+embryonic+nervous+system.">Gene-environment interactions, folate metabolism and the embryonic nervous system.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2, 471-480 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La possibilità di separare materno, i fattori intrauterina da quelli che sono intrinseci all&#39;embrione durante il suo sviluppo è uno strumento importante per studiare tutte le fasi della embriogenesi. Qui abbiamo analizzato gli effetti di un inibitore della chinasi piccola molecola RhoA in utero cranica ex neurulazione, eliminando così la variabile del metabolismo materno del farmaco. Questa manipolazione farmacologica ha un profondo effetto sulla neurulazione cranica ed estensione convergente. Sensibilità a questo composto può essere confrontato fra i differenti mutanti di topo genetica. Il metodo qui presentato può essere applicato anche agli studi di altre vie molecolari in fase di sviluppo, permettendo la manipolazione diretta della funzione cellulare in embrioni usando una varietà di reagenti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Stereomicroscopio per dissezione </td><td> Leica </td><td> M165 </td><td></td></tr><tr><td> Incubatore di precisione </td><td> BTC Ingegneria (UK) </td><td> BTC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Rotazione Bottiglia dell&#39;Unità Cultura </td><td> BTC </td><td> BTC 003 </td><td></td></tr><tr><td> Bottiglie di vetro per rotante Unità </td><td> BTC </td><td> BTC 005 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Bung </td><td> BTC </td><td> BTC 007 </td><td></td></tr><tr><td> Silicone Rubber Cork </td><td> BTC </td><td> BTC 008 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler ingresso </td><td> BTC </td><td> BTC 012 </td><td></td></tr><tr><td> Bubbler gas in ingresso trappola </td><td> BTC </td><td> BTC 013 </td><td></td></tr><tr><td> Gas Bubbler uscita </td><td> BTC </td><td> BTC 014 </td><td></td></tr><tr><td> Bombola di gas </td><td> TechAir </td><td></td><td> 20% di O 2, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Regolatore del gas </td><td> TechAir </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rat Serum maschio </td><td> Harlan Labs </td><td> 4520 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM w / o rosso fenolo </td><td> Invitrogen </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro siringa </td><td> Nalgene </td><td> 190-2545 </td><td></td></tr><tr><td> Grande Forbici dissezione (Blunt punta) </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td><td></td></tr><tr><td> Extra Fine Bonn Forbici </td><td> Belle Strumenti Scientifici (FST) </td><td> 14084-08 </td><td></td></tr><tr><td&gt; Dumot # 5 pinze </td><td> FST </td><td> 11252-50 </td><td></td></tr><tr><td> Tyrode di Saline </td><td></td><td></td><td> Come descritto in Cockroft 1990 </td></tr><tr><td> Piatto 10 centimetri Petri monouso </td><td> BD </td><td> 351029 </td><td></td></tr></tbody></table>

neural tube closure in mouse whole embryo culture

Modelli murini genetiche sono uno strumento importante per lo studio dei mammiferi chiusura del tubo neurale (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010). Tuttavia, lo studio di embrioni di topo in utero è limitata dalla nostra incapacità di farmacologicamente direttamente manipolare gli embrioni in modo isolato dagli effetti del metabolismo materno sul reagente di interesse. Sia che si utilizzi una piccola molecola, proteine ​​ricombinanti, o siRNA, la consegna di queste sostanze alla madre, attraverso la dieta o per iniezione saranno oggetto questi composti instabili ad una varietà di difese corporee che potrebbero impedire loro di raggiungere l&#39;embrione. Studi effettuati su colture di embrioni intero può essere usato per separare materna da intrinseca effetti sullo sviluppo fetale. Qui vi presentiamo un metodo per la coltura embrioni di topo usando sostanze altamente arricchito in un apparecchio rotante incubatore che consente di normale chiusura del tubo neurale dopo la dissezione (Crockett, 1990). Una volta in coltura, gli embrioni possonoessere manipolato con tradizionali tecniche in vitro, che altrimenti non sarebbero possibili se gli embrioni erano ancora in utero. Fratelli embrione può essere raccolte in vari momenti per studiare diversi aspetti del neurulazione, che si verificano da E7-7.5 (formazione di placca neurale, appena prima l&#39;inizio della neurulazione) per E9.5-10 (al termine del cranio neuropore piega e caudale chiusura, Kaufman, 1992). In questo protocollo, dimostriamo il nostro metodo per sezionare embrioni a timepoints che sono ottimali per lo studio del neurulazione cranica. Embrioni saranno sezionati a E8.5 (circa 10-12 somities), dopo l&#39;inizio della chiusura del tubo neurale, ma prima di accendere embrione e la chiusura del cranio neurale piega, e mantenute in coltura fino a E10 (26-28 somities), quando cranico neurulazione dovrebbe essere completa.

