Ringraziamo Hyewon Cooper per le illustrazioni.

1. Dissezione Soluzione salina scarafaggio utilizzata in questo protocollo ha la seguente composizione: Cockroach soluzione salina 36: (grammi per 100 ml) 210 mM NaCl (1.227 g) 2.9 mM KCl (0,0216 g) 1.8 mM CaCl 2 (0,0265 g) 0.2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1.8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7.2. Regolare il pH con 1 M NaOH o 1 M HCl). <ol><li> Selezionare uno scarafaggio maschio dalla serbatoio che ha robuste Cerci (Figura 1). Gli ultimi segmenti del maschio sono strette rispetto alla femmina, e non contenenti ovaie e massa uovo, i maschi sono più facili da sezionare. I maschi di P. americana hanno un paio di short stili tra i cerci. Questi stili non sono osservati nelle femmine. </li><li> Tagliare le ali, le gambe e la testa e il pin del corpo, ventrale rivolta verso l&#39;alto, ad una dish allineato con elastomero di silicone. </li><li> Con pinze raccogliere le piastre ventrali e tagliarli fuori con le forbici sottili, a partire dalla fine posteriore e di lavoro anteriormente. Tenere sempre gli organi interni umido con soluzione salina, cercando di mantenere il cerci asciutto. Si può utilizzare cera o pezzi di gomma per posizionare gli addome verso l&#39;alto per evitare che la soluzione salina dalla bagnando il cerci. Se non si bagnano, asciugarle con un pezzo di carta velina. Premere il lato gli organi interni e la materia bianca (grasso corporeo). Il VNC è al centro del campo, corre lungo l&#39;addome e dovrebbe essere visibile tra le trachee lucido. Il cordone nervoso è trasparente e può inizialmente essere difficile da vedere finché l&#39;illuminazione è regolata correttamente (Figura 2). NON maneggiare il VNC con una pinza o perni di insetti, invece manipolarla con sonde di vetro. </li><li> Sgombrare il sistema trachee dell&#39;animale nel miglior modo possibile dal cordone nervoso con una pinza e con un paio di bisogno buon bicchiereles, con molta attenzione contempla i connettivi VNC longitudinalmente tra A6 e A5 o A5 e A4 gangli (Figura 3). Culla della cerci e l&#39;addome verso l&#39;alto fuori dalla vasca salina con perni di insetti accorciato e cera o un cuneo di elastomero di silicone che può essere tagliato per adattarsi alla preparazione (Figure 4A e B). Prestare la massima attenzione nel segmento addominale ultima a non danneggiare i nervi Cercal che proiettano nel ganglio (figure 2D e 5). </li></ol> 2. Registrazione extracellulare <ol><li> La preparazione, microscopio, e la registrazione apparecchio sezionato dovrebbe essere impostato all&#39;interno di una gabbia di Faraday, in particolare per bloccare AC, campi elettrici esterni che potrebbero ignorare segnali dai neuroni (Figura 6). </li><li> Posizionare il microscopio in modo che si affaccia sul palco microscopio. Una volta che il preparato viene posto sul piatto, regolare la posizione del fascio ad alta intensità illuminatoreper un&#39;ottima visualizzazione di esso. </li><li> Collegare l&#39;amplificatore differenziale AC / DC per l&#39;unità di registrazione integrata di dati (informazioni dettagliate sulle impostazioni hardware e software specifici sono stati precedentemente descritto 25). Lo stadio testa in possesso di un elettrodo di aspirazione deve essere collegato all&#39;amplificatore. Un filo di terra argento che è stato rivestito con Cl - inserito nei risultati addome in registrazioni più stabili. La ragione è che se la soluzione nella cavità del corpo non è a contatto con il fluido di