We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale presso l&#39;Università del North Carolina a Chapel Hill. 1 Excise della valvola aortica <ol><li> Utilizzando una tecnica di eutanasia approvato per la fase embrionale di interesse, eutanasia di un mouse incinta con cuccioli al giorno embrionale desiderata (E) dello sviluppo. </li><li> Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare l&#39;addome della femmina incinta. Sollevare la pelle ei muscoli del basso addome alto e lontano dagli organi interni, e sezionare cavità inferiore addominale open femminile per consentire l&#39;accesso al corno uterino. </li><li> Per recuperare il corno uterino, tenere il collo dell&#39;utero con una pinza e caudale con attenzione tagliare le pinze. Sollevare il corno uterino, tagliando qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno in luogo, e completare la rimozione tagliando la giunzione del corno uterino con l&#39;ovidotto. </li><li> Posizionare il corno uterino sezionato in una capsula di Petri contenente cold 0.1 M tampone Tris (pH 7.6) e sciacquare come necessario. Quindi, tagliare il corno uterino longitudinalmente per esporre i sacchi embrionali aperto. </li><li> Per esporre l&#39;embrione, tagliare aprire un sacco embrionale allo svincolo della placenta e l&#39;embrione e tagliare i vasi ombelicali per liberare l&#39;embrione. Posizionare l&#39;embrione sezionato in un secondo piatto di Petri con freddo 0.1 M tampone Tris. Ritorna il primo piatto di Petri con i rimanenti embrioni undissected per ghiaccio fino pronto per la prossima embrione. </li><li> Per migliorare l&#39;accesso della parete toracica all&#39;interno dell&#39;embrione, decapitare il embrione. Se genotipizzazione è necessario, rimuovere e salvare un pezzo di tessuto in più in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio. </li><li> Inserire l&#39;embrione sul dorso, e tagliare la parete toracica verticalmente lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, e orizzontalmente sopra il diaframma di visualizzare il cuore. Quindi, aprire la parete toracica per esporre il cuore. </li><li> Utilizzando pinze per tenere alto lungo i grossi vasi, sollevare il cuore con pinze e tagliare i vasi di seguito. Iln, tagliare sopra la pinza per liberare il cuore. Se i vasi polmonari rimangono non tagliata, i polmoni possono essere rimossi con il cuore e devono essere rimosse prima di continuare. </li><li> Tagliare e rimuovere l&#39;arteria polmonare di sopra del livello della valvola; nelle fasi embrionali qui descritte, l&#39;arteria polmonare è leggermente opaca, che aiuta nella sua discriminazione dalla regione valvola. Tagliare appena sotto la valvola polmonare, evitando il miocardio ventricolare trabeculated e raccogliere come descritto al punto 1.10, se questa regione è anche di interesse. Qui e nella fase successiva, utilizzare un&#39;azione capillare per disegnare tampone Tris eccesso di distanza dalla regione di interesse prima di raccogliere in tampone di lisi. </li><li> Rimuovere accuratamente il distale dell&#39;aorta alla valvola aortica, appena sopra il livello della valvola; come l&#39;arteria polmonare, l&#39;aorta rimane leggermente opaca in queste fasi embrionali, aiutando nella sua rimozione. Tagliare appena sotto la valvola aortica, ancora una volta evitando il miocardio ventricolare trabeculated, e trasferire ilvalvola con pinze ad una provetta Eppendorf con tampone di lisi 2 microlitri (descritto nella tabella materiali) contenente inibitori di proteasi e fosfatasi sul ghiaccio. </li><li> Ripetere i passaggi 1,6-1,10 finché le valvole sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni valvola in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, tutte le valvole possono essere raccolte in un unico tubo Eppendorf. </li><li> Se genotipizzazione deve essere eseguito per determinare quali valvole di riunire insieme, immediatamente mettere i campioni in tampone di lisi a -80 ° C fino a nuovo uso. I campioni possono quindi essere raggruppati dopo genotipizzazione (punto 2.1.1). </li></ol> Estrazione 2 Proteine <ol><li> Scongelare tessuti raccolti su ghiaccio e centrifugare a 13.100 xg per 1 min per raccogliere i tessuti in un tampone di lisi sul fondo della provetta. <ol><li> Se sono stati genotipizzati embrioni, utilizzare una pipetta per raccogliere delicatamente e piscina di buffer di lisi contenente le regioni valvole da embrioni con genotipi simili. Per garantire un forte be, riunendo 3-4 regioni valvole da embrioni E13.5 per si raccomanda campione. </li><li> Se tutti gli embrioni erano dello stesso genotipo e tutte le regioni valvole sono stati raccolti insieme nel passo 1.10, lisare l&#39;intero campione, come descritto al punto 2.2. </li></ol></li><li> Controllare il volume del campione composito risultante e aggiungere tampone di lisi per un volume totale di 40 microlitri; poi, interrompere e omogeneizzare campioni utilizzando perline in acciaio inox 5 mm provette Eppendorf. Azionare il Lyser per 2-4 min a 50 Hz, come da istruzioni del produttore. Tubi Spin brevemente, (~ 13.100 xg per 1 minuto), e il trasferimento dei campioni ai nuovi tubi, lasciando dietro di sé i detriti insolubile. </li><li> Preparare e campioni separati per SDS-PAGE e trasferimento per la successiva analisi Western Blot, a seguito di un protocollo come Eslami et al 9. Blotting per una proteina di controllo di carico è essenziale per la quantificazione delle proteine. </li></ol>

<ol>
	<li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves.">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li><li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves.">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li><li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves.">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li><li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes.">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li><li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells.">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells:+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis.">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling.">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinating+Notch,+BMP,+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development.">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development:+the+pulmonary+push+concept.">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li><li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves.">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La capacità di quantificare i livelli di proteine ​​nei primi mesi del topo embrionale e pulcino regioni della valvola cardiaca fornisce un ulteriore strumento per la comprensione degli eventi di segnalazione cellulari critici per lo sviluppo della valvola. Il nostro protocollo qui descritto non differisce molto da procedure di isolamento delle proteine ​​standard. Tuttavia, modificando alcuni passaggi chiave, abbiamo ottenuto con successo proteine ​​fosforilate da estremamente campioni di piccole dimension...