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Neural Tube Closure in Mouse Whole Embryo Culture

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Genetic mouse models are an important tool in the study of mammalian neural tube closure (Gray &amp; Ross, 2009; Ross, 2010).  However, the study of mouse ...

neural-tube-closure-in-mouse-whole-embryo-culture

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

21.4K Views.  Weill Cornell Medical College. Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Combining Behavioral Endocrinology and Experimental Economics: Testosterone and Social Decision Making

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in rodents have shown a direct link between testosterone and aggressive behavior1 and folk wisdom adapts these findings to humans, suggesting that testosterone induces antisocial, egoistic or even aggressive behavior2. However, many researchers doubt a direct testosterone-aggression link in humans, arguing instead that testosterone is primarily involved in status-related behavior3,4. As a high status can also be achieved by aggressive and antisocial means it can be difficult to distinguish between anti-social and status seeking behavior.
We therefore set up an experimental environment, in which status can only be achieved by prosocial means. In a double-blind and placebo-controlled experiment, we administered a single sublingual dose of 0.5 mg of testosterone (with a hydroxypropyl-&beta;-cyclodextrin carrier) to 121 women and investigated their social interaction behavior in an economic bargaining paradigm. Real monetary incentives are at stake in this paradigm; every player A receives a certain amount of money and has to make an offer to another player B on how to share the money. If B accepts, she gets what was offered and player A keeps the rest. If B refuses the offer, nobody gets anything. A status seeking player A is expected to avoid being rejected by behaving in a prosocial way, i.e. by making higher offers.
The results show that if expectations about the hormone are controlled for, testosterone administration leads to a significant increase in fair bargaining offers compared to placebo. The role of expectations is reflected in the fact that subjects who report that they believe to have received testosterone make lower offers than those who say they believe that they were treated with a placebo. These findings suggest that the experimental economics approach is sensitive for detecting neurobiological effects as subtle as those achieved by administration of hormones. Moreover, the findings point towards the importance of both psychosocial as well as neuroendocrine factors in determining the influence of testosterone on human social behavior.

The procedure described in this protocol shows that testosterone administration and folk beliefs about testosterone may be associated with directly opposed social behaviors.

Combinando comportamentali Endocrinologia ed Economia Sperimentale: Decisione testosterone e sociale Fare

Behavioral endocrinological research in humans as well as in animals suggests that testosterone plays a key role in social interactions. Studies in ...

Production of Chick Embryo Extract for the Cultivation of Murine Neural Crest Stem Cells

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent progenitor cells to be an integral part of the neural crest1. Phenotypically, neural crest stem cells (NCSC) are defined by simultaneously expressing p75 (low-affine nerve growth factor receptor, LNGFR) and SOX10 during their migration from the neural crest2,3,4,5. These progenitor cells can differentiate into smooth muscle cells, chromaffin cells, neurons and glial cells, as well as melanocytes, cartilage and bone6,7,8,9. To cultivate NCSC in vitro, a special neural crest stem cell medium (NCSCM) is required10. The most complex part of the NCSCM is the preparation of chick embryo extract (CEE) representing an essential source of growth factors for the NCSC as well as for other types of neural explants. Other NCSCM ingredients beside CEE are commercially available. Producing CCE using laboratory standard equipment it is of high importance to know about the challenging details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes. In this protocol we describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE.

To cultivate neural crest stem cells (NCSC) in vitro, a special medium (NCSCM) is required. Essential part of NCSCM is chick embryo extract (CEE). We here describe accurate techniques to produce a maximized amount of pure and high quality CEE, including details as the isolation, maceration, centrifugation, and filtration processes.

Produzione di estratto di Chick dell&#39;embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

The neural crest arises from the neuro-ectoderm during embryogenesis and persists only temporarily. Early experiments already proofed pluripotent ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.
Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Here, we describe how to produce, expand, and immunolabel postnatal hippocampal neural progenitor cells (NPCs) in three-dimensional (3D) culture. Next, using hybrid visualization technologies, we demonstrate how digital images of immunolabelled cryosections can be used to reconstruct and map the spatial position of immunopositive cells throughout the entire 3D neurosphere.

Proteine ​​localizzazione in 3D Cultura cellule staminali neurali: una metodologia di visualizzazione ibrida

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...