Il trasporto assonale è vitale per la salute e la vitalità neuronale. Il nostro protocollo descrive un metodo elegante per il monitoraggio e l'analisi del trasporto assonale. E può essere adattato per vari modelli di malattie neuronali.
L'uso di camere microfluidiche consente un preciso controllo temporale spaziale, che è fondamentale per lo studio della biologia assonale. Le anomalie del trasporto assonale sono implicate con diverse malattie neurodegenerative come la SLA. La piattaforma microfluidica consente lo studio dei meccanismi di base e la sperimentazione di terapie per riparare i difetti di trasporto assonale.
La piattaforma a camera microfluidica può essere facilmente adattata per adattarsi a diversi aspetti della ricerca assonale, tra cui la crescita assonale e la degenerazione di vari sottotipi neurali. Questo metodo è complesso e di solito insegnato pratica. La dimostrazione visiva aumenterà l'accessibilità di questa procedura a qualsiasi scienziato interessato a studiare il trasporto assonale.
Inizia lanciando PDMS in stampi primari. Utilizzare aria pressurizzata per rimuovere lo sporco dalla piattaforma del wafer, assicurandosi che i wafer appaiano lisci e chiari prima di procedere. Quindi, riempire un contenitore con azoto liquido e preparare una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 23.
In una cappa chimica, posizionare il wafer contenente la piastra in un contenitore sigillabile e riempire la siringa con due millilitri di azoto liquido per ogni wafer contenente lastra. Aprire una bottiglia di clorotrimetilsilano. Perforare il cappuccio di gomma con la siringa e iniettare l'azoto nella bottiglia.
Senza estrarre l'ago, capovolgere la bottiglia e svantaggiare due millilitri di clorotrimetilsilano per ogni wafer contenente piastra. Stendere il clorotrimetilsilano nel contenitore, ma non direttamente sul wafer contenente lastra. Chiudere il contenitore.
E incubarlo per cinque minuti per wafer. Quindi pesare 47,05 grammi di base PDMS in un tubo da 50 millilitri e aggiungere agente polimerizzante PDMS con un rapporto di 16 a 1 base per polimerizzante per un totale di 50 grammi. Mescolare il PDMS per 10 minuti su un rotatore a bassa velocità, quindi versarlo in ogni wafer contenente la piastra all'altezza desiderata.
Posizionare le piastre all'interno di un essiccatore a vuoto per due ore. Che rimuoverà l'aria intrappolata all'interno del PDMS e formerà uno stampo uniforme chiaro. Successivamente incubare le piastre in un forno per tre ore o durante la notte a 70 Celsius.
Per creare la camera microfluidica o MFC. Tagliare e rimuovere gli stampi PDMS dalla piastra con un bisturi, assicurandosi di non forzare gli stampi perché sono fragili. Seguire le istruzioni nel manoscritto di testo per punzonare e tagliare le camere, a seconda della configurazione sperimentale.
Per la coltura di espianto del midollo spinale, perforare due pozzi di sette millimetri nel lato distale di un MFC di grandi dimensioni, assicurandosi che si sovrappongano ai bordi del canale. Sul lato prossimale, punzonare un pozzo di sette millimetri al centro del canale con sovrapposizione minima, in modo che sia lasciato spazio sufficiente per le espianto. Perforare altri due fori di un millimetro nei due bordi del canale prossimale.
E tagliare il PDMS in camere singole. Quindi ruotare il MFC rivolto verso l'alto e utilizzare un ago calibro 20 per intagliare tre piccole grotte di espianto sul pozzo perforato di sette millimetri. Per la cultura dissociata dei motoneuroni, punzonare quattro pozzi di sei millimetri, ai bordi dei due canali di un piccolo MFC e tagliare il PDMS in singole camere.
Per sterilizzare la MFC, stendere sul banco nastri appiccicosi lunghi 50 centimetri. Quindi premere entrambe le facce della camera sul nastro e tirarlo indietro. Posizionare le camere pulite in una nuova piastra e incubarle in grado analitico, del 70% di etanolo per 10 minuti su uno shaker orbitale.
Smaltire l'etanolo e asciugare le camere in una cappa di coltura tissutale o in un forno a 70 gradi Celsius. Quindi posizionare la camera al centro di un fossato inferiore in vetro di grado coltura tissutale e applicare una forza minore sui bordi per legare il PDMS al fondo del piatto. Incubare il piatto per 10 minuti a 70 gradi Celsius.