Essere in grado di identificare e quantificare i livelli di espressione della proteina è una tecnica standard per ragioni sanitarie e di esperimenti basati su celle. Tuttavia, nonostante una lunga interesse per lo sviluppo della valvola cardiaca embrionale precoce, valutando l&#39;espressione della proteina in questo tessuto specifico durante lo sviluppo è attualmente limitato a immunoistochimica sia il pulcino e il mouse 1,2. Parte della difficoltà di quantificare l&#39;espressione della proteina nelle valvole di sviluppo della maggior parte degli organismi modello (ad esempio, ceci e topo) è la piccola dimensione delle valvole, che limita la quantità di proteine ​​che si possono ottenere. Così, per analisi quantitative, i ricercatori in genere si basano su l&#39;estrazione dell&#39;RNA e l&#39;amplificazione per la successiva PCR quantitativa o analisi microarray 2-5. Tuttavia, i livelli di espressione di RNA e proteine ​​non sono del tutto correlativo 6, in modo da concentrarsi su espressione di RNA non è in grado di fornire una rigorosa conto dei numerosi cambiamenti che si verificano in una determinata segnalazionepercorso in diversi momenti durante l&#39;evoluzione. Sulla base di questo limite nella metodologia attualmente disponibili, l&#39;obiettivo di questa procedura è stato quello di sviluppare un protocollo per ottenere in modo affidabile una quantità sufficiente di proteine ​​dalle embrionali di topo in via di sviluppo le regioni valvola cardiaca per l&#39;analisi quantitativa dei cambiamenti che si verificano in diverse vie di segnalazione che sono importanti in la maturazione di questo tessuto. Le valvole embrionali sono già comunemente dissezionati da topi per l&#39;isolamento di RNA e la successiva analisi di espressione genica 2-5. Tuttavia, questi studi si sono limitati a usare l&#39;espressione genica come out lettura di segnalare l&#39;attivazione della via, che non consente il rilevamento di rilevare modificazioni post-traduzionali di proteine ​​che possono influenzare la segnalazione a valle. Utilizzando le tecniche di isolamento dell&#39;RNA come punto di partenza, abbiamo iniziato con dissezione delle regioni di interesse. Perché il nostro interesse è stato rilevando proteine ​​fosforilate che erano indicativi di pat segnalazioneattività HWAY durante un periodo specifico di sviluppo della valvola aortica (E13.5-14.5), abbiamo effettuato tutte le dissezioni in tampone Tris senza fosfati e raccolto le valvole in un tampone di lisi a base di Tris con inibitori della proteasi e fosfatasi. Nel nostro caso specifico, solo le regioni valvola aortica sono stati raccolti, ma la regione valvola polmonare possono essere facilmente ottenuti allo stesso tempo. Le regioni valvole erano poi omogeneizzato e combinato con un tampone che viene attualmente utilizzato per studiare l&#39;espressione della proteina in valvole cardiache adulte 7. Utilizzando piccoli volumi di campione (ad esempio, 2 microlitri) e la messa in comune delle regioni valvole da embrioni con lo stesso genotipo, siamo stati in grado di rilevare le proteine ​​fosforilate e nonphosphorylated al giorno embrionale 13.5 8. Poiché le regioni di valvole possono essere congelati e conservati in tampone di lisi, gli embrioni possono essere genotipizzati se necessario prima di pooling. Questa tecnica amplia il set di strumenti che sono disponibili per la valutazione signalin cellulareg percorsi durante lo sviluppo e fornisce un complimento quantitativo di immunoistochimica, specificatamente per le valvole cardiache in via di sviluppo. Questa tecnica dovrebbe essere di beneficio non solo ai cardiologi di sviluppo, ma anche a tutti i biologi dello sviluppo che lavorano con gli embrioni in fase iniziale sono interessati nelle regioni che contengono tessuti limitata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:512px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timed-pregnant mouse</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.1 M Tris, pH 7.6</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscissors</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine forceps, #5</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needle holders</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needles</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipette, 20 &#956;l, with tips</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:125px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TissueLyser LT</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel beads</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td align="right">69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Utilizzando questa tecnica di preparazione, siamo stati in grado di rilevare fosforilata Smad 1,5,8 (pSmad) nelle singole regioni della valvola aortica da E13.5 embrioni. Come mostrato nella Figura 1A, la proteina isolata da anche una sola regione valvola è sufficiente per rilevare una banda pSmad debole. Intensità del segnale aumenta in proporzione al numero di regioni valvole che vengono pool. È importante sottolineare che il / rapporto β-actina pSmad rimane pressoché costante tra le d...

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Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteine ​​Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione

Proteine Isolamento dal Sviluppare embrionali di topo Cuore Valve Regione