Koo BK e Mustata RC sono supportati dal Sir Henry Dale Fellowship dal Wellcome Trust e Andersson-Rolf A è sostenuto dal Medical Research Council (MRC). Fink J è supportato dal dottorato di ricerca-programma di 4 anni Wellcome Trust.

Tutti i topi utilizzati nel seguente protocollo sono stati tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutte le procedure sono state eseguite secondo le norme Regno Unito Casa di Office. 1 Preparazione <ol><li> Preparare supporti 1 ora in anticipo di utilizzo (vedi Tabella 1 e la Lista dei Materiali per maggiori dettagli) e pre-caldo in un bagno di 37 ° C acqua almeno 10 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Coltura Piccolo intestinale (SI) organoidi NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni vengono eseguite a 37 ° C, 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Attrezzature e reagenti che entrano in contatto con le cellule viventi devono essere sterili. Pre-riscaldamento della piastra di coltura tissutale è importante in quanto previene la matrice seminterrato (Matrigel o BME) scende da diffondere quando semina. Inoltre, la matrice basamento deve essere mantenuto in ghiaccio in ogni momento. Conservare a -20 ° C e disgeloin ghiaccio prima dell&#39;uso. <ol><li> Isolamento cripte <ol><li> Per l&#39;isolamento del piccolo intestino sacrificare il mouse in base alle norme e ai regolamenti nazionali, quindi posizionare l&#39;animale sul dorso e lavare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Eseguire una linea mediana incisione longitudinale dall&#39;inguine allo sterno. In primo luogo, tagliare la pelle e quindi il tessuto sottocutaneo. Rimuovere il piccolo intestino cieco allo stomaco. Cripte isolati dal duodeno, digiuno e ileo possono essere utilizzati per la coltura organoide. </li><li> Lavare il piccolo intestino isolato con pre-raffreddata Phosphate-Buffered Saline senza calcio e magnesio (PBS0). </li><li> Tagliare il tessuto in pezzi lunghi 3-5 cm e usare le forbici per tagliare aprire longitudinalmente. Stendere il tessuto utilizzando una pinza. </li><li> Raschiare villi con un coprioggetto. Attenzione, troppa forza causerà il tessuto di strappare e ridurrà la resa delle cripte nel seguire passaggi. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenente pre-raffreddata PBS0 Strug pinze. Lavare i frammenti di tessuto attraverso vigorosa agitazione e cambiare il PBS0. Ripetere 2-3 volte o fino a quando il PBS0 diventa meno nuvoloso. </li><li> Incubare il tessuto in una provetta da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 30 min a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente la provetta e trasferire il tessuto ad un altro tubo da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 con 5 mM EDTA. La soluzione 1 mM EDTA (precedentemente contenente il tessuto) conterrà una miscela di cripte e villi. Questa frazione non è adatto per la semina di organoidi quanto spesso contiene un&#39;alta percentuale di villi. </li><li> Incubare il tessuto ulteriormente per 1 ora a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo e raccogliere la soluzione in una provetta pulita da 50 ml. Confermare la presenza di cripte e di stimare il numero, ad esempio, contando cripte in 50 microlitri al microscopio ottico. Calcolare il volume necessario per ottenere 50-100 cripte e trasferirlo ad un 1,5 ml tube. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di matrice seminterrato, e le sementi in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato. Incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. </li><li> Overlay con 500 microlitri di media ENR (vedi Tabella 1). Circa 24 ore dopo la semina i organoidi mostrerà una piccola forma cistica rotonda e dopo altri 2-3 giorni in erba strutture diventano visibili. Modificare i media ENR freschi ogni 3 giorni. </li><li> Passaggio organoide culture ogni 7 giorni. </li></ol></li><li> Passaging e organoidi Gestione <ol><li> Mantenere le organoidi aggiornando media ogni 3 giorni e il passaggio 1: 3 o 1: 5, come il lume si riempie di cellule morte, circa ogni 7 giorni. </li><li> Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo dal pozzo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Meccanicamente dissociare le organoidi attraverso un pipettaggiopproximately 50x con una multa (ad esempio, 200 ml) punta. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150-250 ml di matrice seminterrato. Seed in un pre-riscaldato 24 pozzetti (50 ml di matrice seminterrato / e). Prima della semina pipetta matrice seminterrato su e giù una volta per rivestire la parete della punta. Pipetta lentamente per evitare bolle e seme nel mezzo del pozzo per evitare che la matrice seminterrato diffusione fuori. Si desidera ottenere una cupola di matrice interrato nel centro del pozzo. </li><li> Incubare in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. Overlay con 500 microlitri ENR supporto per pozzetto. </li></ol></li></ol> 3 Pre-Trattamento di infezione SI organoidi NOTA: La figura 1 illustra la procedura di trasduzione. <ol><li> Scambio ENR per ENRWntNic (vedi Tabella 1) medio e crescono le organoidi in til suo mezzo per un minimo di 3 giorni o fino a che non hanno adottato una morfologia cistica. Wnt3a aumenta il numero di cellule staminali e di Paneth mentre Nicotinamide (Nic) migliora l&#39;efficienza cultura. </li></ol> 4. Virus Produzione <ol><li> È necessario uno a 150 mm piatto di cellule Platinum-E per l&#39;infezione. Seme di circa 5 x 10 6 cellule con 15-18 ml di supporti (DMEM + 10% FBS) in presenza di puromicina (1 mg / ml) e blasticidin (10 mcg / ml). Trasfezione le cellule dopo 2-3 giorni, quando hanno raggiunto il 70-80% di confluenza. Modificare il medio DMEM + 10% FBS, senza puromicina e blasticidin prima di trasfezione. </li><li> Aggiungere 30 mg di costrutto di DNA retrovirale e 240 ml di polietilenimmina (PEI) per separare le provette contenenti 1 ml di Opti-MEM. Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Si riuniscono le due soluzioni ed incubare a temperatura ambiente per 20-30 min. Aggiungere la miscela completa al mezzo di cellule Platinum-E e agitare accuratamente il plate al fine di garantire un&#39;equa distribuzione dei complessi DNA-PEI. </li><li> Incubare le cellule Platinum-E con la miscela di trasfezione durante la notte e aggiornare il medio il giorno seguente. Conservare le cellule del nuovo mezzo per 2 giorni. </li><li> Raccogliere solo il mezzo in un tubo Falcon da 50 ml, passa attraverso un filtro da 0,45 micron e centrifugare a 8000 xga 4 ° C per 12-16 ore. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di trasduzione media (vedi Tabella 1). </li></ol> 5. organoide Frammento Preparazione <ol><li> Per una infezione è necessario un pozzetto da una piastra da 24 pozzetti. Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Utilizzare una punta di volume più fine (ad esempio, 200 consigli microlitri) per distruggere meccanicamente i organoidi attraverso pipettaggio (30-50x). La soluzione diventerà torbida e non interi organoidi dovrebbe essere visibile. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min<html> . </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 ml di coltura cellulare di grado proteasi ricombinante (ad esempio, TrypLE). Incubare a 37 ° C per 5 min. Dopo incubazione verificare la dimensione dei frammenti organoide utilizzando la microscopia ottica, contando il numero di cellule per frammento. Frammenti contenenti 5-10 cellule sono l&#39;ideale. Se la maggior parte dei frammenti contiene un numero elevato di celle del tempo di incubazione può essere aumentata di 2 minuti alla volta. </li><li> Terminare il processo di dissociazione con l&#39;aggiunta di 500 ml di ENR media. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet in ghiaccio o 4 ° C. </li></ol> 6. trasduzione retrovirale <ol><li> Unire frammenti organoide con 250 microlitri della soluzione retrovirale (da paragrafo 4.5) in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Mescolare delicatamente pipettando lento utilizzando 1 ml di punta Pipetman. </li><li> Sigillare la piastra con Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e placcatura <ol><li> Centrifugare la piastra a 32 ° C, 600 xg, per 1 ora. Rimuovere con attenzione il Parafilm e incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 6 ore. </li></ol> 8 Semina di infetti organoide Frammenti <ol><li> Trasferire i frammenti organoide infetti e media trasduzione dal pozzo in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 900 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e mettere il tubo contenente il pellet in ghiaccio per 5 minuti a raffreddare. Aggiungere 100 ml di matrice seminterrato e risospendere il pellet pipettando lentamente su e giù. </li><li> Gocce di semi di &#39;interrato matrice -cell mix&#39; di 50 microlitri di una nuova piastra da 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per 5-15 minuti fino a quando i solidifica matrice seminterrato. </li><li> Aggiungi mezzi di trasduzione, senza polibrene ai pozzetti e incubare la piastra in un incubatore coltura di tessuti. Modificare i media ogni 2-3 giorni. </li></ol> 9 Selezione <ol><li> Inizia SEcolta dopo 2-3 giorni con l&#39;aggiunta puromicina (1 mg / ml) per il supporto. </li><li> Quando i frammenti stanno iniziando a formare organoidi sostituire il supporto di trasduzione con i media ENR integrato con puromicina (1 mg / ml). </li></ol> 10 post-infezione Trattamento di SI organoidi <ol><li> Cultura trasduzione organoidi secondo il &quot;Passaging e mantenere organoidi&quot; protocollo (punto 2.2.1). Dopo 1-2 settimane i organoidi SI potranno ritrovare le loro strutture in erba. </li><li> A seguito della comparsa di strutture in erba indurre l&#39;espressione di miRNA o cDNA aggiungendo 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in una concentrazione di 1 mM di lavoro. Si noti che questo passo è valida solo se si utilizza vettori retrovirali da Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), e pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) e organoidi esprimono Cre-ERT2. </li></ol> 11 Conferma di infezione e ExprESSIONE / Soppressione del gene di interesse <ol><li> Se si utilizzano vettori retrovirali da Addgene (32702, 32703 e 32704) efficienza di trasduzione può essere confermata dall&#39;osservazione di espressione DsRed. Inoltre, l&#39;espressione o la soppressione del gene di interesse possono essere confermati dal Western Blot, utilizzando la GFP o 3xHA epitopo (per la sovraespressione del gene) e qPCR (per gene knockdown), come esemplificato nella Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Per ottenere alta efficienza di trasduzione alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è il pre-trattamento dei organoidi con ENRWntNic supporti fino a che non adottano una forma cistica rotonda. Questo aumenta il numero di cellule staminali e quindi la possibilità di ottenere