Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa di Grant PT074620 (SLJ) e NIH di Grant R01NS245014 (SLJ).

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Scongelare Matrigel congelato in ghiaccio umido, lasciando il tempo sufficiente prima che l&#39;esperimento (non accelerare il processo di riscaldamento attivo). Matrigel viene utilizzata per stabilire un ambiente 3D molto simili a una matrice extracellulare favorisce la migrazione delle cellule. Esso fornisce le cellule sia con un substrato e meccanica stringe. Matrigel è conservato congelato a -20 ° C. Prima dell&#39;uso, va gradualmente portato fino alla temperatura di 0-4 ° C, scongelato in ghiaccio umido o in frigorifero. Matrigel fissa irreversibilmente a formare un gel della temperatura di incubazione (37 ° C). Pertanto non è raccomandato per accelerare lo scongelamento immergendo il recipiente in acqua calda. </li><li> Frazioni proteiche sono preparati concentrandosi isoelettrico (IEF) di un estratto proteico totale da parte della corteccia cerebrale del giorno 0 postnatale (P0) furetto. Dopo la separazione, le frazioni sono dializzati durante la notte contro il 20 mM Tris-HCl pH7.2 per pulire gli estratti dai costituenti buffer di messa a fuoco, che potrebbe essere tossico per il tessuto. </li><li> Sistema di erogazione delle proteine. Proteine ​​estratte dalla corteccia cerebrale sono adsorbite su sfere di lattice fluorescente che poi rilasciare lentamente le proteine ​​al environment.We scoperto che la caratteristica fluorescenza aiuta nella gestione visiva delle microsfere e consente la facile individuazione anche di spillover minimi dal sito di tallone deposito, se osservata al microscopio a fluorescenza. <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 10μl di perline fluorescenti a 100-200μl di soluzione proteica </li><li> Incubare per 30 min al buio a temperatura ambiente su un agitatore </li><li> Spin le perle giù in una centrifuga da banco per 1 ora alla massima velocità </li><li> Rimuovere il surnatante </li><li> Risospendere in un vortice con 10μl di terreno fresco </li><li> Aggiungere 30μl di Matrigel alla sospensione, mescolare bene, e posto sul ghiaccio. </li></ol></li><li> Tamponi e dei media <ol><li> Preparare e sterilizzare filtrazione artificiale liquido cerebrospinale (aCSF; 124mm NaCl, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1,2, KCl 3,2 mm, 1,2 mm MgSO 4, CaCl 2 2,4 mm, glucosio 10mM). Slush-congelare il aCSF in anticipo, quindi è pronto al momento della dissezione dei tessuti. Per farlo, posto un recipiente di plastica pieno di aCSF sterile in un congelatore C ° -80. Monitor congelamento ogni tanto, così quando uno strato di ghiaccio si accumula sulla parte interna del muro, rompere e miscelare con il fluido. Ripetere fino a quando il pallone contiene principalmente un fango ghiacciato. Buffer preparato in questo modo non solo supporta la sopravvivenza del tessuto, ma anche tenere la temperatura più bassa, ed è meccanicamente meno dannosi per il tessuto di cubetti di ghiaccio grosso. </li><li> Preparare medio Neurobasal con N-2 e B-27 supplementi aggiunti secondo le indicazioni del produttore, così come 1mg/100ml gentamicina, 2 mM L-glutammina, e 0,6% di glucosio. Sterilizzare per filtrazione attraverso una membrana 0.22μm. Tenere in caldo a 37 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Piastre di coltura <ol class="lalpha"><li> Cultura di qualità in plastica a sei pozzetti sono preparati da punteggiano ogni bene nel suo centro con una piccola quantità (circa 2μl) di Matrigel a freddo con 20μl punta della pipetta, e mettendo un autoclave coprioggetto di vetro rotondo 18 millimetri su ogni goccia. Né i piatti né i coprioggetti devono essere altrimenti coltura trattata. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione dei tessuti <ol><li> Ottenere il tessuto cerebrale <ol class="lalpha"><li> Dopo l&#39;anestesia profondamente l&#39;animale con Euthasol, rimuovere il cervello e metterlo nella gelida aCSF </li><li> Separare gli emisferi con un bisturi e tagliare coronale a 500μm utilizzando un dispositivo di scelta, raccogliendo le fette in un piatto contenente piccole ghiacciata aCSF </li></ol></li><li> Espianti fare (uso microscopio da dissezione) <ol class="a"><li> Identificare fette contenente le eminenze gangliari (GE) e regioni assetto della corteccia che possono arricciare più di GE e interferire con ulteriori passi </li><li> Premere un Harris Uni-Core foro nella zona vicino alla superficie ventricolare di GE, ritraggono un nucleo contenente essenzialmente una zona ventricolare, ed espellere con un pistone nel ghiacciato medio (Fig.1). Da tre a quattro espianti di 0,5 mm di diametro può essere fatto da GE in un&#39;unica fetta P0 furetto cervello. Si prega di notare che in entrambi i roditori e furetti, il GE mediale e laterale sono fusi a questa età. Se un nucleo rimane nella fetta o è attaccata al fondo del piatto di plastica, si mobilitano per spruzzando aCSF con un puntale e trasferire con una pipetta nel piatto contenente freddo medio Neurobasal. Tenere il piatto su ghiaccio bagnato. </li><li> Trasferimento di un lotto di espianti dal mezzo in una grossa goccia di ghiacciata Matrigel (circa 0,5 ml 0,25), posto in un recipiente a parte, avendo cura di avere il espianti completamente immerso ed evitando bolle. Tenere il piatto su ghiaccio bagnato. La dimensione di una partita dipende dalla velocità del flusso di lavoro a valle. </li></ol></li></ol> 3. Cultura impostazione (utilizzare microscopio da dissezione) <ol><li> Tenere sempre Matrigel e Matrigel contenenti mix sul ghiaccio per evitare la polimerizzazione. </li><li> Remix la sospensione tallone e il luogo 1-2μl o meno della sospensione tallone in gelide Matrigel al centro di un coprioggetto di vetro precedentemente posto in una piastra di coltura e con una punta 20μl pipetta. Gli permetta di mettere un po &#39;, evitare l&#39;essiccamento. </li><li> Utilizzando una punta 20μl pipetta raccogliere due espianti dal menu Matrigel e metterli in prossimità del deposito desiderato tallone (almeno 1 mm dal bordo del deposito) simmetricamente sui lati opposti. Gli permetta di mettere per non più di 5 minuti a temperatura ambiente. Il momento giusto di passi B e C è fondamentale. Se il tempo è troppo breve porterà a gelificazione incompleta e componenti della configurazione cultura si sposta quando sono coperte con lo strato finale di Matrigel, se il tempo è troppo lungo può provocare oltre ad asciugatura del gel e la creazione di barriere fisiche che impediscono la libera circolazione delle cellule. </li><li> Coprire le perline e l&#39;espianto con uno strato piatto di circa 30μl di Matrigel, estendendolo al di là del espianti (Fig.2). Gli permetta di mettere in incubatrice per circa 15 minuti. </li><li> Aggiungere 2 ml di medium Neurobasal con integratori. </li><li> Incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 / 95% O 2 migratori quotidiana attività di monitoraggio. </li></ol> 4. Vivere l&#39;imaging <ol><li> Dopo incubazione per 3-4 giorni, rivedere le piastre di coltura e scegli coprioggetto di interesse. Il espianti dovrebbe generare una nuvola radiale uniforme delle celle. Sostituire coprioggetto scelto in una piastra di coltura fresco che saranno utilizzati nella diagnostica per immagini dal vivo. </li><li> Lasciate che i coprioggetti siedono nella piastra di nuovo durante la notte. Prima di mettere la piastra sul microscopio per l&#39;imaging, in una cappa di coltura cellulare, utilizzare una spatola sterile per spostare il vetrino in modo da rilasciare qualsiasi microbolle che raccolgono tra il coprioggetti e la piastra di coltura cellulare. Interferenze di bolle rovinerà le immagini. Spostare i coprioggetti al centro del pozzo. </li><li> Per evitare l&#39;evaporazione, riempire lo spazio tra i pozzi con acqua. </li><li> Cura il trasferimento della targa dal cofano colture cellulari al microscopio per non spostare il coprioggetti dal centro del pozzo. </li><li> Definire un sistema di immagine che utilizzano software di imaging. A causa della natura 3D del setup coltivare le cellule anche