La differenziazione delle cellule progenitrici cardiache, o CPC, all'amplificazione richiede un passaggio di fase da una fase proliferazione a una fase impegnata, e questo protocollo utilizza un'efficiente discendenza endoteliale nei CPC. Uno dei principali vantaggi della tecnica è che è applicabile ai CPC isolati sulla base di diverse tecniche e di specie diverse. Questo protocollo può essere utilizzato per migliorare le potenzialità terapeutiche dei CPC per la terapia cellulare.
Può anche essere utilizzato per indagare i potenziali e i meccanismi di differenziazione e come questi sono influenzati da malattie cardiache. I CPC sono una popolazione disomogenea di cellule che può differire per forma, dimensione e potenza. Pertanto, il protocollo deve essere adeguato in base alla sottopopolazione specifica dei CPC utilizzati.
Dopo aver anestetizzato il topo, pulire il petto con il 70% di etanolo. Usando le forbici, tagliare la pelle e la parete toracica per esporre la cavità toracica. Utilizzare le forcep per sollevare il cuore e quindi usare le forbici per tagliarlo alla base.
Trasferire il cuore in un piatto di coltura P60 contenente cinque millilitri di PBS freddo, quindi utilizzare pinzi per pompare il cuore ed espellere il sangue dalle cavità. Mettere il cuore in un piatto P60 contenente cinque millilitri di PBS freddo e lavarlo. Usa piccole forbici per rimuovere gli atri, tagliare il cuore in due pezzi longitudinali e lavarli in cinque millilitri di PBS ghiacciato.
Usando piccole forbici, tagliare i pezzi del cuore in sezioni più piccole. Aggiungere una goccia di soluzione salina bilanciata di Hank contenente collagenasi B a una concentrazione di un milligrammo per millilitro e utilizzare una lama sterile per tritare accuratamente i piccoli pezzi cardiaci. Quindi, aggiungere 2,5 millilitri della soluzione di collagenasi B al piatto.
Posizionare il piatto con un angolo di 30 gradi in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Lasciare incubare i pezzi di cuore tritati per un massimo di 30 minuti mentre li passano ripetutamente attraverso una pipetta Pasteur ogni 10 minuti durante l'incubazione. In primo luogo, aggiungere cinque millilitri di HBSS freddi integrati con 2%FBS ai pezzi cardiaci tritati e omogeneizzati.
Utilizzando un filtro da 100 micrometri, filtrare i pezzi cardiaci per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito. Centrifuga a 470 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi.
Incubare sul ghiaccio per cinque minuti con scuotimenti occasionali. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di PBS e filtrare il campione attraverso un filtro da 40 micrometri per escludere le cellule più grandi, compresi i cardiomiociti residui. Centrifuga a 470 volte G e a temperatura ambiente per cinque minuti senza pausa.
Quindi, sospendere nuovamente le cellule in DMEM integrate con 10%FBS, mirando a una concentrazione cellulare finale di un milione di cellule per millilitro. Distribuire le celle in due tubi per la colorazione e lo smistamento, aggiungendo 1,5 millilitri della soluzione cellulare a un tubo e 3,5 millilitri al secondo tubo. Aggiungere la soluzione di Hoechst e incubare a 37 gradi Celsius per 90 minuti con capovolgimento occasionale per garantire un'equa distribuzione del colorante e prevenire la coagulazione delle cellule.
La popolazione laterale appare nell'angolo in basso a sinistra di Hoechst a parte la popolazione principale. Nel grafico FACS può essere identificato in base al controllo negativo in cui verapamil spinge la popolazione laterale a scomparire. Riscaldare medio da uno a 37 gradi Celsius e raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius.
Centrifugare i tubi di cernita a 470 volte G e a quattro gradi Celsius per sei minuti. Quindi, sospendere di nuovo le celle in una media. Trasferire le celle in un piatto P60 permeabile al gas contenente quattro millilitri di medio.
Cambiare il mezzo ogni tre giorni fino a quando le celle non hanno raggiunto una confluenza compresa tra 70 e 80%Culture SP-CPC per due o tre giorni in flaconi T75 utilizzando otto millilitri di uno medio in ogni pallone. Successivamente, aspirare con cura il mezzo e sciacquare delicatamente il pallone con cinque millilitri di HBSS caldo. Trattare le cellule con cinque millilitri di tripside EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Quindi, aggiungere cinque millilitri di uno medio per interrompere l'attività della tripina e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri. Centrifuga a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, sospendere di nuovo le celle in due medie o medie.
