Ringraziamo Sandra Bargen per un eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato dal reparto di ricerca Protein (PRD, TP A1.2 (RC e TS), e la ricerca RUB Fond, Rektoratsprogramme -. Wissenschaftlicher Nachwuchs (AK) Gli anticorpi monoclonali 39.4D5 e F55A10 sono stati ottenuti da studi sullo sviluppo Ibridoma Bank (DSHB, Iowa City, IA).

Per i reagenti speciali: vedi tab. 1. Tutti gli altri reagenti elencati sono in grado di qualità di colture cellulari ottenute da Sigma Aldrich. 1. Rivestimento PORN-H/laminin di piatti / coprioggetto <ol><li> Preparare la soluzione di lavoro di 0,5 mg / ml Poly-DL-ornitina bromidrato (PORN-H) in 150 mM pH tampone borato 8,35. <ol><li> Una soluzione madre di 50 mg PORN / 1 ml di tampone borato possono essere preparati in anticipo e conservati a -20 ° C. </li></ol></li><li> Sterilizzare coprioggetto di vetro mediante esposizione alla fiamma in 100% di etanolo e lasciarli asciugare all&#39;aria. </li><li> Coprire la superficie con sufficiente PORN-H notte a 4 ° C. </li><li> Il giorno dopo lavare tre volte con acqua sterile e asciugare coprioggetto. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro di 2,5 mg / ml in laminina HBSS <ol><li> Aliquote possono essere conservati a -20 ° C. Scongelare a 4 ° C immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Coprire la superficie del PORN-H rivestite copri con la soluzione di laminina e lasciarli incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Lectina rivestimento della piastra di depurazione <ol><li> Preparare una soluzione di 10 mM Tris in acqua sterilizzata, pH 9.5. </li><li> Aggiungi lectina (risolvere la lectina (Sigma L9640) in polvere in HBSS) ad una concentrazione finale di 10 mg / ml. </li><li> Ricoprire la superficie di un piatto di 10 centimetri coltura cellulare con 8 ml di soluzione di lectina e lasciarlo incubare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la piastra tre volte con HBSS e conservare in HBSS fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare un 30mm KCl, 0,8% (w / v) di NaCl depolarizzazione-soluzione. Sterilizzare per filtrazione e conservare a temperatura ambiente (RT). </li></ol> 3. Motoneuroni terreno di coltura <ol><li> Scongelare cavallo siero notte a 4 ° C e inattivare a 55 ° C per 30 minuti, aliquote in 5 ml e conservare a -20 ° C. Aliquota Scongelare prima dell&#39;uso direttamente a temperatura ambiente. </li><li> Conservare B27-supplemento aliqouts in 1 ml a -20 ° C. Scongelare B27 supplemento a RT immediatamente prima dell&#39;uso. Evitare cicli di gelo e disgelo. </li><li> Glutamax aliquotare in aliquote da 0,5 ml e conservare a -20 ° C e usarlo a 1:100. </li><li> Preparare una soluzione stock di 10 mg / ml CNTF in acqua sterilizzata con 0,1% di BSA. Conservare a -20 ° C. </li><li> Mix 46 di media neurobasal ml con 2,5 ml di siero di cavallo, 1 ml B27-integrazione e di 0,5 ml glutamax direttamente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungi CNTF a una concentrazione finale di 10 ng / ml media e pre-riscaldare medio a 37 ° C. </li></ol> 4. Dissezione del midollo spinale <ol><li> Sacrifica un E12.5 il mouse in gravidanza e rimuovere gli embrioni con attenzione. Aggiungi sufficiente RT HBSS per coprire completamente gli embrioni. </li><li> Togliere la testa e la coda e posto nella parte posteriore dell&#39;embrione con le membra divaricate. </li><li> Fissare l&#39;embrione con una pinza e togliere la pelle esterna con le pinze altri. </li><li> Togliere il midollo spinale forando la pinza sotto di essa e sollevarlo con sega movimenti simili su entrambi i lati del midollo spinale. </li><li> Trasferire il midollo spinale isolato di un nuovo piatto con HBSS e aprire il canale centrale del midollo spinale sul lato dorsale. </li><li> Rimuovere i gangli spinali, rimuovendo le meningi allegando del midollo spinale. </li><li> Raccogliere le parti lombare del midollo spinale di un massimo di 6 embrioni per piastra lectina in una provetta eppendorf riempito con 1 ml HBSS e memorizzare su ghiaccio fino a quando la preparazione è fatto. </li></ol> 5. Arricchimento dei motoneuroni da lectina-based di purificazione Nota: Prima di avviare le fasi successive, l&#39;ultima qui preparare e preriscaldare il supporto (si veda il punto 3.) <ol><li> Preparare una soluzione di tripsina, risolvendo 1 g tripsina in 100 ml di HBSS, conservare a -20 ° C e scongelare a 4 ° C. </li><li> Mix 1g tripsina inibitore HBSS con 98 ml e 2 ml di 1 M HEPES pH 7.4, 1 ml aliquote deve essere conservato a 4 ° C. </li><li> Trasferire la provetta con il midollo spinale di un cappuccio di coltura cellulare e rimuovere con attenzione 700 microlitri della HBSS. </li><li> Aggiungere 7,5 ul di soluzione tripsina e mescolare con cura capovolgendo la provetta. </li><li> Eseguire trypsination per 8 minuti a 37 ° C. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 30 microlitri inibitore della tripsina e pipettare su e giù (triturare) attentamente 10-15 volte con la punta della pipetta 1000 microlitri fino aggregati di cellule non più visibili. Ripetere la triturazione con una pipetta 2-20 microlitri e la punta corrispondente. </li><li> Pipettare la soluzione della cella in HBSS pieno piastra lectina e disperdere le cellule ruotare delicatamente il piatto. </li><li> Mantenere la piastra lectina per 60 min a RT su un senza vibrazioni. Coprirla per evitare contaminazioni. </li><li> Rimuovere il HBSS molto delicatamente e lavare accuratamente la piastra 4 volte con la pre-riscaldato HBSS per rimuovere frammenti di cellule e le cellule non collegato / separati. </li><li> Subito dopo il lavaggio scorso, aggiungere 500 ul di soluzione depolarizzazione alla piastra e lasciarlo incubare per 1 min. </li><li> Facilitare il distacco delle cellule lectina legato agitando etoccando la piastra. </li><li> Riempire il piatto con 2 ml preriscaldata terreno di coltura e trasferimento in un tubo da 15 ml falco. </li><li> Contare il numero di cellule con una camera di conteggio Neubauer. </li><li> Piastra la cella i coprioggetti laminina rivestiti o piastre in un numero adeguato a seconda dell&#39;applicazione. </li><li> Effettuare uno scambio di media al giorno 1 e successivamente ogni due giorni per la sostituzione attento del 50% del mezzo vecchio. Usare sempre pre-riscaldato, media preparate nuova cultura. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Motoneuroni embrionali possono essere ottenute da embrioni di topo a E12 a E14. 2-3% della popolazione totale di cellule del midollo spinale lombare consiste in motoneuroni e come i neuroni spinali gangliari sono p75 NTR-positivi e, è importante per sbarazzarsi di queste cellule prima di iniziare la lectina procedura basata preplating ( per una panoramica si veda la Figura 1 e Figura 2). In secondo luogo, le meningi includono cellule fortemente dividendo che dovrebbe essere escluso come pure, in quanto non possono essere adeguatamente rimossi dal lectina procedura basata preplating (Figura 2 e Figura 3). Nel peggiore dei casi, queste cellule possono proliferare le piastre di coltura. Le immagini rappresentative della Figura 3B e 3D anche dare un&#39;idea circa la bassa densità cellulare dopo aver lavato le procedure sono state eseguite (vedere il punto 5,9 del protocollo). Culture dei motoneuroni embrionali di topo sono di solito mantenuti per un massimo di cinque o sette giorni. Durante questo periodo le cellule stabilire la loro neuriti fino ad una lunghezza massima (Figura 4). Lunghezza dei neuriti fortemente dipende dal substrato sui piatti 8. Il substrato tipico è la laminina, che è rivestito su PORN-H piatti cultura coperto. Motoneuroni possono crescere anche su altri substrati o meno definite, come matrice extracellulare generato da lisi acqua 8. In caso di sub-ottimale rivestimento, lunghezza dei neuriti e cono area di crescita sono diminuiti e la morte delle cellule di solito aumenta. Supporto trofico gioca un ruolo cruciale per la sopravvivenza dei motoneuroni embrionali di topo in coltura. Sopravvivenza delle cellule inizialmente placcato in calo di sette giorni al 10% al 20% senza il supporto trofico 6. Fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF) e di fattore neurotrofico ciliare (CNTF) sono i fattori più comunemente usati, ma altri possono favorire la sopravvivenza e [fattore inibente la leucemia (LIF), Cardiotrophin-1 (CT-1), fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF ), Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) 9]. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di flusso per la preparazione dei motoneuroni embrionali di topo. Il disegno schematico illustra le diverse fasi per l&#39;isolamento e la coltura dei motoneuroni embrionali di topo. Abbreviazioni: SC: midollo spinale; HBSS: soluzione salina Hanks equilibrato; MN: motoneuroni. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig2.jpg" /> Figura 2 isolamento della parte lombare del midollo spinale da E12.5 il mouse A:.. E12.5 embrione di topo. Per il prossimo passo, la testa e la coda sono stati rimossi e il corpo è posto in una dorsale-up posizione B: embrione in una dorsale-up di posizione. Pinze a sinistra ea destra del midollo spinale sono di fissaggio del corpo dell&#39;embrione nella sua posizione. Una delle pinze viene successivamente utilizzato per tagliare la pelle e tagliare sotto il midollo spinale viene usato l&#39;altro per fissare l&#39;embrione nella sua posizione C:. Isolata del midollo spinale da E12.5 embrione di topo. Le parti del midollo spinale (cervicale, dorsale, lombare) sono indicati. Il midollo spinale è circondato dalle meningi e parte dei gangli spinali ancora allegare ad essi. D: Il midollo spinale è tagliato longitudinalmente sul lato dorsale per aprirla verso il canale centrale E:. Le meningi sul lato ventrale sono ora decollato dal midollo spinale appiattito. Nota: Anche se tolto, la parte lombare è segnato da un piccolo taglio F:. Solo la parte lombare della colonna vertebrale viene poi data per ulteriori procedure. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig3.jpg" /> Figura 3 Determinazione e l&#39;isolamento di isole pancreatiche positive le cellule dal midollo spinale lombare E12.5 di embrioni di topo A:.. Il Islet-1 / 2 anticorpo marca le colonne dei motoneuroni nel midollo spinale lombare embrionale (rosso, freccia) e le etichette Hoechst tutti nuclei all&#39;interno della sezione. Sezione di un cavo di E12.5 Lumar spinale. E12.5 embrioni di topo sono state immersione fissate in 4% paraformaldeide per 6 ore, lavate 3 volte con PBS e trattati con saccarosio secondo le procedure standard. Criosezioni di 20 micron sono state scattate con un criostato e le sezioni sono state gestite per la colorazione immunhistochemical secondo le procedure standard 11. Il software sezioni successivamente etichettati con Hoechst per la localizzazione dei nuclei delle cellule. Si noti chei neuroni spinali gangliari sono Islet-1/2-positive come bene e che la procedura di preparazione esclude questo parti di tessuto dalla procedura di isolamento B:. Islet-1 / 2 etichettati (rosso, freccia) dissociate le cellule del midollo spinale lombare da E12. 5 embrioni, a sinistra - prima e destra - dopo lectina-based preplating. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst per visualizzare tutti i nuclei delle cellule C:. Quantificazione di cellule Islet-1/2-positive prima e dopo la lectina basato preplating D:. Nkx6.1 motoneuroni etichettati da E12.5 embrioni dopo una giornata di cultura. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst cisualieze a tutti i nuclei. Si noti che il 90% di tutte le cellule sono Nkx6.1 positivi. Abbreviazioni: SC: midollo spinale; MN: motoneurone; DRG: gangli delle radici dorsali. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3200/3200fig4.jpg" /> Figura 4 Caratterizzazione delle E12.5 motoneuroni del mouse A e B:.. Arricchito isolato E12.5 il mouse lombare motoneuroni spinali esprimere p75 NTR a 0 giorni in vitro (0div) e il giorno 2 in vitro (2div). Le cellule sono state fissate con paraformaldeide 4% e successivamente colorati per p75 NTR secondo le procedure standard. Le cellule sono state di contrasto con Hoechst per visualizzare tutti i nuclei C:. Motoneuroni Arricchito dopo 5 giorni in vitro (5div) su PORN-H e la laminina come substrati cultura e alla presenza di macchie CNTF per β-III-tubulina. Si noti che le cellule sono cresciute le neuriti lungo e visualizzare la morfologia tipica dei motoneuroni con uno più lungo (ramificata) di processo e uno o più processi più brevi (assoni e dendriti). Abbreviazioni: MN: motoneurone; div: giorni in vitro. <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="3"> Dopo la dissociazione senza lectina-based preplating </td></tr><tr><td> Numero totale di cellule / SC </td><td> Blu tripano cellule positive [%] </td><td> Cellule Islet-1/2- positivo [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 995,0 </td><td> 13,1 </td><td> 9,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 889,4 </td><td> 8,0 </td><td> 10,0 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1.180.0 </td><td> 11,0 </td><td> 10,8 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> 1.021.0 147,1 ± </td><td> 10,7 ± 2,6 </td><td> 10,1 ± 0,7 </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td> Con lectina-based preplating </td></tr><tr><td> Numero di celle dopo preplating / SC </td><td> Blu tripano cellule positive [%] </td><td> Cellule Islet-1/2- positivo [%] </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 189,6 </td><td> 9,9 </td><td> 70,5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 168,8 </td><td> 3,7 </td><td> 76,1 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 125,0 </td><td> 0,0 </td><td> 72,5 </td></tr><tr><td> Media ± DS </td><td> 161,1 ± 33,0 </td><td> 4,5 ± 5,0 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintesi delle procedure di isolamento rappresentante per motoneuroni embrionali di topo da stadio E12.5. Risultati da 3 diverse procedure di isolamento appositamente per questo scopo sono dati come il numero totale o numeri percentuale ± SD. Abbreviazione: SC: midollo spinale; SD: deviazione standard. <table border="1"><tbody><tr><td> Islet-1 / 2 cellule positive con p75 panning [%] </td><td> Islet-1 / 2 cellule positive con lectina a base di pan [%] </td></tr><tr><td> 92,0 ± 3,5 1 </td><td> 73,0 ± 2,8 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Risultati Confronto di lectina-based e p75-based 1 I numeri dei motoneuroni panning cellulare. Sono dati come numeri percentuali ± SD.

