Koo BK e Mustata RC sono supportati dal Sir Henry Dale Fellowship dal Wellcome Trust e Andersson-Rolf A è sostenuto dal Medical Research Council (MRC). Fink J è supportato dal dottorato di ricerca-programma di 4 anni Wellcome Trust.

Tutti i topi utilizzati nel seguente protocollo sono stati tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutte le procedure sono state eseguite secondo le norme Regno Unito Casa di Office. 1 Preparazione <ol><li> Preparare supporti 1 ora in anticipo di utilizzo (vedi Tabella 1 e la Lista dei Materiali per maggiori dettagli) e pre-caldo in un bagno di 37 ° C acqua almeno 10 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Coltura Piccolo intestinale (SI) organoidi NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni vengono eseguite a 37 ° C, 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Attrezzature e reagenti che entrano in contatto con le cellule viventi devono essere sterili. Pre-riscaldamento della piastra di coltura tissutale è importante in quanto previene la matrice seminterrato (Matrigel o BME) scende da diffondere quando semina. Inoltre, la matrice basamento deve essere mantenuto in ghiaccio in ogni momento. Conservare a -20 ° C e disgeloin ghiaccio prima dell&#39;uso. <ol><li> Isolamento cripte <ol><li> Per l&#39;isolamento del piccolo intestino sacrificare il mouse in base alle norme e ai regolamenti nazionali, quindi posizionare l&#39;animale sul dorso e lavare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Eseguire una linea mediana incisione longitudinale dall&#39;inguine allo sterno. In primo luogo, tagliare la pelle e quindi il tessuto sottocutaneo. Rimuovere il piccolo intestino cieco allo stomaco. Cripte isolati dal duodeno, digiuno e ileo possono essere utilizzati per la coltura organoide. </li><li> Lavare il piccolo intestino isolato con pre-raffreddata Phosphate-Buffered Saline senza calcio e magnesio (PBS0). </li><li> Tagliare il tessuto in pezzi lunghi 3-5 cm e usare le forbici per tagliare aprire longitudinalmente. Stendere il tessuto utilizzando una pinza. </li><li> Raschiare villi con un coprioggetto. Attenzione, troppa forza causerà il tessuto di strappare e ridurrà la resa delle cripte nel seguire passaggi. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenente pre-raffreddata PBS0 Strug pinze. Lavare i frammenti di tessuto attraverso vigorosa agitazione e cambiare il PBS0. Ripetere 2-3 volte o fino a quando il PBS0 diventa meno nuvoloso. </li><li> Incubare il tessuto in una provetta da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 30 min a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente la provetta e trasferire il tessuto ad un altro tubo da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 con 5 mM EDTA. La soluzione 1 mM EDTA (precedentemente contenente il tessuto) conterrà una miscela di cripte e villi. Questa frazione non è adatto per la semina di organoidi quanto spesso contiene un&#39;alta percentuale di villi. </li><li> Incubare il tessuto ulteriormente per 1 ora a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo e raccogliere la soluzione in una provetta pulita da 50 ml. Confermare la presenza di cripte e di stimare il numero, ad esempio, contando cripte in 50 microlitri al microscopio ottico. Calcolare il volume necessario per ottenere 50-100 cripte e trasferirlo ad un 1,5 ml tube. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di matrice seminterrato, e le sementi in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato. Incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. </li><li> Overlay con 500 microlitri di media ENR (vedi Tabella 1). Circa 24 ore dopo la semina i organoidi mostrerà una piccola forma cistica rotonda e dopo altri 2-3 giorni in erba strutture diventano visibili. Modificare i media ENR freschi ogni 3 giorni. </li><li> Passaggio organoide culture ogni 7 giorni. </li></ol></li><li> Passaging e organoidi Gestione <ol><li> Mantenere le organoidi aggiornando media ogni 3 giorni e il passaggio 1: 3 o 1: 5, come il lume si riempie di cellule morte, circa ogni 7 giorni. </li><li> Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo dal pozzo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Meccanicamente dissociare le organoidi attraverso un pipettaggiopproximately 50x con una multa (ad esempio, 200 ml) punta. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150-250 ml di matrice seminterrato. Seed in un pre-riscaldato 24 pozzetti (50 ml di matrice seminterrato / e). Prima della semina pipetta matrice seminterrato su e giù una volta per rivestire la parete della punta. Pipetta lentamente per evitare bolle e seme nel mezzo del pozzo per evitare che la matrice seminterrato diffusione fuori. Si desidera ottenere una cupola di matrice interrato nel centro del pozzo. </li><li> Incubare in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. Overlay con 500 microlitri ENR supporto per pozzetto. </li></ol></li></ol> 3 Pre-Trattamento di infezione SI organoidi NOTA: La figura 1 illustra la procedura di trasduzione. <ol><li> Scambio ENR per ENRWntNic (vedi Tabella 1) medio e crescono le organoidi in til suo mezzo per un minimo di 3 giorni o fino a che non hanno adottato una morfologia cistica. Wnt3a aumenta il numero di cellule staminali e di Paneth mentre Nicotinamide (Nic) migliora l&#39;efficienza cultura. </li></ol> 4. Virus Produzione <ol><li> È necessario uno a 150 mm piatto di cellule Platinum-E per l&#39;infezione. Seme di circa 5 x 10 6 cellule con 15-18 ml di supporti (DMEM + 10% FBS) in presenza di puromicina (1 mg / ml) e blasticidin (10 mcg / ml). Trasfezione le cellule dopo 2-3 giorni, quando hanno raggiunto il 70-80% di confluenza. Modificare il medio DMEM + 10% FBS, senza puromicina e blasticidin prima di trasfezione. </li><li> Aggiungere 30 mg di costrutto di DNA retrovirale e 240 ml di polietilenimmina (PEI) per separare le provette contenenti 1 ml di Opti-MEM. Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Si riuniscono le due soluzioni ed incubare a temperatura ambiente per 20-30 min. Aggiungere la miscela completa al mezzo di cellule Platinum-E e agitare accuratamente il plate al fine di garantire un&#39;equa distribuzione dei complessi DNA-PEI. </li><li> Incubare le cellule Platinum-E con la miscela di trasfezione durante la notte e aggiornare il medio il giorno seguente. Conservare le cellule del nuovo mezzo per 2 giorni. </li><li> Raccogliere solo il mezzo in un tubo Falcon da 50 ml, passa attraverso un filtro da 0,45 micron e centrifugare a 8000 xga 4 ° C per 12-16 ore. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di trasduzione media (vedi Tabella 1). </li></ol> 5. organoide Frammento Preparazione <ol><li> Per una infezione è necessario un pozzetto da una piastra da 24 pozzetti. Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Utilizzare una punta di volume più fine (ad esempio, 200 consigli microlitri) per distruggere meccanicamente i organoidi attraverso pipettaggio (30-50x). La soluzione diventerà torbida e non interi organoidi dovrebbe essere visibile. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min<html> . </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 ml di coltura cellulare di grado proteasi ricombinante (ad esempio, TrypLE). Incubare a 37 ° C per 5 min. Dopo incubazione verificare la dimensione dei frammenti organoide utilizzando la microscopia ottica, contando il numero di cellule per frammento. Frammenti contenenti 5-10 cellule sono l&#39;ideale. Se la maggior parte dei frammenti contiene un numero elevato di celle del tempo di incubazione può essere aumentata di 2 minuti alla volta. </li><li> Terminare il processo di dissociazione con l&#39;aggiunta di 500 ml di ENR media. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet in ghiaccio o 4 ° C. </li></ol> 6. trasduzione retrovirale <ol><li> Unire frammenti organoide con 250 microlitri della soluzione retrovirale (da paragrafo 4.5) in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Mescolare delicatamente pipettando lento utilizzando 1 ml di punta Pipetman. </li><li> Sigillare la piastra con Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e placcatura <ol><li> Centrifugare la piastra a 32 ° C, 600 xg, per 1 ora. Rimuovere con attenzione il Parafilm e incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 6 ore. </li></ol> 8 Semina di infetti organoide Frammenti <ol><li> Trasferire i frammenti organoide infetti e media trasduzione dal pozzo in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 900 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e mettere il tubo contenente il pellet in ghiaccio per 5 minuti a raffreddare. Aggiungere 100 ml di matrice seminterrato e risospendere il pellet pipettando lentamente su e giù. </li><li> Gocce di semi di &#39;interrato matrice -cell mix&#39; di 50 microlitri di una nuova piastra da 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per 5-15 minuti fino a quando i solidifica matrice seminterrato. </li><li> Aggiungi mezzi di trasduzione, senza polibrene ai pozzetti e incubare la piastra in un incubatore coltura di tessuti. Modificare i media ogni 2-3 giorni. </li></ol> 9 Selezione <ol><li> Inizia SEcolta dopo 2-3 giorni con l&#39;aggiunta puromicina (1 mg / ml) per il supporto. </li><li> Quando i frammenti stanno iniziando a formare organoidi sostituire il supporto di trasduzione con i media ENR integrato con puromicina (1 mg / ml). </li></ol> 10 post-infezione Trattamento di SI organoidi <ol><li> Cultura trasduzione organoidi secondo il &quot;Passaging e mantenere organoidi&quot; protocollo (punto 2.2.1). Dopo 1-2 settimane i organoidi SI potranno ritrovare le loro strutture in erba. </li><li> A seguito della comparsa di strutture in erba indurre l&#39;espressione di miRNA o cDNA aggiungendo 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in una concentrazione di 1 mM di lavoro. Si noti che questo passo è valida solo se si utilizza vettori retrovirali da Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), e pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) e organoidi esprimono Cre-ERT2. </li></ol> 11 Conferma di infezione e ExprESSIONE / Soppressione del gene di interesse <ol><li> Se si utilizzano vettori retrovirali da Addgene (32702, 32703 e 32704) efficienza di trasduzione può essere confermata dall&#39;osservazione di espressione DsRed. Inoltre, l&#39;espressione o la soppressione del gene di interesse possono essere confermati dal Western Blot, utilizzando la GFP o 3xHA epitopo (per la sovraespressione del gene) e qPCR (per gene knockdown), come esemplificato nella Koo et al 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html> Per ottenere alta efficienza di trasduzione alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è il pre-trattamento dei organoidi con ENRWntNic supporti fino a che non adottano una forma cistica rotonda. Questo aumenta il numero di cellule staminali e quindi la possibilità di ottenere una integrazione stabile del transgene, oltre ad aumentare il tasso di sopravvivenza dei organoidi SI tutta la procedura di trasduzione. Un altro parametro è il tempo di incubazione seguente spinoculation. Risultati di incubazione troppo corto o troppo lungo in cattiva efficienza di trasduzione e la scarsa sopravvivenza dei organoidi rispettivamente. Il passo spinoculation non è essenziale anche se aumenta significativamente la percentuale di organoidi trasdotte. Infine, il virus ad alto titolo è la chiave per la trasduzione di successo. Questo dipende dal tipo di linea cellulare di packaging e virus. La combinazione della linea cellulare Platinum-E e murina virus di cellule staminali (MSCV), è stato trovato per produrre un titolo abbastanza alto per la trasduzione di organoidi. ve_content &quot;&gt; Di seguito sono riportati suggerimenti per la risoluzione dei problemi che possono contribuire al raggiungimento di trasduzione di successo. Innanzitutto, se la trasfezione della linea cellulare di packaging è scarsa, assicurarsi che la confluenza delle cellule è tra il 70-80% e che il tempo di incubazione della miscela pool PEI-DNA è tra 20-30 min. La sopravvivenza dei organoidi durante trasduzione altamente dipende dalla dimensione del frammento. Troppo lungo tripsinizzazione causa la maggior parte dei frammenti di consistere in meno di 3 