Questo protocollo utilizza l'automazione per eseguire preparazioni di biochimica proteica prima degli esperimenti di spettrometria di massa, consentendo una maggiore produttività e una minore variabilità per gli studi proteomici. Questo protocollo utilizza un sistema di gestione dei liquidi programmabile a basso costo che è conveniente per più laboratori. Forniamo script Python open source che possono essere modificati per ulteriori sviluppi.
A dimostrare la procedura sarà Milton Amaya, studente di un master nel nostro laboratorio. Per iniziare, apri il noSP3_Digestion. py nell'editor di testo e specificare le variabili specifiche dell'esperimento secondo necessità nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI.
Quindi, apri l'app Opentrons e carica lo script nella scheda Protocollo nell'app Opentrons. Quindi, posizionare il labware e le pipette richiesti nella posizione corrispondente nel deck OT2 specificato nello script Python. Quindi, posizionare la soluzione di bicarbonato di ammonio nel pozzetto A1 del rack a tubi quattro in uno con la parte superiore portatubi da 15 millilitri più 50 millilitri e posizionare il campione proteico nel pozzetto A1 del rack per tubi quattro in uno con un piano portatubi da due millilitri.
Posizionare manualmente tubi a basso legame proteico da due millilitri nei pozzetti del blocco di alluminio posto sopra il modulo di temperatura, partendo da A1 e spostandosi verso il basso verticalmente. Quindi, posizionare la soluzione DTT nel pozzetto A6 del rack tubolare quattro in uno con un supporto per tubi da due millilitri. Osservare mentre il robot trasferisce un volume appropriato del tampone di bicarbonato di ammonio alle provette campione nel blocco di alluminio.
Quindi, verificare manualmente che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che DTT sia stato caricato in A6 del rack tubolare a due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Dopo aver confermato la posizione del tubo DTT e aver aperto il tappo del tubo, fare clic sul pulsante Riprendi nell'app Opentrons per continuare. Assicurarsi che il robot trasferisca 10 microlitri della soluzione DTT a ciascun pozzo campione, seguito da cinque cicli di miscelazione.
Quindi, verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi di chiudere i tappi sulle provette campione. Quindi, chiudi manualmente i tappi dei tubi e fai clic su Riprendi per continuare. Attendere che il modulo di temperatura del robot inizi a riscaldare il blocco di alluminio e la temperatura raggiunga i 55 gradi Celsius, seguita da un'incubazione di cinque minuti per consentire ai campioni di arrivare a 55 gradi Celsius.
Il robot manterrà quindi questa temperatura per 30 minuti per consentire la riduzione delle proteine tramite DTT. Durante l'incubazione, preparare la soluzione di iodoacetammide e avvolgerla manualmente con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Dopo l'incubazione, quando il programma del robot viene messo in pausa e viene visualizzato il messaggio di avviso, assicurarsi di aprire i tappi sulle provette campione, aprire le provette del campione e fare clic su Riprendi per continuare.
Quindi, verificare manualmente che il programma del robot sia in pausa con il messaggio di avviso, Assicurarsi che la iodoacetammide sia stata caricata in B6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Dopo aver confermato la posizione del rack del tubo di iodoacetamide e aver aperto il tappo del tubo, fare clic su Riprendi e assicurarsi che il robot trasferisca 10 microlitri della soluzione di iodoacetammide a ciascun tubo campione, seguito da cinque cicli di miscelazione. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, chiudi i tappi sulle provette del campione, copri i tubi del campione e coprili con un foglio, quindi copri l'intero blocco di alluminio con un foglio pulito e fai clic su Riprendi per continuare.
Attendere che i campioni vengano incubati a 22 gradi Celsius per 30 minuti e assicurarsi che il modulo di temperatura del robot si disattivi al termine dell'incubazione di iodoacetammide. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio di avviso, assicurarsi che la tripsina sia stata caricata in C6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo, posizionare la soluzione di tripsina nel pozzetto C6 del rack tubolare a due millilitri con il tappo del tubo aperto e fare clic su Riprendi per continuare. Quindi, quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio di avviso, aprire i tappi sulle provette del campione sul modulo di temperatura, aprire le provette del campione e fare clic su Riprendi per continuare.
Standby mentre il robot trasferisce 10 microlitri di tripsina a ciascun tubo campione, seguiti da cinque cicli di miscelazione. Dopo la digestione notturna della tripsina, ruotare brevemente i campioni utilizzando una microcentrifuga da banco e posizionare i campioni su un rack magnetico. Dopo due minuti, trasferire il surnatante con attenzione con una pipetta in un nuovo set di tubi microcentrifuga proteici a basso legame e conservare i campioni in frigorifero.