una integrazione stabile del transgene, oltre ad aumentare il tasso di sopravvivenza dei organoidi SI tutta la procedura di trasduzione. Un altro parametro è il tempo di incubazione seguente spinoculation. Risultati di incubazione troppo corto o troppo lungo in cattiva efficienza di trasduzione e la scarsa sopravvivenza dei organoidi rispettivamente. Il passo spinoculation non è essenziale anche se aumenta significativamente la percentuale di organoidi trasdotte. Infine, il virus ad alto titolo è la chiave per la trasduzione di successo. Questo dipende dal tipo di linea cellulare di packaging e virus. La combinazione della linea cellulare Platinum-E e murina virus di cellule staminali (MSCV), è stato trovato per produrre un titolo abbastanza alto per la trasduzione di organoidi. ve_content &quot;&gt; Di seguito sono riportati suggerimenti per la risoluzione dei problemi che possono contribuire al raggiungimento di trasduzione di successo. Innanzitutto, se la trasfezione della linea cellulare di packaging è scarsa, assicurarsi che la confluenza delle cellule è tra il 70-80% e che il tempo di incubazione della miscela pool PEI-DNA è tra 20-30 min. La sopravvivenza dei organoidi durante trasduzione altamente dipende dalla dimensione del frammento. Troppo lungo tripsinizzazione causa la maggior parte dei frammenti di consistere in meno di 3 cellule e di conseguenza diminuisce la sopravvivenza organoide. altro fattore è l&#39;attività del mezzo Wnt condizionato, se l&#39;attività è troppo basso amplificando attraverso aggiunta di CHIR99021 in una concentrazione di lavoro di 5 micron possono aumentare la sopravvivenza. CHIR99021 inibisce GSK3, con conseguente aumento di segnalazione Wnt. Inoltre, Y-27362, che impedisce anoikis si aggiunge ai media di trasduzione per migliorare la sopravvivenza organoide, dal momento che i organoidi sono interrotti a frammenti (contenenti 1-10 cellule) prima di trasduzione. come60, citato sopra, il tempo di incubazione dopo spinoculation non deve superare i 6 ore. Infine, se il povero trasduzione si osserva dovrebbero essere considerati i fattori di cui sopra che influenzano il titolo virale e il limite di dimensione dell&#39;inserto per il vettore retrovirale. L&#39;efficienza del knockdown è fortemente dipendente dalla miRNA. Poiché l&#39;efficienza varia con la combinazione del gene bersaglio e miRNA è opportuno eseguire una schermata efficienza per identificare quelli che funzionano meglio. La tecnica è limitata ai fenomeni epiteliali del sistema organoide. In futuro potrebbe essere possibile studiare malattie infettive o immuno-mediate attraverso la co-coltura di patogeni o di ricostituzione con componenti derivati ​​dal sistema immunitario, rispettivamente. Inoltre, i retrovirus possono trasportare solo inserti di dimensioni relativamente ridotte. Di conseguenza, naturali regioni regolatorie devono essere esclusi e quindi l&#39;espressione del transgene non può imitare quella diil gene endogeno. Come accennato in precedenza, l&#39;efficienza atterramento dipende dal gene bersaglio e miRNA. Se nessun miRNA con idoneo efficienza smontabile può essere giudicata può limitare l&#39;uso della tecnica per quel particolare gene bersaglio. Teoricamente, organoidi sono compatibili con tutte le tecniche manipolative standardizzate utilizzate per linee cellulari. Trasduzione retrovirale è stato il primo metodo da segnalare 4, e recentemente BAC (cromosoma artificiale batterico) -transgenesis è diventato disponibile 5. Con un tempo totale di generazione di 2-3 settimane, dopo trasfezione del plasmide virale nella linea cellulare di packaging, è significativamente più veloce rispetto alla generazione di un transgenico (tg) topo. Mantenendo in vivo cripta-villo architettura mentre contenente cellule staminali così come tutte le linee cellulari differenziate dell&#39;epitelio intestinale, il sistema di coltura organoide colma il divario tra tg animali e colture cellulari precedentemente utilizzato. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per eseguire l&#39;analisi fenotipica di epitelio endodermico in vitro attraverso GAIN- e in perdita di studi di funzione. Ciò rende possibile affrontare questioni fisiologicamente rilevanti in adulto biologia delle cellule staminali, con un bisogno minimo di topi tg. Ad esempio, la generazione di topi knockout condizionali potrebbe essere evitato utilizzando organoidi derivati ​​da mutanti neonati con mortalità perinatale 6. Inoltre, la tecnica può essere applicata a organoidi derivate da topi knockout precedentemente stabiliti per studiare il ruolo di paralogues effettuando ulteriori 7,8 smontabile. Dopo la creazione di piccole organoidi intestinali, adattamento del protocollo di cultura originale ha permesso coltura del pancreas, del fegato, del colon e dello stomaco epiteli 9-11. Inoltre, organoidi intestinali umani e organoidi tumorali sono stati derivati ​​da normali biopsie umane, primario adenoma e il cancro del colon-retto 10 biopsie. Il protocollo infezione virale può essere facilmente esteso a questi tipi di organoidi e fornisce un modo senza precedenti di eseguire studi funzionali nei tessuti di derivazione umana. Nel loro insieme, trasduzione retrovirale di piccole organoidi intestinale è una risorsa preziosa per lo studio delle cellule staminali manutenzione, la differenziazione, e la decisione il destino delle cellule, così come le interazioni di segnalazione cellulare e la cellula cellulare.

