We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvées par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle à l&#39;Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. 1. accise de la valve aortique <ol><li> En utilisant une technique d&#39;euthanasie approuvé pour le stade embryonnaire d&#39;intérêt, euthanasier une souris enceinte de chiots à la journée embryonnaire souhaitée (E) de développement. </li><li> Utiliser 70% d&#39;éthanol pour stériliser l&#39;abdomen de la femme enceinte. Soulevez la peau et les muscles du bas-ventre et à l&#39;écart des organes internes, et de disséquer cavité abdominale inférieure ouverte la femme de permettre l&#39;accès à la corne utérine. </li><li> Pour récupérer la corne utérine, maintenez le col avec une pince et caudale soigneusement découpées à la pince. Soulevez la corne utérine, la coupe de tout le tissu conjonctif qui maintient la corne en place, et terminer la suppression en coupant la jonction de la corne de l&#39;utérus avec l&#39;oviducte. </li><li> Placez la corne utérine disséqué dans un col boîte de Pétri contenantd 0,1 M de tampon Tris (pH 7,6) et rincer au besoin. Ensuite, couper la corne utérine ouverte sens de la longueur pour exposer les sacs embryonnaires. </li><li> Pour exposer l&#39;embryon, couper ouvrir un sac embryonnaire à la jonction du placenta et de l&#39;embryon et couper les vaisseaux ombilicaux pour libérer l&#39;embryon. Placez l&#39;embryon disséqué dans une deuxième boîte de Pétri avec un tampon froid Tris 0,1 M. Retour de la première boîte de Pétri avec les embryons restants undissected à glace jusqu&#39;au moment de la prochaine embryon. </li><li> Pour améliorer l&#39;accès de la paroi thoracique dans l&#39;embryon, décapiter l&#39;embryon. Si le génotypage est nécessaire, enlever et sauver un morceau de tissu supplémentaire dans un tube Eppendorf placé sur la glace. </li><li> Placer l&#39;embryon sur le dos, et couper la paroi thoracique à la verticale le long du côté de la cage thoracique, à proximité d&#39;un membre antérieur, et horizontalement au-dessus du diaphragme pour visualiser le coeur. Ensuite, ouvrez la paroi thoracique à exposer le cœur. </li><li> En utilisant une pince pour tenir haut le long des gros vaisseaux, soulever le cœur à l&#39;aide de pinces et couper les navires de moins. Lan, couper au-dessus de la pince pour libérer le cœur. Si les vaisseaux pulmonaires restent non coupés, les poumons peuvent être enlevées avec le cœur et doivent être retirés avant de poursuivre. </li><li> Couper et enlever l&#39;artère pulmonaire au-dessus du niveau de la vanne; aux stades embryonnaires décrits ici, l&#39;artère pulmonaire est légèrement opaque, ce qui facilite sa discrimination de la région de la soupape. Coupez juste en dessous de la valve pulmonaire, en évitant le myocarde ventriculaire trabéculaire et de recueillir comme décrit à l&#39;étape 1.10 si cette région est également intéressant. Ici et dans l&#39;étape suivante, utilisez l&#39;action capillaire pour attirer tampon Tris excès loin de la zone d&#39;intérêt avant de recueillir dans un tampon de lyse. </li><li> Retirer soigneusement la aorte distale de la valvule aortique, juste au-dessus du niveau de la vanne; comme l&#39;artère pulmonaire, l&#39;aorte reste légèrement opaque à ces stades embryonnaires, ce qui facilite son extraction. Coupez juste en dessous de la valve aortique, en évitant encore le myocarde ventriculaire trabéculaire, et transférer levanne à l&#39;aide de pinces dans un tube Eppendorf avec du tampon de lyse 2 ul (décrit dans le tableau des matériaux) contenant des inhibiteurs de protease et de phosphatase sur de la glace. </li><li> Répétez les étapes 1.6 à 1.10 jusqu&#39;à ce que les vannes ont été excisés de tous les embryons, la collecte de chaque valve dans un tube Eppendorf séparé. Si tous les embryons ont le même génotype, toutes les vannes peuvent être collectées dans un seul tube Eppendorf. </li><li> Si génotypage doit être effectuée afin de déterminer les vannes à mettre en commun, mettre immédiatement les échantillons dans un tampon de lyse à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Les échantillons peuvent ensuite être regroupées après génotypage (étape 2.1.1). </li></ol> Extraction de la protéine 2 <ol><li> Décongeler les tissus prélevés sur la glace et centrifuger à 13 100 g pendant 1 min pour recueillir les tissus dans un tampon de lyse au fond du tube. <ol><li> Si les embryons ont été génotypés, utiliser une pipette pour recueillir doucement et le tampon de lyse piscine contenant les régions de soupape à partir d&#39;embryons avec des génotypes similaires. Pour assurer une forte bet, la mise en commun des régions 3-4 de soupape à partir d&#39;embryons E13.5 par échantillon est recommandé. </li><li> Si tous les embryons sont du même génotype et toutes les régions de la vanne ont été rassemblées à l&#39;étape 1.10, lyser l&#39;ensemble de l&#39;échantillon, comme décrit dans l&#39;étape 2.2. </li></ol></li><li> Vérifiez le volume de l&#39;échantillon global résultant et ajouter un tampon de lyse à un volume total de 40 ul; alors, perturber et homogénéiser les échantillons à l&#39;aide de 5 mm billes d&#39;acier inoxydable dans des tubes Eppendorf. Actionnez le lyser pour 2-4 min à 50 Hz, selon les instructions du fabricant. tubes à centrifuger brièvement, (~ 13 100 x g pendant 1 min), et de transfert des échantillons dans de nouveaux tubes, laissant derrière les débris insolubles. </li><li> Préparer des échantillons distincts pour SDS-PAGE et transfert ultérieur pour analyse western blot, à la suite d&#39;un protocole tel que Eslami et al 9. Buvard pour une protéine de contrôle du chargement est essentiel pour la quantification des protéines. </li></ol>