Quindi, apri il SP3_peptide_cleanup. py Python in un editor di testo e specificare le variabili dell'esperimento secondo necessità nella sezione PERSONALIZZA SOLO QUI. Quindi, carica lo script nella scheda Protocollo nell'app Opentrons.
Posizionare il labware e le pipette richiesti nella posizione corrispondente nel deck OT2 specificato nello script Python e assicurarsi che il modulo magnetico sia acceso e collegato al robot. Posizionare una nuova piastra profonda 96 pozzetti a due millilitri sulla parte superiore del modulo magnetico. Quindi, posizionare i campioni digeriti nel rack del tubo a due millilitri a partire da A1 e spostandosi verso il basso verticalmente.
Quindi, assicurati che il robot trasferisca 55 microlitri dei campioni digeriti ai pozzetti nelle piastre profonde del pozzo sul modulo magnetico. Verificare che il protocollo robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che le perline preparate siano state caricate in A6 del rack tubolare a due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo. Quindi, ruotare e ruotare brevemente le perline SP3 in una mini-centrifuga da banco e posizionarle nel pozzetto A6 del rack tubolare da due millilitri con il tappo aperto.
Verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che l'80% di etanolo sia stato caricato in A4 del rack tubolare da 15 millilitri più 50 millilitri situato nello slot cinque prima di riprendere il protocollo. Quindi, posizionare una soluzione di etanolo all'80% nel pozzetto A4 nel rack del tubo e fare clic su Riprendi per continuare. Osservare mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio per rallentare, aspira il surnatante da ciascun pozzo e lo eroga nel tubo di scarico.
Attendere che il robot riporti la velocità di pipettaggio ai valori predefiniti e disinnesti il modulo magnetico. Quando il programma dei robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, Apri il tappo sul tubo di bicarbonato di ammonio, apri il cappuccio della soluzione di bicarbonato di ammonio, quindi fai clic su Riprendi per continuare. Standby mentre il robot disinnesta il modulo magnetico, trasferisce 250 microlitri del tampone di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto e si mescola immediatamente per 10 volte.
Quindi, osserva mentre il robot cambia la velocità di pipettaggio per rallentare e trasferisce il surnatante da ciascun pozzo al tubo di scarico. Attendere che il robot trasferisca 100 microlitri del tampone di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto e si mescoli immediatamente per 10 volte. Verificare che il programma robot sia in pausa e visualizzi il messaggio, Assicurarsi che i nuovi tubi di raccolta siano stati inseriti nel blocco di alluminio da due millilitri prima di riprendere il protocollo.
Quindi, posizionare un nuovo set di tubi microcentrifuga a bassa ritenzione proteica nel blocco di alluminio immediatamente dopo l'ultima provetta campione inizialmente nel blocco e fare clic su Resume per continuare. Standby mentre il robot trasferisce ogni campione nel tampone di bicarbonato di ammonio ai nuovi tubi da due millilitri. Quando il programma del robot viene messo in pausa e visualizza il messaggio, assicurarsi che la tripsina sia stata caricata in C6 del rack tubolare da due millilitri situato nello slot quattro prima di riprendere il protocollo, posizionare la soluzione di tripsina nel pozzetto C6 del rack tubolare da due millilitri con il tappo del tubo aperto e fare clic su Riprendi per continuare.
Una volta terminato il programma, avvolgere i tappi del tubo campione con pellicola di paraffina, trasferire tutti i campioni in un miscelatore a temperatura controllata e incubare a 37 gradi Celsius per 16-20 ore con 1.000 RPM scuotendo. Con il campione BSA, sono stati identificati un mezzo di 728 corrispondenze dello spettro peptidico e 65 peptidi, con coefficienti di variazione rispettivamente del 5,2% e del 3,2%. Con un campione cardiaco complesso, un mezzo di 9.526 corrispondenze dello spettro peptidico, 7.558 peptidi e 1.336 proteine è stato identificato in 10 cicli con coefficienti di variazione del 7,6% 5,9% e del 3,6%.
Per determinare la variabilità nella quantificazione peptidica, i coefficienti di variazione delle intensità del cromatogramma ionico estratto sono stati calcolati per 10 peptidi che mappano a una proteina unica. Quando le variabilità dei risultati sperimentali umani rispetto a quelli robot nella misurazione della concentrazione proteica sono state ulteriormente confrontate con il test BCA, il coefficiente medio di variazione del test BCA robot era inferiore al test BCA manuale umano. Questo protocollo riduce il tempo di banco per l'elaborazione di ciascun campione.
Ci apre la strada per esplorare le differenze proteomiche in un pannello di linee cellulari tra più trattamenti farmacologici.