balneazione nel piatto, il fluido associato con l&#39;elettrodo di registrazione rimane a terra. </li><li> Impostare la frequenza di registrazione a 4 kHz. Impostare la scala di tensione (asse y) a 500 mV (questo può essere regolata per ottimizzare la visualizzazione della traccia). Eseguire il software di registrazione in modalità continua o oscilloscopio per registrare l&#39;attività neurale in risposta agli stimoli. </li><li> Tagliare uno dei connettivi VNC vicino alla A5 e posizionare l&#39;estremità tagliata collegato a A6 in un elettrodo di aspirazione. Assicurati di pull salina nel elettrodo di aspirazione a coprire il filo d&#39;argento al suo interno prima di succhiare nel nervo. </li><li> Con una pipetta soffio d&#39;aria secca a peli situati su ogni cercus. Vedere se stimolando i peli sul omolaterale cercus al connettivo registrato dà una risposta diversa da quella controlaterale. Prendere atto dell&#39;ampiezza delle risposte e il numero di punte in un dato intervallo di tempo durante la stimolazione. </li><li> Spostare l&#39;elettrodo di aspirazione ad un nervo Cercal per la registrazione. Per ottenere una migliore vestibilità, passa a un elettrodo con una minore apertura, se necessario. </li><li> Tagliare il nervo vicino Cercal a A6 e poi aspirare il nervo che porta alla cercus. Ci dovrebbe essere scarica spontanea dei potenziali d&#39;azione. Ora, soffiare aria sul cercus e annotare le risposte. </li></ol> 3. Elettricamente Stimolare i nervi sensoriali per determinare Recruitment <ol><li> Cambiare il software di registrazione in modalità a spazzare in modo che registra le tracce (100-500 MSEc.) ogni volta che uno stimolo viene attivato. </li><li> Collegare l&#39;elettrodo stimolante all&#39;uscita dello stimolatore. </li><li> Collegare il cavo stimolatore con i due cavi mini-gancio o clip. </li><li> Collegare l&#39;uscita del trigger BNC dallo stimolatore per l&#39;ingresso trigger sull&#39;unità di registrazione. </li><li> I seguenti parametri di stimolazione dovrebbe evocare una risposta: Durata: 0,3 sec; Delay: 10 msec; frequenza: 1 Hz; Tensione: regolare come necessario per ottenere un segnale nelle registrazioni (poco più di soglia e di essere in grado di ottenere una risposta massima). Non c&#39;è motivo di andare a tensioni molto più alte della soglia massima per l&#39;assunzione come alta tensione può essere dannoso per il nervo. </li><li> Tagliare il nervo cercal come distale possibile in modo che una lunga radice nervosa può essere tirato nel elettrodo di aspirazione stimolante (Figura 7, freccia testa). Il connettivo tra A6 e A5 o altro segmento più anteriore può essere utilizzato. </li><li> Impostare l&#39;elettrodo di aspirazione di registrazione in modo da poter pull una connettivo tagliato l&#39;elettrodo. Assicurati di tirare qualche soluzione salina nelle elettrodi di aspirazione per coprire il filo d&#39;argento al suo interno prima di succhiare nei nervi. Assicurarsi che l&#39;elettrodo stimolante è anche radicata nella salina bagno (nell&#39;addome vicino A3 è l&#39;ideale). </li><li> Fornire una serie di singoli stimoli di crescente tensione finché non appare un potenziale d&#39;azione sullo schermo. Si dovrebbe fare una registrazione della minima tensione stimolante e la durata di reclutare una risposta. Aumentare l&#39;intensità fino a quando si osserva una risposta sinaptica nei connettivi. Il grande spike (AP extracellulari) dagli assoni giganti appare per la prima, e poi altri più piccoli AP può anche essere osservato. </li></ol>