Placcare le celle su piatti P60, placcando 250.000 SP-CPC per piatto con tre millilitri di mezzo contenenti diverse concentrazioni siere. Dopo due giorni di coltura, raccogli il mezzo da ogni piatto in un tubo da 15 millilitri per raccogliere le cellule morte. Tripinare le cellule aderenti come descritto in precedenza e raccogliere la sospensione cellulare nel tubo da 15 millilitri che contiene il mezzo raccolto.
Centrifugare a 840 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare il supernatante e aggiungere un millilitro di uno medio o medio due per il conteggio delle cellule. Macchiare gli SP-CPC con tripano blu e contare le cellule vitali e morte. In primo luogo, aspirare il mezzo dalle cellule preparate e sciacquarle delicatamente con cinque millilitri di HBSS caldo.
Trattare le cellule con cinque millilitri di tripside EDTA per cinque minuti nell'incubatrice cellulare. Quindi, aggiungere cinque millilitri di uno medio per interrompere l'attività della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente.
Aspirare il supernatante e aggiungerne due medi per il conteggio delle celle. Successivamente, semina 80.000 cellule in ogni pozzo di una piastra di coltura pre-rivestita a sei pozzi con tre millilitri di due medie. Mantenere la piastra a 37 gradi Celsius per 20-24 ore, quindi cambiare il mezzo in ogni pozzo a tre millilitri di media tre.
Coltura del piatto per 21 giorni, cambiando il mezzo ogni tre giorni. Successivamente, macchiare le cellule con un marcatore endoteliale ed eseguire la microscopia a fluorescenza per verificare la natura endoteliale delle cellule differenziate. In primo luogo, aspirare il mezzo dalle cellule preparate e sciacquarle delicatamente con cinque millilitri di HBSS caldo.
Trattare le cellule con due millilitri di tripside EDTA per cinque minuti nell'incubatore di cellule, quindi aggiungere tre millilitri di media tre per interrompere l'attività della tripina. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e centrifugare a 470 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e aggiungere un millilitro di tre medi, pipettando delicatamente per mescolare.
Contare le cellule e il seme tra 2.000 e 4.000 cellule in 100 microlitri di media tre per ogni matrice rivestita di pozzo di una piastra da 96 porri. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 16 ore. Successivamente, utilizzare un microscopio a campo luminoso con un ingrandimento due volte superiore per scattare una foto delle cellule.
In questo studio vengono esplorate le condizioni adeguate per facilitare l'impegno di lignaggio endoteliale delle cellule progenitrici cardiache. Quando la confluenza cellulare è al 60% o al di sotto di esso, non si vede alcuna differenza significativa nei campioni trattati con FBS al 3,5%. Quando le cellule a questa confluenza vengono trattate con 0,1%FBS, mostrano una diminuzione della proliferazione cellulare sulla laminina rispetto alla fibronectina, ma non mostrano alcun aumento della morte cellulare.
Al contrario, le cellule ad alta confluenza non mostrano alcuna differenza significativa nella proliferazione cellulare o nella morte cellulare tra le due condizioni. I cambiamenti nella forma cellulare sembrano essere un indicatore di condizioni di coltura adeguate in cui la differenziazione endoteliale avrà successo. Entro sette o 14 giorni nel mezzo di differenziazione endoteliale, si vede che le colture di successo contengono cellule più grandi con morfologia diversa.
È interessante notare che queste cellule scomparvero verso la fine della fase di differenziazione e tendevano ad apparire in numero inferiore e in poi punti in colture ad alta densità. La formazione del tubo ha costantemente successo nelle cellule placcate a bassa densità e differenziate sulla laminina, mentre si vede per lo più fallire nelle cellule placcate ad alta densità. Mentre la formazione del tubo non ha successo nelle cellule coltivate con fibronectina indipendentemente dalla densità cellulare, quelle differenziate a bassa densità a volte formano tubi rudimentali.
La concentrazione siere e la densità cellulare per indurre il lignaggio endoteliale sono fondamentali e devono essere regolate per garantire il rallentamento della proliferazione mantenendo la vitalità. Dopo l'induzione del lignaggio, i CPC dell'uomo o i modelli di malattia preclinica possono essere utilizzati per studi di trapianto cellulare per valutare il loro potenziale di differenziazione in vivo. Questo protocollo potrebbe aiutare a studiare o stabilire nuovi strumenti di rigenerazione cardiaca, ed è stato precedentemente utilizzato per studiare il meccanismo molecolare dell'impegno di discendenza precoce.