cellule e di conseguenza diminuisce la sopravvivenza organoide. altro fattore è l&#39;attività del mezzo Wnt condizionato, se l&#39;attività è troppo basso amplificando attraverso aggiunta di CHIR99021 in una concentrazione di lavoro di 5 micron possono aumentare la sopravvivenza. CHIR99021 inibisce GSK3, con conseguente aumento di segnalazione Wnt. Inoltre, Y-27362, che impedisce anoikis si aggiunge ai media di trasduzione per migliorare la sopravvivenza organoide, dal momento che i organoidi sono interrotti a frammenti (contenenti 1-10 cellule) prima di trasduzione. come60, citato sopra, il tempo di incubazione dopo spinoculation non deve superare i 6 ore. Infine, se il povero trasduzione si osserva dovrebbero essere considerati i fattori di cui sopra che influenzano il titolo virale e il limite di dimensione dell&#39;inserto per il vettore retrovirale. L&#39;efficienza del knockdown è fortemente dipendente dalla miRNA. Poiché l&#39;efficienza varia con la combinazione del gene bersaglio e miRNA è opportuno eseguire una schermata efficienza per identificare quelli che funzionano meglio. La tecnica è limitata ai fenomeni epiteliali del sistema organoide. In futuro potrebbe essere possibile studiare malattie infettive o immuno-mediate attraverso la co-coltura di patogeni o di ricostituzione con componenti derivati ​​dal sistema immunitario, rispettivamente. Inoltre, i retrovirus possono trasportare solo inserti di dimensioni relativamente ridotte. Di conseguenza, naturali regioni regolatorie devono essere esclusi e quindi l&#39;espressione del transgene non può imitare quella diil gene endogeno. Come accennato in precedenza, l&#39;efficienza atterramento dipende dal gene bersaglio e miRNA. Se nessun miRNA con idoneo efficienza smontabile può essere giudicata può limitare l&#39;uso della tecnica per quel particolare gene bersaglio. Teoricamente, organoidi sono compatibili con tutte le tecniche manipolative standardizzate utilizzate per linee cellulari. Trasduzione retrovirale è stato il primo metodo da segnalare 4, e recentemente BAC (cromosoma artificiale batterico) -transgenesis è diventato disponibile 5. Con un tempo totale di generazione di 2-3 settimane, dopo trasfezione del plasmide virale nella linea cellulare di packaging, è significativamente più veloce rispetto alla generazione di un transgenico (tg) topo. Mantenendo in vivo cripta-villo architettura mentre contenente cellule staminali così come tutte le linee cellulari differenziate dell&#39;epitelio intestinale, il sistema di coltura organoide colma il divario tra tg animali e colture cellulari precedentemente utilizzato. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per eseguire l&#39;analisi fenotipica di epitelio endodermico in vitro attraverso GAIN- e in perdita di studi di funzione. Ciò rende possibile affrontare questioni fisiologicamente rilevanti in adulto biologia delle cellule staminali, con un bisogno minimo di topi tg. Ad esempio, la generazione di topi knockout condizionali potrebbe essere evitato utilizzando organoidi derivati ​​da mutanti neonati con mortalità perinatale 6. Inoltre, la tecnica può essere applicata a organoidi derivate da topi knockout precedentemente stabiliti per studiare il ruolo di paralogues effettuando ulteriori 7,8 smontabile. Dopo la creazione di piccole organoidi intestinali, adattamento del protocollo di cultura originale ha permesso coltura del pancreas, del fegato, del colon e dello stomaco epiteli 9-11. Inoltre, organoidi intestinali umani e organoidi tumorali sono stati derivati ​​da normali biopsie umane, primario adenoma e il cancro del colon-retto 10 biopsie. Il protocollo infezione virale può essere facilmente esteso a questi tipi di organoidi e fornisce un modo senza precedenti di eseguire studi funzionali nei tessuti di derivazione umana. Nel loro insieme, trasduzione retrovirale di piccole organoidi intestinale è una risorsa preziosa per lo studio delle cellule staminali manutenzione, la differenziazione, e la decisione il destino delle cellule, così come le interazioni di segnalazione cellulare e la cellula cellulare.