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Gli autori dichiarano che non vi siano conflitti di interesse.

Una delle ragioni per le tecniche di esporre per questa preparazione classica è che il sistema cerci è stato ed è una zona attiva di ricerca per affrontare questioni dello sviluppo di circuiti neurali nonché le questioni riguardanti la riparazione e la rigenerazione sinaptica 26-31. Entrambi i metodi di evocare attività nel cordone nervoso ventrale scarafaggio può essere usato per esaminare gli effetti di agenti farmacologici o insetticidi in funzione del sistema nervoso. Questi esperimenti sono fatti semplicemente sciogliendo sostanze chimiche neuroattivi in ​​salina. Dopo lo scambio di questa soluzione con il normale mezzo di balneazione, si possono osservare i cambiamenti nell&#39;attività evocata o spontanea durante la registrazione da connettivi o un nervo motore per dare una lettura coerente dell&#39;effetto della sostanza chimica sulla funzione del sistema nervoso centrale. Come in tutti gli esperimenti neurofisiologici un problema comune è il rumore elettrico. Probabilmente il più grande fattore di qualità del segnale per queste preparazioni is la guarnizione elettrodo di aspirazione sul tessuto nervoso. La tenuta stagna che non completamente disegnare nel nervo Cercal o connettivo è l&#39;ideale. Le registrazioni possono essere effettuate anche con elettrodi doppio gancio posto sotto il cordone nervoso e isolando il VNC con una miscela di olio minerale e petrolato. La miscela può essere caricato in una siringa ed espulso tutto il cordone nervoso 32. Anche una dissezione accurata è critico qui come in qualsiasi preparazione CNS. Alcuni potrebbero trovare più facile per accedere al sistema nervoso centrale sezionando la cuticola dorsale. Mentre questo riduce la possibilità di danneggiare il cordone nervoso ventrale può essere più difficile da rimuovere tutti i visceri utilizzando questo approccio. Non è descritto qui, ma questa preparazione è suscettibile di registrazione intracellulare nelle interneuroni giganti 32,33. L&#39;intero cordone nervoso può anche essere rimosso per accogliere vari elettrodi di registrazione e stimolante allo stesso tempo. In esplorazione fatto della Lobe antenne, funghi body, e altre strutture del sistema nervoso centrale anteriore è ancora in corso 34-35. Mentre lo scarafaggio CNS continua a far luce sulla moderna ricerca neurobiologica questa particolare preparazione è abbastanza semplice da essere utilizzato in laboratori accademici universitari.

