Questo protocollo fornisce uno strumento significativo per studiare le interazioni tra le cellule immunitarie intestinali e l'epitelio e per analizzare come queste interazioni possono regolarsi nell'omeostasi intestinale e nell'infiammazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è la squisita quantità di controllo sperimentale facilitato dal modello di riduzione in vitro, che può essere utilizzato per affrontare questioni di biologia epiteliale e immunitaria. Questo sistema è già stato utilizzato per determinare il ruolo di ILC1 nell'espansione delle cripte epiteliali CD44-positive e ha il potenziale per far progredire ulteriormente la nostra comprensione delle malattie gastrointestinali mediate dall'infiammazione.
Per iniziare, posizionare la matrice extracellulare basale reticolante termica sul ghiaccio per scongelare e preriscaldare una piastra standard a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale posizionandola in un incubatore a 37 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere la piastra contenente organoidi dall'incubatrice e scartare il mezzo dal pozzo da passare. Quindi, aggiungere 500 microlitri di DMEM F12 avanzato ghiacciato ai pozzetti e, utilizzando una punta P-1000, raccogliere gli organoidi da tutti i pozzetti in un tubo da 15 millilitri.
Risciacquare il fondo dei pozzetti con 250-300 microlitri di DMEM F12 avanzato ghiacciato, assicurandosi che nessun organoide rimanga nel pozzo e si accumuli nel tubo da 15 millilitri contenente organoidi raccolti. Sospendere il pellet organoide raccolto da uno a due giorni in un millilitro di DMEM F12 avanzato ghiacciato. Pre-rivestire un tubo da 1,5 millilitri con PBS2 per campione di replicazione delle cellule linfoidi innate, quindi utilizzando una punta PBS2 pre-rivestita, distribuire circa 100-200 organoidi nel tubo.
Utilizzando una punta P-1000 rivestita pbS2, aggiungere un volume non inferiore a 500 ILC1 calcolato dalla fase di smistamento al tubo da 1,5 millilitri rivestito pbS2 contenente gli organoidi. Abbassare ILC1 e gli organoidi a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e assicurarsi di evitare centrifughe da tavolo di piccolo diametro, poiché tireranno le celle lungo il bordo dell'interno del tubo invece di creare un pellet sulla punta del tubo. Quindi, rimuovere il surnatante lentamente e delicatamente senza disturbare il pellet e posizionare il campione sul ghiaccio.
Tenendo il tubo su una superficie fredda, risospese gli organoidi e l'ILC in 30 microlitri di matrice extracellulare basale reticolante termica almeno da 10 a 15 volte per garantire una distribuzione uniforme. Applicare 30 microlitri per pozzetto di organoidi ILC nella matrice extracellulare basale termo-reticolante su una piastra preriscaldata a 24 o 48 pozzetti per formare una singola cupola. Successivamente, posizionare la piastra direttamente nell'incubatore per 10-20 minuti a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Quindi, aggiungere 550 microlitri di mezzo ILC1 completo per pozzetto con qualsiasi citochina sperimentale desiderata o anticorpi bloccanti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatrice e lasciare che la piastra si sieda in una cappa di coltura del tessuto per un minuto per garantire che i linfociti siano depositati. Rimuovere da 200 a 250 microlitri di media e posizionarlo in un pozzo vuoto di una piastra a 24 pozzetti.
Utilizzando un microscopio invertito, controllare il surnatante per assicurarsi che non siano stati rimossi i linfociti. Se il surnatante è chiaro, aggiungere 300 microlitri di mezzo ILC1 fresco alla co-coltura nel pozzo originale. Se i linfociti sono presenti nel surnatante, centrifugare a 300-400 G per tre-cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospesare il pellet in 300 microlitri di mezzo ILC1 fresco.
Quindi, aggiungere la sospensione cellulare ai restanti 200-250 microlitri di supporti nel pozzo originale. Eseguire analisi a valle utilizzando l'immunofluorescenza, la citometria a flusso o la purificazione FACS delle popolazioni bersaglio in tampone di lisi per l'analisi dell'espressione genica da parte di un RNA a singola cellula o di massa o RT-qPCR come descritto nel testo. Dopo aver completato con successo il passaggio, le colture organoidi sane e robuste hanno rivelato che le cripte appena isolate dovrebbero formare strutture crittografiche in erba entro due o quattro giorni.
L'analisi citometrica a flusso è stata eseguita per isolare il piccolo INTESTINALE ILC1 dalla linea di reporter transgenico murino ROR gamma-T e l'intervallo di conteggio ILC previsto è risultato essere da 350 a 3.500 cellule isolate. Dopo essere state seminate con organoidi, le co-colture possono essere visualizzate dalla citochimica immunochimica. La microscopia confocale ha rivelato le immagini di piccoli organoidi intestinali che vengono coltivati da soli e in presenza di ILC1.
La colorazione immunocitochimica rivela la presenza di ILC1 CD45-positivo in prossimità delle cellule epiteliali 1-positive alla proteina Zonula occludens in co-colture organoidi ILC1. La citometria a flusso ha dimostrato che la molecola di adesione cellulare epiteliale segna le cellule epiteliali intestinali negli organoidi, mentre CD45 marca ilC1. Il grafico citometrico a flusso e l'immunochimica hanno rivelato una maggiore espressione di CD44 nelle cellule epiteliali intestinali quando co-coltivate con ILC1.
Gli studi RT-qPCR mostrano che la co-coltura ilC1 ha specificamente sovraregolato la variante 6 del CD44, che è stata inibita dall'anticorpo neutralizzante TGF-beta 1, 2, 3 e sovraregolata dal TGF-beta 1 ricombinante in piccole colture intestinali-organoidi. È importante essere delicati durante la manipolazione degli organoidi per garantire che le intere strutture siano mantenute e per verificare che le strutture siano sufficientemente pellettizzate dopo la centrifugazione. Aumentando la complessità del sistema aggiungendo altri componenti immunitari e non immunitari, questo sistema in vitro può essere utilizzato per affrontare ulteriori domande nella biologia intestinale.
