We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Universität von North Carolina in Chapel Hill genehmigt. 1. Verbrauch der Aortenklappe <ol><li> Mit einem zugelassenen Euthanasie Technik für die embryonalen Stadium von Interesse, einschläfern eine schwangere Maus mit Welpen an der gewünschten embryonalen Tag (E) der Entwicklung. </li><li> Verwenden 70% Ethanol, um den Bauch der Schwangeren zu sterilisieren. Heben Sie die Haut und Muskeln des Unterleibs oben und weg von den inneren Organen und sezieren unteren Bauchhöhle des Weibchens offen für den Zugang zum Uterushorn zu ermöglichen. </li><li> Um die Uterushorn abzurufen, halten Sie die Zervix mit einer Pinzette und sorgfältig geschnitten kaudal der Zange. Heben Sie die Uterushorn, Schneiden jede Bindegewebe, das Horn an Ort und Stelle hält, und füllen Sie die Entfernung, indem die Kreuzung der Uterushorn mit den Eileiter. </li><li> Legen Sie die seziert Uterushorn in eine Petrischale mit cold 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,6) und spülen Sie nach Bedarf. Dann schneiden Sie die Uterushorn offen in Längsrichtung, um die embryonalen Säcke aus. </li><li> , Um den Embryo zu belichten, schnitt eine Fruchtblase an der Kreuzung von der Plazenta und des Embryos und schneiden Sie die Nabelgefässe, um den Embryo zu befreien. Legen Sie die seziert Embryo in einer zweiten Petrischale mit kaltem 0,1 M Tris-Puffer. Bringen Sie die ersten Petrischale mit den restlichen unzer Embryonen Eis, bis sich bereit für den nächsten Embryo. </li><li> Um Zugang Brustwand innerhalb des Embryos zu verbessern, den Embryo zu enthaupten. Wenn Genotypisierung notwendig ist, zu entfernen und speichern eine zusätzliche Gewebestück in ein Eppendorf-Röhrchen auf Eis gestellt. </li><li> Legen Sie den Embryo auf dem Rücken, und schneiden Sie die Brustwand vertikal entlang der Seite des Brustkorbs, in der Nähe einer Vordergliedmaße, und horizontal über der Membran, um das Herz zu visualisieren. Öffnen Sie dann die Brustwand, um das Herz freizulegen. </li><li> Mit einer Pinzette hoch entlang der großen Gefäße zu halten, heben Sie das Herz mit einer Pinzette und schneiden Sie die Gefäße unten. Dien, vor der Zange geschnitten, um das Herz zu befreien. Wenn die Lungengefäße bleiben ungeschnitten, kann die Lunge mit dem Herzen entfernt werden und sollte, bevor Sie fortfahren entfernt werden. </li><li> Schneiden und entfernen Sie die Lungenarterie über dem Niveau des Ventils; bei der hier beschriebenen Embryonalstadien, die Lungenarterie leicht opak, die in ihrer Unterscheidung von den Ventilbereich unterstützt. Kurz unterhalb der Pulmonalklappe, die Vermeidung der trabekulierte Myokard und sammeln, wie in Schritt 1.10 beschrieben, wenn diese Region ist auch von Interesse. Hier und im nächsten Schritt verwendet Kapillarwirkung, um überschüssiges Tris-Puffer von dem interessierenden Bereich vor dem Sammeln in Lysepuffer ziehen. </li><li> Die Aorta distal sorgfältig zu entfernen, um die Aortenklappe, gerade über dem Niveau des Ventils; wie die Lungenarterie, bleibt der Aorta bei diesen embryonalen Stadien leicht opake, Beihilfe in seiner Entfernung. Kurz unterhalb der Aortenklappe, wieder die Vermeidung der trabekulierte Myokard, und übertragen Sie dieVentil mit einer Pinzette in ein Eppendorf-Röhrchen mit 2 ul Lysepuffer (in der Material Tabelle beschrieben) mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte, bis 1,6-1,10 die Ventile aus allen Embryonen herausgeschnitten worden, sammeln jedes Ventil in einem separaten Eppendorf-Röhrchen. Wenn alle Embryonen haben den gleichen Genotyp, können alle Ventile in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt werden. </li><li> Wenn die Genotypisierung durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche zu bündeln Ventile sollten sofort Proben in Lyse-Puffer bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. Proben können dann nach Genotypisierung (Schritt 2.1.1) zusammengefasst werden. </li></ol> 2. Proteinextraktion <ol><li> Auftauen gesammelten Gewebe auf Eis und Zentrifugieren bei 13.100 × g für 1 Minute, um das Gewebe in Lysepuffer am Boden des Röhrchens zu sammeln. <ol><li> Wenn Embryonen wurden genotypisiert, mit einer Pipette vorsichtig sammeln und Pool-Lyse-Puffer, der die Ventilbereiche aus Embryonen mit ähnlichen Genotypen. Eine starke b gewährleistenund die Bündelung 3-4 Ventilbereiche von E13.5 Embryonen pro Probe wird empfohlen. </li><li> Wenn alle Embryonen wurden aus dem gleichen Genotyp und alle Ventilbereiche in Schritt 1.10 zusammen gesammelt, lysiert die gesamte Probe, wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie die Lautstärke des resultierenden Mischprobe und fügen Lyse-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 40 ul; dann, und homogenisieren Proben unter Verwendung von 5 mm Edelstahlkugeln in Eppendorf-Röhrchen. Betreiben Sie das lyser für 2-4 min bei 50 Hz, nach den Anweisungen des Herstellers. Spin Röhrchen kurz (~ 13.100 × g für 1 min), und die Übertragung Proben in neue Röhrchen, so dass hinter dem unlöslichen Rückstand. </li><li> Vorbereitung und getrennte Proben für SDS-PAGE und Transfer zur anschließenden Western-Blot-Analyse nach einem Protokoll wie Eslami et al 9. Blotting für eine Ladekontrollprotein ist von wesentlicher Bedeutung für die Proteinquantifizierung. </li></ol>