Ci sono più di 4.000 specie di scarafaggio, ma solo 30 sono parassiti domestici. Forse il più noto è il nome sbagliato scarafaggio americano Periplaneta americana che ha avuto origine in Africa, e ora si trova quasi ovunque sul pianeta. Oltre alla sua rapida velocità di funzionamento 1 e comportamento sfuggente, nei tropici P. americana è capace di 2,3 volo. Le caratteristiche predominanti del sistema nervoso centrale scarafaggio (CNS) sono la sua natura segmentata e la decentralizzazione del controllo processi 4,5. Il cervello, toracica, addominale e dei gangli sono uniti da connettivi interganglionic accoppiati per formare il cordone nervoso ventrale (VNC). Il gangli in ogni segmento stanno integrando centri. Sono composte da una, regione corticale esterna contenente cellule responsabili della emato-encefalica permeabilità della barriera appena sotto di loro, e la somata dei neuroni originarinari in quel ganglio. Questi somata possono appartenere a interneuroni, neuroni modulatori, o neuroni motori. Essi forniscono assoni che rimangono all&#39;interno del ganglio di origine (interneurone locale), o assoni che proiettano tra i gangli del sistema nervoso centrale (interneuroni interganglionic) o che terminano sulle cellule muscolari periferiche (neuroni motori). La maggior parte dei somata sono posizionati ventrale o ventrolaterally nella corteccia gangliare 5. Le coppie, connettivi interganglionic contengono solo assoni e corpi cellulari neuronali. Il neuropil di un ganglio contiene cellule gliali (neuroglia), tratti di assoni, fasci di assoni, dendriti e neuriti () di neuroni. Il neuropil è privo di corpi cellulari neuronali. Questa è la regione all&#39;interno del ganglio dove la comunicazione sinaptica diretta tra cellule nervose e integrazione di ingressi verifica. La capacità del scarafaggio americano P. americana per rilevare e improvvisamente rispondere ad un predatore si avvicina (a piedi, hand, ecc.) è stata attribuita ad un circuito riflesso che consiste nella cerci e gigante 6,7 sistema fibra. Il cerci sono una coppia di strutture vento sensibili corno come vicino all&#39;estremità dell&#39;addome (Figura 1). In P. americana superficie ventrale di ogni cercus contiene circa 200 filiforme (thread) peli che sono organizzati in 14 colonne. Nove di queste colonne può individuare in modo coerente in diversi animali secondo le proprietà di risposta della cellula recettore associato e assone. Ogni capello è in una presa che permette di piegare più facilmente in un piano che è specifica colonna. Movimento dei capelli in una direzione lungo il suo piano induce una depolarizzazione nella cella recettore e una raffica di potenziali di azione (AP) nel neurone sensoriale. Il movimento nella direzione opposta inibisce qualsiasi AP spontanee in corso 8. L&#39;aereo preferito di deflessione e direzionalità della risposta è differente in ciascuna colonna. Così, il filiforcomplessi m capelli-recettore sono responsabili non solo per rilevare il movimento di aria, ma anche per &#39;codifica&#39;, sotto forma di punti di accesso, la direzione dalla quale la corrente d&#39;aria origine. Trattamento di tali informazioni da parte del CNS si traduce in un &#39;appropriata&#39; la risposta di fuga 6,7. Questo funzionale, specificità colonnare dei peli sensori è preservata da un animale all&#39;altro. La cella recettore di ogni capello filiforme è responsabile per trasdurre la deformazione meccanica dei capelli in un evento neurale (risultante in un burst o inibizione di AP nel l&#39;assone recettore 9. L&#39;AP viaggiano al ganglio addominale terminale (A6) tramite cercal XI nervo, dove sinapsi con assoni giganti del cordone nervoso ventrale (VNC). Gli assoni giganti sono da ritenersi responsabili per la trasmissione e la successiva eccitazione dei neuroni motori che si traduce in un comportamento di fuga 6,10,11. Il comportamento di latenza of la risposta di fuga di P. americana è uno dei più brevi di qualsiasi animale 7. Latenza comportamentale è il tempo tra l&#39;arrivo di uno stimolo a meccanorecettori e l&#39;inizio della risposta di fuga. In esperimenti usando la cinematografia ad alta velocità per registrare il tentativo di fuga da un rospo attaccare, lo scarafaggio è stato osservato per iniziare il suo turno di distanza dal rospo in circa 40 msec (tempo dall&#39;inizio della proroga lingua per scarafaggio movimento 7,12. Usando soffi di vento controllate , la latenza comportamentale potrebbe essere ridotto a 11 msec. Altri esperimenti hanno rivelato che un soffio velocità del vento minima di 12 mm / msec (con un&#39;accelerazione pari a 600 mm / msec 2) può evocare una risposta di fuga, mentre velocità ancora più basse (3 mm / sec) causato camminando lentamente scarafaggi per fermare movimento 12. La forte correlazione che esiste tipicamente tra sistemi a fibre giganti e comportamenti di fuga è stato ben documentato 13,14. In instrecchi dove è necessario e sufficiente per evocare un particolare comportamento una determinata cella la cella viene indicato come un comando neurone 15,16. Interneuroni giganti (IG) nel circuito fuga vento di P. americana non sono necessari per il riflesso. Gli animali che hanno sperimentalmente ablati IG ancora mostrano il comportamento di fuga, pertanto questi soldati non sono considerati i neuroni di comando 17,18. Severing connettivi cervicali che sono rostrale al circuito sensomotorio influenza anche il comportamento, indicando che discendente input dal cervello ha un effetto sulla direzione di fuga 19. Questi aspetti di un controllo preciso e ridondanza sono di primaria importanza per la sopravvivenza dell&#39;organismo e sono completati dalla modulazione neurochimica via ammine biogene 20. Il P. preparazione del cavo americana nervo è stato un elegante sistema modello per neuroethologists nel corso degli ultimi decenni a partire con il lavoro pionieristico di Roeder &lt;sup&gt; 21. Permette agli studenti di registrare, visualizzare e analizzare l&#39;attività sensoriale primaria e quelli risultanti dagli interneuroni giganti per la loro 22,23,24 input. Oltre a trasmettere l&#39;idea che i circuiti neurali alla base identificabili risposte comportamentali per l&#39;ambiente, questi esercizi dovrebbero infondere un apprezzamento per i contributi biologiche fatte da questo parassita comune della famiglia.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

