Questo metodo è molto avanzato. Ha le divisioni del settore biotecnologico come l'ingegneria tissutale, la terapia generativa gratuita e lo screening farmacologico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli aggregati di dimensioni uniformi possono essere prodotti in una semplice coltura di sospensioni.
Questa tavola rappresenta la possibilità dei nuovi vasi a forma di O per la produzione di aggregati uniformi di cellule di mammifero nella coltura di sospensioni orbitali di scuotimento. Nella coltura di scuotimento orbitale con i vasi convenzionali, il flusso circolare si verifica a causa della forza centrifuga della superficie media, e questo flusso medio trasferisce le cellule verso il fondo centrale dei vasi. Questo effetto è ben noto come paradosso delle foglie di tè di Einsteins.
Questo effetto causa un accumulo eccessivo di cellule nel fondo centrale delle cellule e l'aggregazione disomogenea. D'altra parte, i vasi a forma di O eliminano la regione centrale che impedisce alle cellule di spazzamento a flusso medio nella regione centrale inferiore. Ciò limita l'accumulo di cellule in grado di realizzare un'aggregazione omogenea.
Inizia con un pallone di 25 centimetri quadrati di celle HEK-293 per ogni vaso da seduti. Dissociare le cellule utilizzando la soluzione 0.25%Trypsin-EDTA e raccogliere le cellule tramite centrifugazione. Resuspend il pellet risultante in un millilitro di mezzo di coltura.
Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 40 micron per raccogliere una sospensione a cella singola. Aggiungere il blu di Trypan a un'aliquota della sospensione cella ed eseguire un conteggio delle celle. Quindi preparare 20 millilitri di sospensione cellulare a 2 volte 10 alla 5a cella per millilitro.
Collegare l'ingresso del sacchetto a forma di O a una siringa da 50 millilitri bloccata e quindi staccare lo stantuffo. Abbassare la sospensione cellulare preparata nel sacchetto a forma di O attraverso la siringa bloccata. Sostituire la siringa del primo morsetto con una siringa pulita.
Aggiungere 55 millilitri d'aria attraverso la siringa pulita per espandere completamente la borsa. Sbattere il tubo di ingresso e quindi chiudere l'ingresso. Infine, rimuovere il morsetto dal tubo.
Incubare le cellule nel sacchetto a forma di O con scuotimento a 45 giri/min in condizioni di 35 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per cambiare il mezzo nelle celle, prima trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri, tramite l'ingresso. Quindi centrifugare per due minuti a 200G a temperatura ambiente.
Dopo aver aspirato il supernatante, aggiungere 20 millilitri di mezzo di coltura e rimescolare le cellule. Aggiungere le cellule resuspended al sacchetto a forma di O come prima e restituire il sacchetto sigillato all'incubatrice di scuotimento. Per raccogliere le cellule, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri attraverso l'ingresso, come prima.
Lavare l'interno del sacchetto con 20 millilitri di calcio, salina priva di fosfato priva di magnesio e quindi scolare il contenuto in un tubo per raccogliere le cellule rimanenti dal sacchetto. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta per tre minuti a 200 volte G a temperatura ambiente e quindi aspirare il supernate. Aggiungere 10 millilitri di calcio, PBS privo di magnesio e guardare gli aggregati.
Dopo aver centrifugato come prima, rimuovere il supernato e lasciare il pellet contenente gli aggregati. Se è necessario un conteggio delle cellule, aggiungere quattro millilitri di PBS e un millilitro di tripina agli aggregati e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare le cellule per il conteggio. Le misurazioni sperimentali mostrano che gli aggregati coltivati nel piatto convenzionale avevano diametri vari dopo cinque giorni di scuotimento orbitale.
Al contrario, gli aggregati coltivati in piatti o sacchetti a forma di O per cinque giorni, avevano diametri molto più uniformi. Secondo la misurazione delle dimensioni basata sull'immagine, la coltura convenzionale dei piatti ha mostrato due picchi diversi, indicando un'ampia deviazione delle dimensioni aggregate. D'altra parte, gli aggregati nei piatti a forma di O e nei sacchetti a forma di O hanno mostrato un unico picco e meno deviazione di diametro rispetto a quelli del piatto convenzionale, suggerendo che tali aggregati possono essere di qualità più uniforme.
L'ematossilina e la colorazione eosina delle sezioni trasversali aggregate hanno mostrato che gli aggregati coltivati nel piatto convenzionale avevano alcune cellule denucleate e decorso necrotico;tuttavia gli aggregati coltivati in vasi a forma di O non mostravano alcun decorso necrotico e gli aggregati coltivati nel sacchetto a forma di O erano grandi come quelli del piatto convenzionale. Il conteggio delle cellule ha mostrato che più dell'85% delle cellule è sopravvissuto per cinque giorni di coltura di sospensione in ogni nave. Questo video mostra come gestire nuovi vasi a forma di O per la produzione di aggregati di siti uniformi di cellule di mammiferi in semplice coltura di sospensione.