High-throughput genetica funzionali è necessario per aumentare la nostra comprensione biologica del corpo, per migliorare la corrente di scienza di base e la medicina. Genetica del mouse è stato il gold standard per lo studio della funzione genica in vivo, anche se è sia in termini di tempo e costosa. Le linee cellulari, essendo l&#39;altra scelta comune, hanno pur essendo meno costoso di una maggiore capacità di throughput. Tuttavia, essi sono impediti dalla loro incapacità di riprodurre il corretto microambiente e quindi le risposte fisiologiche visto in vivo. Quindi, vi è una necessità univoca per un facile da maneggiare sistema modello, che permette di costo / tempo-efficiente high throughput analisi mentre imitando le risposte fisiologiche osservate in vivo esperimenti transgenici (Tg) del mouse in. Per l&#39;epitelio endodermico un tale sistema modello apparso nel 2009 1. Tra le conoscenze acquisite con la scoperta delle cellule staminali intestinali Lgr5-positivi è statainformazioni sulla nicchia corrispondente ai fattori extracellulari della matrice e crescita necessarie per la manutenzione delle cellule staminali. Utilizzando queste informazioni è stato possibile stabilire &quot;mini-guts &#39;noto anche come organoidi 2. Recentemente una nomenclatura consenso per le culture in vitro, dove organoidi sono indicati come &quot;enteroids&quot;, è stato suggerito 3. Come linee cellulari, le organoidi sono in continua espansione e facile da trattare con leganti e inibitori. Tuttavia, invece di essere bidimensionali sono strutture tridimensionali di auto-organizzazione che mantengono l&#39;organizzazione cripta-villo così come le cellule staminali e linee cellulari differenziate del piccolo intestino (SI). Organoidi costituiti da un singolo strato di cellule epiteliali che circondano un&#39;area luminale. Sporgenti strutture in erba corrispondono alle piccole cripte intestinali contenenti compartimento delle cellule staminali. Partendo dalla punta della struttura germogliamento cellule progenitrici differenziano in quanto MIgrattugiare verso il rivestimento epiteliale, dove le cellule terminalmente differenziate sono capannone nel lume. Rispetto a linee cellulari, questo sistema ex vivo ricapitola più strettamente la normale fisiologia ed è quindi un sistema modello promettente per la piccola epitelio intestinale. In questo protocollo video di trasduzione retrovirale, vi presentiamo un metodo che consente di ex vivo studi di funzione genica in questo romanzo sistema di coltura organoide. Iniziamo descrivendo organoide cultura in un modo step-by-step, e continuiamo dimostrando la generazione di retrovirus seguita dalla procedura di trasduzione. Infine, vi è una sezione per ulteriori consigli per la risoluzione dei problemi. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere combinato con l&#39;imaging dal vivo o screening di farmaci per studiare omeostasi, decisioni destino delle cellule e le interazioni cellula-cellula a livello dell&#39;epitelio intestinale. Grazie alla loro architettura semplice e tasso di turnover veloce, organoidi rappresentano un modello ideale system per lo studio della biologia delle cellule staminali adulte. Inoltre trasduzione retrovirale può essere applicato a organoidi derivate da topi transgenici prestabiliti nonché campioni umani dei pazienti. Con l&#39;avvicinarsi del knock-in e knock-out non possono essere estesi agli esseri umani, i organoidi umano SI costituiscono un&#39;alternativa attraente. In sintesi, la manipolazione genetica attraverso la trasduzione retrovirale permette l&#39;analisi fenotipica in piccoli organoidi intestinali derivati ​​da topi o campioni di tessuti umani, integrando in tal modo la genetica del mouse e linee cellulari durante l&#39;apertura di nuove strade per gli studi nei tessuti di derivazione umana. Trasduzione retrovirale consente GAIN- e la perdita-di-funzione studi da eseguire nel sistema di coltura organoide 4. Questo lo rende una risorsa preziosa per lo studio della funzione genica, adulto biologia delle cellule staminali e la malattia pur essendo in conformità con le tre R (riduzione, perfezionamento e sostituzione).