spostare in senso verticale, quindi è importante raccogliere Z-piani che comprende profondità della nuvola di migrazione. L&#39;estensione XY della zona ripreso dovrebbe essere impostata anche abbastanza grande da coprire aree previsto per essere popolato da cellule migrano nel corso della registrazione, e per contenere il deposito tallone per registrare un orientamento angolare del espianto e la migrazione delle cellule rispetto al la fonte della proteina. Anche considerare che gli aerei più ripreso Z, o la zona più coperta, più tempo ci vuole per registrare un ciclo in un punto particolare momento, costringendo gli intervalli di tempo più lungo tra i campioni e una perdita di risoluzione temporale del monitoraggio delle cellule. Nel nostro caso, utilizzando un obiettivo 10x, lo schema ottimale è stata una registrazione piastrelle 3x3 per ciascuno dei 10 Z-piani distanziati ogni 20μm, a intervalli di 30 minuti. Abbiamo trovato intervalli di 30 minuti il più lungo che permette l&#39;identificazione univoca di cellule in momenti successivi, che è critica per il monitoraggio affidabile dei loro movimenti. </li><li> Avviare lasso di tempo di imaging. </li><li> Dopo il tempo desiderato, rimuovere la piastra e fissare le culture nel 4% paraformaldeide tamponata con fosfato. Può essere utilizzato per ulteriori analisi morfologica ed immunocitochimica. </li></ol> 5. Analisi del movimento <ol><li> Convertire le serie storiche di immagini registrate in un formato più conveniente per ulteriori elaborazioni, TIFF è il più portatile. </li><li> Traccia il movimento delle singole cellule nel corso del tempo attraverso la registrazione delle coordinate XY. Questo può essere fatto utilizzando il software liberamente disponibile come ImageJ (NIH), con un inseguimento manuale plug-in, o qualsiasi altra applicazione commerciali come ImagePro, Volicity or AutoQuant. </li><li> Tracciare i percorsi con Excel o in-house software sviluppato. </li><li> Per ogni cella tracciato calcolare i parametri cinetici come velocità media, curvatura del percorso, la variabilità direzionale nel corso del tempo, ramificazione, la deviazione verso la fonte di proteine, calcoli ecc può essere fatto in MS Excel o qualsiasi foglio di calcolo equivalente. La nostra esperienza indica tuttavia che è molto più produttivo per lo sviluppo in-house script (utilizzando R, Matlab, Python, Perl o altri, Lingue di partenza perlopiù aperta), in quanto permetterebbe una maggiore personalizzazione flessibile e l&#39;inclusione dei metodi analitici più sofisticati rispetto a quelli disponibile in una installazione di base di Excel. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema del anatomiche orin di espianti. Si tratta di un disegno di una fetta coronale di un cervello furetto hemisected. I cerchi grigi indicano la regione da cui sono state prese le espianti. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Schema di un setup cultura. Il deposito tallone è la fonte di proteine, il espianti sono posti su entrambi i lati e tutti gli elementi sono coperti con Matrigel. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Trame corrispondente di tracce cella colorata da quadranti (frecce puntano verso il deposito tallone). Le tracce celle a destra stanno migrando verso frazione D, che sembra attrarre le cellule, le cellule a sinistra stanno migrando verso una frazione, che sembra respingere migrazione delle cellule. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. A) Una serie di immagini selezionate da timepoints mostrando una nuvola crescente di migrazione delle cellule fuori da un espianto. Una cella, ad esempio, indicato da una freccia, viene monitorato attraverso il tempo come di seguito indicato (scala bar 200μm). Questo espianto è stato visualizzato con immagini dal vivo per 38 h. Qui sono immagini di cellule di lasciare il espianto dall&#39;inizio della registrazione delle immagini per l&#39;immagine finale. B) La cella indicato nella parte A, secondo gli orari indicati. La cella mostra ripetitivo ramificazione (scala bar 50 micron).