Quindi premere sulle camere per rafforzare l'aderenza. Incubare il piatto sotto UV per 10 minuti, quindi procedere alla codifica del MFC. Aggiungere 1,5 nanogrammi per millilitro PLO a entrambi i compartimenti.
Assicurarsi che l'OLP sia in esecuzione attraverso i canali. Pipettando il supporto di rivestimento direttamente all'ingresso del canale. Esaminare MFC al microscopio a luce per verificare la presenza di bolle.
Se le bolle d'aria bloccano le micro scanalature, posizionare MFC in un essiccatore di vuoto per due minuti. Rimuovere l'aria in eccesso dai canali MFC. Quindi incubarlo durante la notte con l'OLP.
Sostituire l'OLP con laminina e incubare MFC per una notte aggiuntiva. Prima della placcatura, lavare la laminina con mezzo di coltura. Sezionare un topo incinta ICR E12.5 e separare gli embrioni dal sacco amniotico.
Mettere l'embrione in piatto di silicio HBSS. Rimuovere la testa e la coda e capovolgerla sulla pancia. Staccare delicatamente la pelle superficiale dagli embrioni indietro, esponendo il midollo spinale.
Separare il midollo spinale dal corpo dalla testa alla coda, usando una pinzetta delicata. Rimuovere le meningi, quindi rimuovere le corna dorsali e tagliare il midollo spinale in sezioni trasversali spesse un millimetro. Eliminare tutto il supporto dal compartimento prossimale della MFC.
Raccogliere un singolo midollo spinale explant con una pipetta, in un volume totale di quattro microlitri. E iniettarlo il più vicino possibile alla grotta. Estraggono il liquido in eccesso dal pozzo prossimale attraverso le prese lateralmente.
Ripetere il passaggio precedente altre due volte e assicurarsi che le espianto siano incorporate nel canale prossimale. Aggiungere lentamente 150 microlitri di mezzo SCEX, al pozzo prossimale. Un giorno dopo la placcatura.
Sostituito il supporto SCEX nel vano prossimale e aggiungere un ricco mezzo SCEX al vano distale. Mantenimento di un gradiente di volume di almeno 15 microlitri per pozzo tra i pozzi distale e prossimale. Dopo quattro o sei giorni, gli assoni devono attraversare il compartimento distale ed essere pronti per l'imaging del trasporto assonale.
Per etichettare i mitocondri e i compartimenti acidi, preparare un mezzo SCEX fresco con 100 nanomolare MitoTracker Deep Red FM e 100 nanomolari LysoTracker Red. E aggiungerlo alle camere microfluidiche. Incubarli per 30-60 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi lavare tre volte con mezzo SCEX caldo. Procedere con l'imaging dal vivo del trasporto assonale. Acquisizione di una serie di immagini time lapse a 100 secondi a intervalli di tre secondi.
Con un totale di cinque minuti per film. Dopo sette giorni in camere microfluidiche. Espianto del midollo spinale HB9 GFP embrionale del topo.
Siamo macchiati di coloranti MitoTracker Deep Red e LysoTracker Red. Etichettare i mitocondri e i compartimenti acidi. Gli assoni nelle scanalature distali sono stati immagini e l'analisi kymograph è stata utilizzata per determinare la distribuzione generale del movimento.
Ciò ha rivelato un pregiudizio nella direzione retrograda solo nei compartimenti acidi della città, ma non nel trasporto mitocondriale. Anche la densità delle particelle è stata quantificata, rivelando un numero maggiore di particelle mitocondriali rispetto ai compartimenti acidi negli assoni di espianto del midollo spinale HB9 GFP. Successivamente, l'analisi del trasporto di singole particelle è stata condotta utilizzando software semi-automatizzato seguito da codice interno.
Questa analisi ha rivelato che i componenti acidi e i mitocondri hanno velocità delle particelle simili. Ma solo i compartimenti acidi mostrano una distorsione verso il movimento retrogrado. Isolare il midollo spinale embrionale può essere difficile all'inizio.
Pratica questa procedura più volte, assicurandoti di utilizzare l'età embrionale corretta e gli strumenti di dissezione appropriati. L'uso delle camere microfluidiche cambia il modo in cui studiamo la biologia assonale. Ci permette di visualizzare processi assonali localizzati, che una volta si ipotizza avvengano solo nel corpo cellulare.