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement 100x&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylcysteine 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse EGF 500 &amp;micro;g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &amp;micro;g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Wnt conditioned medium</td><td></td><td></td><td>The conditioned media is generated from L cells, for details see Sato and Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &amp;micro;M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (8 &amp;micro;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02)&lt;br/&gt; supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td></tr><tr><td>24-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Platinum-E cells</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Cellule staminali Lgr5-positivi possono essere integrati con la crescita essenziale fattori FEG Noggin, e R-spondina, che ci permette di cultura in continua espansione delle strutture epiteliali 3D primarie in vitro. Sia l&#39;architettura e fisiologiche proprietà di questi &quot;mini-coraggio&quot;, chiamati anche organoidi, molto simili alle loro controparti in vivo. Questo li rende un sistema modello interessante per le piccole epitelio intestinale fa. Utilizzando trasduzione retrovirale, la genetica funzionali possono ora essere eseguite da sovraespressione del gene condizionale o knockdown. Questo video illustra la procedura di cultura organoide, la generazione dei retrovirus, e la trasduzione retrovirale di organoidi per assistere analisi fenotipica del piccolo epitelio intestinale in vitro. Questo nuovo sistema modello organotipica in combinazione con l&#39;espressione retrovirale genica mediata fornisce un valido strumento per una rapida analisi della funzione genica in vitro senza bisogno di costlGenerazione Y e in termini di tempo per gli animali transgenici.