High-throughput genetica funzionali è necessario per aumentare la nostra comprensione biologica del corpo, per migliorare la corrente di scienza di base e la medicina. Genetica del mouse è stato il gold standard per lo studio della funzione genica in vivo, anche se è sia in termini di tempo e costosa. Le linee cellulari, essendo l&#39;altra scelta comune, hanno pur essendo meno costoso di una maggiore capacità di throughput. Tuttavia, essi sono impediti dalla loro incapacità di riprodurre il corretto microambiente e quindi le risposte fisiologiche visto in vivo. Quindi, vi è una necessità univoca per un facile da maneggiare sistema modello, che permette di costo / tempo-efficiente high throughput analisi mentre imitando le risposte fisiologiche osservate in vivo esperimenti transgenici (Tg) del mouse in. Per l&#39;epitelio endodermico un tale sistema modello apparso nel 2009 1. Tra le conoscenze acquisite con la scoperta delle cellule staminali intestinali Lgr5-positivi è statainformazioni sulla nicchia corrispondente ai fattori extracellulari della matrice e crescita necessarie per la manutenzione delle cellule staminali. Utilizzando queste informazioni è stato possibile stabilire &quot;mini-guts &#39;noto anche come organoidi 2. Recentemente una nomenclatura consenso per le culture in vitro, dove organoidi sono indicati come &quot;enteroids&quot;, è stato suggerito 3. Come linee cellulari, le organoidi sono in continua espansione e facile da trattare con leganti e inibitori. Tuttavia, invece di essere bidimensionali sono strutture tridimensionali di auto-organizzazione che mantengono l&#39;organizzazione cripta-villo così come le cellule staminali e linee cellulari differenziate del piccolo intestino (SI). Organoidi costituiti da un singolo strato di cellule epiteliali che circondano un&#39;area luminale. Sporgenti strutture in erba corrispondono alle piccole cripte intestinali contenenti compartimento delle cellule staminali. Partendo dalla punta della struttura germogliamento cellule progenitrici differenziano in quanto MIgrattugiare verso il rivestimento epiteliale, dove le cellule terminalmente differenziate sono capannone nel lume. Rispetto a linee cellulari, questo sistema ex vivo ricapitola più strettamente la normale fisiologia ed è quindi un sistema modello promettente per la piccola epitelio intestinale. In questo protocollo video di trasduzione retrovirale, vi presentiamo un metodo che consente di ex vivo studi di funzione genica in questo romanzo sistema di coltura organoide. Iniziamo descrivendo organoide cultura in un modo step-by-step, e continuiamo dimostrando la generazione di retrovirus seguita dalla procedura di trasduzione. Infine, vi è una sezione per ulteriori consigli per la risoluzione dei problemi. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere combinato con l&#39;imaging dal vivo o screening di farmaci per studiare omeostasi, decisioni destino delle cellule e le interazioni cellula-cellula a livello dell&#39;epitelio intestinale. Grazie alla loro architettura semplice e tasso di turnover veloce, organoidi rappresentano un modello ideale system per lo studio della biologia delle cellule staminali adulte. Inoltre trasduzione retrovirale può essere applicato a organoidi derivate da topi transgenici prestabiliti nonché campioni umani dei pazienti. Con l&#39;avvicinarsi del knock-in e knock-out non possono essere estesi agli esseri umani, i organoidi umano SI costituiscono un&#39;alternativa attraente. In sintesi, la manipolazione genetica attraverso la trasduzione retrovirale permette l&#39;analisi fenotipica in piccoli organoidi intestinali derivati ​​da topi o campioni di tessuti umani, integrando in tal modo la genetica del mouse e linee cellulari durante l&#39;apertura di nuove strade per gli studi nei tessuti di derivazione umana. Trasduzione retrovirale consente GAIN- e la perdita-di-funzione studi da eseguire nel sistema di coltura organoide 4. Questo lo rende una risorsa preziosa per lo studio della funzione genica, adulto biologia delle cellule staminali e la malattia pur essendo in conformità con le tre R (riduzione, perfezionamento e sostituzione).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