<ol>
	<li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves.">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li><li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves.">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li><li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves.">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li><li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes.">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li><li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells.">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells:+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis.">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling.">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinating+Notch,+BMP,+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development.">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development:+the+pulmonary+push+concept.">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li><li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves.">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La capacité à quantifier les niveaux de protéines au début embryon de souris et poussin régions cardiaques de soupape constitue un outil supplémentaire pour comprendre les événements de signalisation cellulaires critiques pour le développement de la vanne. Notre protocole décrit ici ne diffère pas beaucoup de procédures d&#39;isolement de protéines standard. Cependant, en modifiant quelques étapes clés, nous avons réussi à obtenir des protéines phosphorylées de tailles très petits échantillons. Pour...

Etre capable d&#39;identifier et de quantifier les niveaux d&#39;expression de protéine est une technique standard pour animale et des expériences basées sur des cellules. Cependant, malgré un intérêt de longue date dans le développement de valve cardiaque embryonnaire précoce, l&#39;évaluation de l&#39;expression des protéines dans ce tissu spécifique au cours du développement est actuellement limité à l&#39;immunohistochimie à la fois le poussin et 1,2 de la souris. Une partie de la difficulté à quantifier l&#39;expression des protéines dans les soupapes de développement de la plupart des organismes modèles (par exemple, poulet et de souris) est la petite taille des vannes, ce qui limite la quantité de protéine qui peut être obtenue. Ainsi, pour des analyses quantitatives, les chercheurs s&#39;appuient généralement sur ​​l&#39;extraction de l&#39;ARN et l&#39;amplification de la PCR quantitative ultérieure ou l&#39;analyse des microréseaux 2-5. Cependant, les niveaux d&#39;expression d&#39;ARN et de protéines ne sont pas entièrement corrélative 6, donc en mettant l&#39;accent sur ​​l&#39;expression de l&#39;ARN ne peuvent pas fournir un compte rendu rigoureux des nombreux changements qui se produisent dans toute signalisation donnévoie à différents moments de l&#39;évolution. Sur la base de cette limite dans la méthodologie actuellement disponibles, l&#39;objectif de cette procédure était de développer un protocole pour obtenir de manière fiable des quantités suffisantes de protéine à partir de la souris embryonnaire régions de valve cardiaque en développement pour l&#39;analyse quantitative des changements qui se produisent dans différentes voies de signalisation qui sont importantes dans la maturation de ce tissu. Vannes embryonnaires sont déjà couramment disséqués de souris pour l&#39;isolement de l&#39;ARN et l&#39;analyse ultérieure gène d&#39;expression 2-5. Toutefois, ces études ont été limitées à l&#39;utilisation de l&#39;expression des gènes en tant que sortie de lecture de signalisation activation de la voie, ce qui ne permet pas la détection de détecter des modifications post-traductionnelles des protéines qui sont susceptibles d&#39;affecter la signalisation en aval. En utilisant les techniques d&#39;isolation de l&#39;ARN comme un point de départ, nous avons commencé par disséquer les régions d&#39;intérêt. Parce que notre intérêt détectait protéines phosphorylées qui sont des indices de pat signalisationHway activité pendant une période spécifique du développement de la valve aortique (E13.5-14.5), on a effectué toutes les dissections dans du tampon Tris-phosphate libre et recueilli les soupapes dans un tampon de lyse à base de Tris avec des inhibiteurs de phosphatase et protéase. Dans notre cas particulier, que les régions de la valve aortique ont été recueillies, mais la région de la valve pulmonaire peuvent facilement être obtenues en même temps. Les régions de soupapes sont ensuite homogénéisé et combiné avec un tampon d&#39;échantillon qui est actuellement utilisé pour étudier l&#39;expression des protéines dans les valves cardiaques adultes 7. En utilisant des volumes d&#39;échantillon de petite taille (par exemple, 2 pi) et la mise en commun des régions de soupape à partir d&#39;embryons avec le même génotype, nous avons pu détecter des protéines phosphorylées et non phosphorylés à jour embryonnaire 13,5 8. Étant donné que les régions de la vanne peuvent être congelés et stockés dans un tampon de lyse, les embryons peuvent être génotypés si nécessaire avant la mise en commun. Cette technique élargit l&#39;ensemble des outils qui sont disponibles pour l&#39;évaluation signalin cellulaireg voies au cours du développement et fournit un compliment quantitative de l&#39;immunohistochimie, en particulier pour les valves cardiaques en développement. Cette technique devrait être bénéfique non seulement pour les cardiologues de développement, mais aussi à tous les biologistes du développement qui travaillent avec des embryons de stade précoce sont intéressés dans les régions qui contiennent des tissus limitée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:512px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timed-pregnant mouse</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.1 M Tris, pH 7.6</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscissors</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine forceps, #5</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needle holders</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needles</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipette, 20 &#956;l, with tips</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:125px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TissueLyser LT</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel beads</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td align="right">69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Grâce à cette technique de préparation, nous avons pu détecter phosphorylée Smad 1,5,8 (pSmad) dans les régions de la valve aortique unique à partir de E13.5 embryons. Comme le montre la Figure 1A, la protéine isolée à partir d&#39;une même région de la soupape est suffisant pour détecter une bande de pSmad faible. L&#39;intensité du signal augmente proportionnellement au nombre de régions de soupapes qui sont mises en commun. Fait important, la pSmad rapport a / β-actine rest...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region at JoVE.com

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K vues.  University of North Carolina at Chapel Hill. The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.