Organoidi sono pronti per essere raggruppati quando il lume centrale è oscurato a causa della presenza di cellule morte (Figura 2). Dopo 2-3 giorni di organoidi pre-trattamento dovrebbe adottare una morfologia cistica turno (Figura 3). Questo aumenta il numero di cellule staminali, aumentando le possibilità di ottenere integrazione stabile. Le dimensioni del pellet virale può variare dalla centrifugazione del surnatante virale, molto probabilmente a causa di variazioni contributo di detriti cellulari alle dimensioni del pellet. È stata osservata alcuna chiara correlazione di efficienza di trasduzione. Durante la procedura di selezione organoidi non trasdotte moriranno, mentre quelle con una integrazione stabile rimarrà. La proteina fluorescente da retrovirus MSCV-eGFP può essere osservato in cellule provenienti da organoidi superstiti, che hanno una morfologia cistica, entro 2-3 giorni dopo la trasduzione (Figura 4). <img alt<html> = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1 Un disegno schematico della procedura di trasduzione retrovirale. Prima di organoidi infezione sono pre-trattati con ENRWntNic fino a che non adottano una struttura cistica (step 1). Cellule Platinum-E sono utilizzati come la linea cellulare di packaging, e sono coltivate fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Successivamente vengono trasfettate con il costrutto retrovirale con PEI. I virus sono raccolte 2 giorni più tardi (fase 2). Organoidi sono tripsinizzate per ottenere frammenti contenenti 1-10 cellule (fase 3), e vengono quindi infettate (punto 4). Dopo spinoculation per aumentare l&#39;efficienza di infezione (punto 5), i frammenti organoide infetti vengono seminate (fase 6) e 2-3 giorni dopo la selezione di cloni positivi con l&#39;integrazione stabile può essere eseguita (punto 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 2 Immagine rappresentativa della organoidi dopo 4-6 giorni di coltura. Il lume è pieno di cellule morte, facendolo apparire scuro. Organoidi in questa fase sono pronti per essere diversi passaggi. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali coltivate in ENRWntNic mezzi per 3-4 giorni. Le organoidi adottare una morfologia cistica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali (a) che mostrano l&#39;espressione del transgene virale (B, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotici 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo ENRWntNic (per 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 2 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina Conditioned medio </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a terreno condizionato </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1 M) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo di trasduzione (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Preparare fresco </td></tr><tr><td> ENRWntNic medio </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 micron) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> Polybrene (8 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR mezzo (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td&gt; </tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina terreno condizionato </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Supporti per le celle Platinum-E (per 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 12 settimane </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 mg / ml) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 mg / ml) </td><td> 500 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. composizione media avanzata DMEM / F12 +++, ENRWntNic medio, medio trasduzione, ENR media, e medio per le cellule Platinum-E.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Views.  University of Cambridge.  Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello. 