Cellule staminali Lgr5-positivi possono essere integrati con la crescita essenziale fattori FEG Noggin, e R-spondina, che ci permette di cultura in continua espansione delle strutture epiteliali 3D primarie in vitro. Sia l&#39;architettura e fisiologiche proprietà di questi &quot;mini-coraggio&quot;, chiamati anche organoidi, molto simili alle loro controparti in vivo. Questo li rende un sistema modello interessante per le piccole epitelio intestinale fa. Utilizzando trasduzione retrovirale, la genetica funzionali possono ora essere eseguite da sovraespressione del gene condizionale o knockdown. Questo video illustra la procedura di cultura organoide, la generazione dei retrovirus, e la trasduzione retrovirale di organoidi per assistere analisi fenotipica del piccolo epitelio intestinale in vitro. Questo nuovo sistema modello organotipica in combinazione con l&#39;espressione retrovirale genica mediata fornisce un valido strumento per una rapida analisi della funzione genica in vitro senza bisogno di costlGenerazione Y e in termini di tempo per gli animali transgenici.

Organoidi sono pronti per essere raggruppati quando il lume centrale è oscurato a causa della presenza di cellule morte (Figura 2). Dopo 2-3 giorni di organoidi pre-trattamento dovrebbe adottare una morfologia cistica turno (Figura 3). Questo aumenta il numero di cellule staminali, aumentando le possibilità di ottenere integrazione stabile. Le dimensioni del pellet virale può variare dalla centrifugazione del surnatante virale, molto probabilmente a causa di variazioni contributo di detriti cellulari alle dimensioni del pellet. È stata osservata alcuna chiara correlazione di efficienza di trasduzione. Durante la procedura di selezione organoidi non trasdotte moriranno, mentre quelle con una integrazione stabile rimarrà. La proteina fluorescente da retrovirus MSCV-eGFP può essere osservato in cellule provenienti da organoidi superstiti, che hanno una morfologia cistica, entro 2-3 giorni dopo la trasduzione (Figura 4). <img alt<html> = &quot;Figura 1&quot; fo: content-width = src &quot;6in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 1 Un disegno schematico della procedura di trasduzione retrovirale. Prima di organoidi infezione sono pre-trattati con ENRWntNic fino a che non adottano una struttura cistica (step 1). Cellule Platinum-E sono utilizzati come la linea cellulare di packaging, e sono coltivate fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Successivamente vengono trasfettate con il costrutto retrovirale con PEI. I virus sono raccolte 2 giorni più tardi (fase 2). Organoidi sono tripsinizzate per ottenere frammenti contenenti 1-10 cellule (fase 3), e vengono quindi infettate (punto 4). Dopo spinoculation per aumentare l&#39;efficienza di infezione (punto 5), i frammenti organoide infetti vengono seminate (fase 6) e 2-3 giorni dopo la selezione di cloni positivi con l&#39;integrazione stabile può essere eseguita (punto 7). 1765fig2highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Figura 2 Immagine rappresentativa della organoidi dopo 4-6 giorni di coltura. Il lume è pieno di cellule morte, facendolo apparire scuro. Organoidi in questa fase sono pronti per essere diversi passaggi. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali coltivate in ENRWntNic mezzi per 3-4 giorni. Le organoidi adottare una morfologia cistica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali (a) che mostrano l&#39;espressione del transgene virale (B, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotici 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo ENRWntNic (per 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 2 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina Conditioned medio </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a terreno condizionato </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1 M) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo di trasduzione (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Preparare fresco </td></tr><tr><td> ENRWntNic medio </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 micron) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> Polybrene (8 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR mezzo (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td&gt; </tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina terreno condizionato </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Supporti per le celle Platinum-E (per 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 12 settimane </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 mg / ml) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 mg / ml) </td><td> 500 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. composizione media avanzata DMEM / F12 +++, ENRWntNic medio, medio trasduzione, ENR media, e medio per le cellule Platinum-E.

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K Views.  University of Cambridge.  Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello. 

Video: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Ricerca

Biologia

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

Real Time Analisi di profilo metabolico in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture del mouse intestinale Cripta organoide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

Induzione e rilevamento dell'apoptosi in una cultura primaria delle cellule intestinali del cetriolo marino

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...