<ol>
	<li>Vallstedt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+repressor+activity+assign+redundant+and+specific+roles+to+Nkx6+genes+in+motor+neuron+and+interneuron+specification.">Different levels of repressor activity assign redundant and specific roles to Nkx6 genes in motor neuron and interneuron specification.</a> Neuron. 31, 743-755 (2001).</li><li>Tsuchida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+organization+of+embryonic+motor+neurons+defined+by+expression+of+LIM+homeobox+genes.">Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes.</a> Cell. 79, 957-970 (1994).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+related+motor+neuron+pool+and+muscle+sensory+afferent+subtypes+defined+by+coordinate+ETS+gene+expression.">Functionally related motor neuron pool and muscle sensory afferent subtypes defined by coordinate ETS gene expression.</a> Cell. 95, 393-407 (1998).</li><li>Wiese, S., Beck, M., Karch, C., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+mechanisms+for+survival+of+lesioned+motoneurons.">Signalling mechanisms for survival of lesioned motoneurons.</a> Acta Neurochir. , 21-35 (2004).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il vantaggio di questa tecnica basata lectina preplating è che è meno costoso del NTR a base di p75 procedura di panning, e la lectina è più stabile di anticorpi. L&#39;arricchimento elencati nella fig. 2 e tab. 1 mostra che la procedura consente alla purificazione di un numero simile di cellule e che la maggior parte di queste cellule esprimono il marcatore motoneuroni Islet-1 / 2. La fase più critica è la procedura di isolamento per il midollo spinale lombare. Rimuovendo le meningi e il DRG (Fig. 2) è essenziale per la procedura di purificazione seguenti lectina-based preplating. Se questa è stata gestita correttamente, quasi tutte le cellule esprimono la p75 NTR (per quadro rappresentativo vedi fig. 3a). Il motivo della differenza tra l&#39;espressione di Islet-1 / 2 e p75 NTR è più probabilmente perché motoneuroni lombari differenziale esprimere livelli superiori e inferiori di Islet-1 / 2 10. In caso di bassi livelli di Islet-1 / 2 questa espressione potrebbe essere sfuggito la nostra attenzione nella colorazione immuncytochemical e contando successive come siamo stati rigorosi rispetto a cellule positive rispetto al negativo (Tab. 1). Inoltre, la tabella 1 mostra chiaramente che le cellule isolate sopravvivere alla procedura in una condizione di buona salute, in quanto vi sono solo poche cellule positive trypan-blu che indicano che le cellule sono irreversibilmente danneggiate. Questa procedura consente anche alterative isolamento dei motoneuroni da embrioni singolo e quindi di cucciolate genotipo misti dai topi embrionale. In conclusione, questa alternativa alla procedura panning con l&#39;anticorpo p75 NTR 6 ha capacità simili se non identici, in termini di campi di possibile applicazione e fornisce un metodo economico ed efficiente alternativa per la purificazione motoneuroni embrionali di topo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina bromidrato </td><td> Sigma </td><td> P8638 </td><td></td></tr><tr><td> Laminina </td><td> Invitrogen </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Vetrini coprioggetto </td><td> Thermo </td><td></td><td> Ø 10 o 14 millimetri </td></tr><tr><td> Lectina </td><td> Sigma </td><td> L5142 </td><td></td></tr><tr><td> Coltura cellulare piatto </td><td> Nunc </td><td> 150350 </td><td> Nunclon delta superficie </td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Linaris </td><td> SHD3250ZK </td><td> Ogni partita deve essere testato per MN cultura </td></tr><tr><td> B27 Supplemento </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Gibco </td><td> 35050-038 </td><td></td></tr><tr><td> CNTF </td><td> Sigma </td><td> N0513 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Applichem </td><td> A1391 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-041 </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td></td><td></td><td> In acciaio inox, misura 4 o 5 </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Worthington </td><td> LS003707 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina inibitore </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Islet-1 </td><td> DSHB </td><td> 39.4D5 </td><td> Coltura cellulare surnatante </td></tr><tr><td> Anti-Nkx6.1 </td><td> DSHB </td><td> F55A10 </td><td> Coltura cellulare surnatante </td></tr><tr><td> Anti-p75 NTR </td><td> Abcam </td><td> Ab8874 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche.

lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons

Motoneuroni spinali sviluppare verso postmitotic ai primi stadi dello sviluppo embrionale del sistema nervoso e, successivamente, crescono dendriti e degli assoni. Neuroepiteliale cellule del tubo neurale che esprimono Nkx6.1 sono le cellule precursore unico per motoneuroni spinali 1. Anche se motoneuroni postmitotic verso la loro posizione finale e si organizzano in colonne lungo il tratto della colonna vertebrale 2,3. Più del 90% di tutti questi motoneuroni differenziata e posizionata esprimere i fattori di trascrizione Islet 1 / 2. Essi innervano i muscoli degli arti così come quelli del corpo e gli organi interni. Tra gli altri, i motoneuroni tipicamente esprimono il recettore ad alta affinità per il fattore neurotrofico cervello derivato (BDNF) e neurotrofina-3 (NT-3), la tropomiosina legate chinasi B e C (TrkB, TRKC). Essi non esprimono la tropomiosina legati chinasi A (TrkA) 4. Accanto ai due recettori ad alta affinità, motoneuroni non esprimono il recettore a bassa affinità neurotrofina p75 NTR. La p75 NTR può legare tutte le neurotrofine con simile affinità, ma inferiore a tutte le neurotrofine che i recettori ad alta affinità che legano le neurotrofine maturo. All&#39;interno del midollo spinale embrionale, la p75 NTR è esclusivamente espressa dal motoneuroni spinali 5. Questo è stato utilizzato per sviluppare tecniche di isolamento dei motoneuroni per purificare le cellule dalla stragrande maggioranza delle cellule circostanti 6. Motoneuroni isolando con l&#39;ausilio di anticorpi specifici (panning) contro il dominio extracellulare di p75 NTR si è rivelato essere un metodo costoso come la quantità di anticorpi utilizzati per un singolo esperimento è alta a causa delle dimensioni del piatto usato per il panning. Un&#39;alternativa molto più economica è l&#39;uso di lectina. Lectina è stato dimostrato che si legano specificamente a p75 NTR pure 7. Il metodo che segue descrive una tecnica alternativa utilizzando agglutinina germe di grano per una procedura preplating invece che l&#39;anticorpo p75 NTR. La lectina è un&#39;alternativa estremamente economico per l&#39;anticorpo p75 NTR ed i gradi di purificazione con lectina è paragonabile a quella degli anticorpi p75 NTR. Motoneuroni del midollo spinale embrionale può essere isolata da questo metodo, sopravvivere e crescere i neuriti.

Watch this Scientific Journal Video about Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons at JoVE.com

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Un modo alternativo di isolare motoneuroni embrionali di topo dal midollo spinale è descritto. Il metodo tiene conto del fatto che lectine possono legarsi a bassa affinità dei recettori nervosi p75NTR fattore di crescita. Questo lectina-based preplating permette una purificazione simile a quella con un anticorpo specifico contro il p75NTR.

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

lectin-based-isolation-and-culture-of-mouse-embryonic-motoneurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.8K Views.  Ruhr-University Bochum. Un modo alternativo di isolare motoneuroni embrionali di topo dal midollo spinale è descritto. Il metodo tiene conto del fatto che lectine possono legarsi a bassa affinità dei recettori nervosi p75NTR fattore di crescita. Questo lectina-based preplating permette una purificazione simile a quella con un anticorpo specifico contro il p75NTR.

Video: Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali neuronali di ratto: un protocollo veloce

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e la coltura delle cellule della cresta neurale da Embryonic Murine tubo neurale

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Isolamento e coltura di cellule endoteliali dal embrionali Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...