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	<li>Caviness, V. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cortical+development:+a+view+from+mutations+in+mice.">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li><li>Gelman, D. M., Martini, F. J., N&#243;brega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons.">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li><li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia.">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li><li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., G&#246;tz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis.">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riding+the+glial+monorail:+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain.">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li><li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+neuronal+migration.">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li><li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes.">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li><li>M&#233;tin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Moln&#225;r, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development.">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li><li>Martini, F. J., Valiente, M., L&#243;pez Bendito, G., Szab&#243;, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration.">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li><li>N&#243;brega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Mar&#237;n, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors.">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li><li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+for+neuronal+migration.">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li><li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia.">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+neural+cell+migration.">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li><li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres.">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li><li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex.">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li></ol>

Animale uso: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH USUHS e istituzionali e approvato dal IACUC USUHS.

Qui vi presentiamo un sistema semplice per studiare e analizzare il comportamento migratorio di cellule neurali in risposta a segnali chimici. Nel test di migrazione in vitro sono stati utilizzati per identificare molecole extracellulari interessano la locomozione delle cellule. Il nostro paradigma garantisce che ogni singola cella in esame ha un 3-dimensionale (3D) ambiente con cui interagire. Si tratta di un notevole vantaggio rispetto culture in cui le cellule migrano da espianti sono costretti a spostarsi sulla superficie piatta di poli-D-lisina rivestite coprioggetti, quindi privi di interazioni con la matrice extracellulare (ad esempio Hirschberg et al &#39;10;. 8. Metin et al. &#39;07). Tuttavia rispetto alla scala più ampia di monitoraggio migrazione delle cellule, rimane 2-dimensionale, in quanto le cellule sono costretti a verticalmente lo spazio tra i coprioggetti vetro sul fondo e la superficie superiore di Matrigel, che è relativamente sottile rispetto alla libertà orizzontale della migrazione. Tale impostazione consente una più facile analisi del movimento, che resta ancora essenzialmente 2-dimensionale. Simili paradigmi 3D composto da espianti GE o ri-aggregati di cellule GE incorporati in collagene o Matrigel, precedentemente impiegati, utilizzando aggregati di cellule che esprimono una particolare proteina di segnalazione come fonte di segnali chimici (ad es Liodis et al &#39;07;. Martini et .. al &#39;09;. Nóbrega-Pereira et al &#39;08; Wichterle et al &#39;03).. Il metodo qui presentato utilizza un sistema lento rilascio in forma di sfere di lattice con le proteine ​​aderito a consentire un livello sostenuto nell&#39;ambiente locale, che è superiore rispetto alle proteine ​​aggiunto direttamente al terreno, rendendo il sistema particolarmente adatto quando la quantità di spazio disponibile proteine ​​è limitato o quando una complessa miscela di proteine ​​viene testato. La scelta di perline non è limitato ai prodotti a base di lattice, e comprende anche altri materiali, per esempio perline agarosio, ognuno con caratteristiche diverse. Per aumentare ulteriormente la densità del test, abbiamo utilizzato due espianti apposto al deposito perline su lati opposti. Per garantire una determinata area di provenienza, abbiamo utilizzato espianti eminenza gangliari come fonte di cellule. Abbiamo valutato le differenze in porzioni mediale e laterale del eminenza gangliari, ma non vede alcuna differenza. Dobbiamo sottolineare che questo studio utilizza i furetti, in questa specie le eminenze mediale e laterale gangliari miccia prima che in roditori (Poluch et al &#39;08).. Al momento sono state effettuate le culture (P0) eminenze mediale e laterale gangliari sono stati fusi, anche se molte cellule che popolano la neocorteccia sono ancora in fase generati e la migrazione. Tuttavia, se una fonte veramente omogenea di cellule si preferisce, una sospensione di cellule può essere preparato dal tessuto sezionato e direttamente miscelato con il Matrigel, o, in alternativa centrifugare e un conseguente pellet pugni per rendere &#39;espianti&#39;. L&#39;uso di digestione enzimatica dei tessuti per preparare la sospensione cellulare è sconsigliato, perché anche tracce residue di attività proteolitica può liquefare Matrigel nel corso di esperimento. Inoltre, una due diligence deve essere applicato ai tempi del setup cultura. Anche se Matrigel richiede un periodo di riscaldamento a polimerizzare, anche un periodo un po &#39;prolungato di esposizione di piccole gocce di Matrigel (Ai fini del presente protocollo) per l&#39;aria provoca l&#39;essiccazione e risultati in un guscio che è impenetrabile per le cellule migrano e che non può essere cancellato coprendo successivo con Matrigel fresca.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </td><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Media Neurobasal (1X), liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> Supplemento N-2 (100X), liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 Supplemento (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel Basement Matrix membrana </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, dimensioni 0,5 millimetri </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 69036-05 </td><td> Punch foro </td></tr><tr><td> Verde Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc. </td><td></td><td> Microsfere in lattice </td></tr></tbody></table>