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Ricerca

Medicina

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to manipulate gene expression in organoids have made limited progress in this arena. While CRISPR/Cas9 technology allows for precise genome editing of cells for organoid generation, this strategy requires extensive selection and screening by sequence analysis, which is both time-consuming and costly. Here, we provide a detailed protocol for efficient viral transduction of intestinal organoids. This approach is rapid and highly efficient, thus decreasing the time and expense inherent in CRISPR/Cas9 technology. We also present a protocol to generate frozen sections from intact organoid cultures for further analysis with immunohistochemical or immunofluorescent staining, which can be used to confirm gene expression or silencing. After successful transduction of viral vectors for gene expression or silencing is achieved, intestinal stem cell and crypt function can be rapidly assessed. Although most organoid studies employ in vitro assays, organoids can also be delivered to mice for in vivo functional analyses. Moreover, our approaches are advantageous for predicting therapeutic responses to drugs because currently available therapies generally function by modulating gene expression or protein function rather than altering the genome.

We describe step-by-step instructions to: 1) efficiently engineer intestinal organoids using magnetic nanoparticles for lenti- or retroviral transduction, and, 2) generate frozen sections from engineered organoids. This approach provides a powerful tool to efficiently alter gene expression in organoids for investigation of downstream effects.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Biologia dello sviluppo

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Immunologia e infezioni

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived from all sections of the GI tract (gastric, jejunum, duodenum, ileum, colon, rectum) and, upon differentiation, contain most of the cell types that are naturally found in each individual section. For example, intestinal organoids contain nutrient-absorbing enterocytes, secretory cells (Goblet, Paneth, and enteroendocrine), stem cells, as well as all lineage-specific differentiation intermediates (e.g.,&#160;early or immature cell types). The greatest advantage in using gastrointestinal tract-derived organoids to study infectious diseases is the possibility of precisely identifying which cell type is targeted by the enteric pathogen and to address whether the different sections of the gastrointestinal tract and their specific cell types similarly respond to pathogen challenges. Over the past years, gastrointestinal models, as well as organoids from other tissues, have been employed to study viral tropism and the mechanisms of pathogenesis. However, utilizing all the advantages of using organoids when employing highly pathogenic viruses represents a technical challenge and requires strict biosafety considerations. Additionally, as organoids are often grown in three dimensions, the basolateral side of the cells is facing the outside of the organoid while their apical side is facing the inside (lumen) of the organoids. This organization poses a challenge for enteric pathogens as many enteric infections initiate from the apical/luminal side of the cells following ingestion. The following manuscript will provide a comprehensive protocol to prepare human intestinal organoids for infection with enteric pathogens by considering the infection side (apical vs. basolateral) to perform single-cell RNA sequencing to characterize cell-type-specific host/pathogen interactions. This method details the preparation of the organoids as well as the considerations needed to perform this work under biosafety level 3 (BSL-3) containment conditions.

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 BSL-3 Conditions

This protocol describes how to infect human intestinal organoids from either their apical or basolateral side to characterize host/pathogen interactions at the single-cell level using single-cell RNA sequencing (scRNAseq) technology.

Adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Imaging del calcio di monostrati di organoidi intestinali umani infetti da virus

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Autore in primo piano: Indagine sull'interruzione virale della segnalazione epiteliale intestinale - Approfondimenti di ricerca e direzioni future 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

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Riepilogo

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