La preparazione cordone nervoso ventrale scarafaggio è un sistema maneggevole per esperimenti Neuroethology, modellazione di reti neurali, e verificare gli effetti fisiologici di insetticidi. Questo articolo descrive l&#39;ambito di scarafaggi modalità sensoriali che possono essere utilizzati per eseguire il test come un sistema nervoso degli insetti risponde alle perturbazioni ambientali. Enfasi è sul comportamento di fuga mediata da Cerci al gigante di trasmissione in fibra in Periplaneta americana. Questo in preparazione situ richiede solo abilità dissezione moderato e competenze elettrofisiologico per generare le registrazioni riproducibili di attività neuronale. Peptidi o altri reagenti chimici possono essere applicati direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica. Insetticidi potrebbero anche essere somministrate prima della dissezione e il circuito di fuga possono servire come proxy per lo stato eccitabile del sistema nervoso centrale. In questo contesto i saggi qui descritti sarebbe anche utile per researchers interessati alla rigenerazione degli arti e l&#39;evoluzione dello sviluppo del sistema nervoso per la quale P. americana è un organismo modello stabilito.

La stimolazione dei peli sul cerci da un soffio d&#39;aria provoca scarichi di neuroni sensoriali primari che possono essere registrate mediante elettrodi di aspirazione extracellulari attaccati sia per connessioni tra gangli addominale o il nervo Cercal stessa (Figura 8). Ampiezze picco registrate dalle due regioni sono dell&#39;ordine di alcuni microorganismi volt a millivolt. A causa di integrazione sensoriale nel ganglio del numero di picchi osservati nel potenziale d&#39;azione composto o come singoli picchi registrati dal nervo Cercal è notevolmente maggiore rispetto a quella osservata nelle registrazioni dei connettivi. Tuttavia anche notare che è sostanzialmente meno rumore nella registrazione al connettivo dovuta alla tenuta migliore tra l&#39;elettrodo e il tessuto nervoso. Con sbuffando dell&#39;aria nelle grandi picchi Cerci può essere osservato nei connettivi (Figura 8A). Usando questo metodo stimolante, registrazioni tra A3 e A4 tipica<html> mostra ly una grande caratteristica di punta del interneurone gigante (s). Registrazione da un nervo cercal mentre fisicamente strofinando la cerci con una pinza prodotto una forte busto di attività (Figura 8B 1). In un&#39;altra registrazione, 2 sbuffi d&#39;aria ogni prodotto una risposta rapida busting nel nervo Cercal (Figura 8B 2). Quando stimolando elettricamente il nervo cercal con un elettrodo di aspirazione e la registrazione nel connettivo tra A3 e A4, si può osservare una soglia nella stimolazione di risposte evocate (Figura 8C 1). La stimolazione elettrica del nervo cercal chiaramente suscita una risposta in connettivi che può essere quantificata per gli studi di manipolazione con agenti farmacologici o circonda la ambientale locale, quali la temperatura (Figura 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Americana Periplaneta con cerci intatto. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Figura 2. Vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio come si è visto con la cuticola ventrale rimosso (A). Una vista ingrandita del segmento indicato dalle frecce è visto in (B). In (C) i connettivi si sono riversate tra A4 e A3 con una sonda di vetro. Il 6 ° ganglio addominale è mostrato in (D) con i due nervi Cercal lasciando alla fine caudale. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Figura 3. Schema vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;cerci sono posizionati verso l&#39;alto fuori dalla vasca salina. L&#39;addome aperte possono essere inondate con soluzione salina (A) con l&#39;estremità caudale del scarafaggio essere elevato con un piccolo pezzo di forma incuneata elastomero di silicone per mantenere la cerci out del bagno (B). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Figura 5. Il 6 ° ganglio addominale con il nervo Cercal (indicato dalle frecce). <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;apparecchiatura istituito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere lar</a>ger figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Figura 7. Stimolante ed elettrodo di registrazione impostati. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Figura 8. Registrazioni neurali dei connettivi e nervo cercal con varie procedure di stimolazione. Registrazione con un elettrodo di aspirazione dalle connessioni tra A3 e A4, mentre fumano aria alla Cerci (A). Registrazione da neuroni Cercal primarie con un elettrodo di aspirazione, mentre sia fisicamente sfregamento (B 1) o la fornitura di sbuffi d&#39;aria (B 2) Risultati in rapide sequenze di attività nel nervo Cercal. Elettricamente stimolando il nervo Cercal produce risposte a connettivi ( <strong&gt; C 1). Si noti il ​​graduale aumento dell&#39;intensità stimolante (frecce indicano l&#39;ampiezza del manufatto stimolante) e l&#39;intensità delle seguenti risposte evocate. La stimolazione elettrica del nervo cercal fornisce un mezzo relativamente più controllati di stimolazione del nervo cercal coerenza nella stimolazione per quantificare le risposte (C 2).

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Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Questo articolo descrive la blatta ventrale nervo dissezione spinale e registrazioni extracellulari dal nervo Cercal e connettivi. Risposte evocate sono generate dalla stimolazione elettrica del nervo cercal o stimolazione meccanica diretta della cerci.

Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.1K Views.  University of Kentucky.  Questo articolo descrive la blatta ventrale nervo dissezione spinale e registrazioni extracellulari dal nervo Cercal e connettivi. Risposte evocate sono generate dalla stimolazione elettrica del nervo cercal o stimolazione meccanica diretta della cerci. 

Video: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Rivelando Topografia Neural Circuit in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Preparazione di un mouse Awake per la registrazione di risposte neurali e iniezione Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma Infortunio per Indagare riparazione del sistema nervoso centrale in<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Le reti neurali ricalcolate anatomicamente tridimensionali dei micro-tessuti per la ricostruzione, la modulazione e la modellazione del sistema nervoso

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.