migratory behavior of cells generated in ganglionic eminence cultures

Migrazione delle cellule è un processo comune che porta allo sviluppo e alla maturazione del sistema nervoso centrale dei vertebrati (Hatten, &#39;99). La corteccia cerebrale è costituito da due tipi di base neuronale: eccitatorie e inibitorie. Queste cellule sorgono in aree distinte e migrano verso la corteccia lungo percorsi diversi (Pearlman et al. &#39;98). Interneuroni inibitori migrare tangenzialmente da fonti subcorticali, per lo più provenienti da diverse regioni delle eminenze gangliari (Gelman et al, &#39;09;. Xu et al, &#39;04).. Il loro movimento richiede un controllo preciso spazio-temporali imposti da stimoli ambientali, per consentire la creazione di citoarchitettura corretta e la connettività nella corteccia cerebrale (Caviness e Rakic, &#39;78, Hatten, &#39;90, Rakic, &#39;90). Per studiare il comportamento migratorio di cellule generate in zone proliferativa delle eminenze gangliari (GE) in furetti neonato in vitro, abbiamo utilizzato un 3 arrangiamento tridimensionale la cultura in un Matrigel BD Matrix. La configurazione cultura consisteva di due espianti GE e una fonte di proteine ​​estratte testati dalla corteccia cerebrale ed adsorbito su fluorescente Retrobeads lattice IX posizionato tra la espianti (Hasling et al, &#39;03;. Riddle et al, &#39;97).. Dopo 2-3 giorni di coltura, le cellule iniziano ad apparire sul bordo del espianto mostrando una propensione a lasciare il tessuto in direzione radiale. Dal vivo immagini, gli osservazione dei modelli migratori senza la necessità di etichettatura o la marcatura delle cellule. Se esposto a frazioni della proteina estratto ottenuto dalla corteccia furetto isochronic, le cellule di GE visualizzata comportamenti diversi secondo il giudizio di analisi quantitativa cinetica delle singole cellule in movimento.

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Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Lapse imaging momento della coltura di tessuti 3D permette di studiare il comportamento migratorio delle singole cellule gangliari provenienti da primato in reazione ad estrarre proteine ​​frazionato dalla corteccia cerebrale.

Il comportamento migratorio di cellule generate in Culture Eminenza gangliari

Migration of cells is a common process that leads to the development and maturation of the vertebrate central nervous system (Hatten, '99). The cerebral ...

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

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JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Views.  Uniformed Services University. Lapse imaging momento della coltura di tessuti 3D permette di studiare il comportamento migratorio delle singole cellule gangliari provenienti da primato in reazione ad estrarre proteine ​​frazionato dalla corteccia cerebrale.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Crioconservazione di tessuto corticale blocchi per la generazione di altamente arricchito Culture neuronale

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimolazione Optogenetic del comportamento in Fuga<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging del cavo del mouse spinale

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Metodi per la determinazione strutture UV-riflettenti e determinare la loro importanza nella Mate Preferenze utilizzando il Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has examined the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory. Here we present a protocol that combines mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to examine how mindfulness meditation changes behavioral performance and the neural correlates of episodic memory. Subjects in a mindfulness meditation experimental group were compared to a waitlist control group. Subjects in the mindfulness meditation experimental group spent four weeks training and practicing mindfulness meditation. Mindfulness was measured before and after training using the Five Facet Mindfulness Questionnaire (FFMQ). Episodic memory was measured before and after training using a source recognition task. During the retrieval phase of the source recognition task, EEG was recorded. The results showed that mindfulness, source recognition behavioral performance, and EEG theta power in right frontal and left parietal channels increased following mindfulness meditation training. In addition, increases in mindfulness correlated with increases in theta power in right frontal channels. Therefore, results obtained from combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG reveal the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Here we present a protocol for combining mindfulness meditation training, an episodic memory task, and EEG to understand the behavioral and neural effects of mindfulness meditation on episodic memory.

Combinare il comportamento e l'EEG per studiare gli effetti della meditazione di consapevolezza sulla memoria episodica

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific genes. Multiple means of assessing non-coding DNA and various chromatin states have proven useful in predicting the presence of enhancer sequences in the genome, but validating the activity of these sequences and finding the organs and developmental stages they are active in is a labor-intensive process. Recent advances in adeno-associated virus (AAV) vectors have enabled the widespread delivery of transgenes to mouse tissues, enabling in vivo enhancer testing without necessitating a transgenic animal. This protocol shows how a reporter construct that expresses EGFP under the control of a minimal promoter, which does not drive significant expression on its own, can be used to study the activity patterns of candidate enhancer sequences in the mouse brain. An AAV-packaged reporter construct is delivered to the mouse brain and incubated for 1-4 weeks, after which the animal is sacrificed, and brain sections are observed under a microscope. EGFP appears in cells in which the tested enhancer is sufficient to initiate gene expression, pinpointing the location and developmental stage in which the enhancer is active in the brain. Standard cloning methods, low-cost AAV packaging, and expanding AAV serotypes and methods for in vivo delivery and standard imaging readout make this an accessible approach for the study of how gene expression is regulated in the brain.

AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain

This protocol describes a novel rAAV-based transient enhancer-reporter assay. This assay can be used to induce enhancer-driven expression in vivo in the mouse brain.

Implementazione AAV di costrutti di espressione basati su enhancer in vivo nel cervello di topo

Enhancers are binding platforms for a diverse array of transcription factors that drive specific expression patterns of tissue- and cell-type-specific ...