<ol>
	<li>Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+cartilage+and+bone-related+proteins+in+pediatric+and+adult+diseased+aortic+valves.">Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves.</a> J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).</li><li>Chakraborty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+promotes+heart+valve+cell+proliferation+and+extracellular+matrix+gene+expression+during+development+in+vivo+and+is+expressed+in+human+diseased+aortic+valves.">Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves.</a> Dev Biol. 347, 167-179 (2010).</li><li>Lee, M. P., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1+directly+regulates+genes+that+promote+cell+proliferation+and+migration+in+developing+heart+valves.">Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves.</a> PLoS One. 6 (e29758), (2011).</li><li>Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9+transcriptionally+represses+Spp1+to+prevent+matrix+mineralization+in+maturing+heart+valves+and+chondrocytes.">Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes.</a> PLoS One. 6 (e26769), (2011).</li><li>Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shared+gene+expression+profiles+in+developing+heart+valves+and+osteoblast+progenitor+cells.">Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells.</a> Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).</li><li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+functional+Toll-like+receptors+2+and+4+in+human+aortic+valve+interstitial+cells:+potential+roles+in+aortic+valve+inflammation+and+stenosis.">Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).</li><li>Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMPER-induced+BMP+signaling+promotes+coronary+artery+remodeling.">BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling.</a> Developmental Biology. 386, 385-394 (2014).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li><li>Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-ordinating+Notch,+BMP,+and+TGF-beta+signaling+during+heart+valve+development.">Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).</li><li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural.">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Development. 127, 1607-1616 (2000).</li><li>Scherptong, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+outflow+tract+rotation+during+cardiac+development:+the+pulmonary+push+concept.">Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept.</a> Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).</li><li>Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+osteopontin+in+calcified+human+aortic+valves.">Detection of osteopontin in calcified human aortic valves.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Fähigkeit, Proteinspiegel in der frühen embryonalen Maus quantifizieren und Küken Herzklappen Regionen bietet ein zusätzliches Werkzeug für das Verständnis der kritischen zellulären Signalereignisse für Ventil Entwicklung. Unsere hier beschriebenen Protokoll nicht wesentlich von Standardproteinisolierungsverfahren abweichen. Jedoch durch Änderung einiger Schlüsselschritte, haben wir erfolgreich erhalten phosphoryliert Proteine ​​aus extrem kleinen Probengrößen. Um dieses Ergebnis zu erreichen, sind d...

Die Möglichkeit zur Identifizierung und Quantifizierung Proteinexpressionsniveaus ist eine Standardtechnik für tier- und zellbasierten Experimenten. Doch trotz langjähriger Interesse an der frühen embryonalen Herzklappen Entwicklung, Bewertung Proteinexpression in diesem speziellen Gewebe während der Entwicklung ist derzeit sowohl in der Immunhistochemie Küken und Maus 1,2 begrenzt. Ein Teil der Schwierigkeit der Quantifizierung der Proteinexpression in den Entwicklungs Ventile aller Modellorganismen (beispielsweise Küken und Maus) ist die geringe Größe der Ventile, die die Menge an Protein, die erhalten werden können, begrenzt. So für quantitative Analysen, die Forscher der Regel verlassen sich auf die RNA-Extraktion und Amplifikation für die anschließende quantitative PCR oder Microarray-Analyse 2-5. Jedoch sind RNA-und Protein-Expressionsniveaus nicht vollständig korrelativen 6, so sich auf RNA-Expression nicht eine strenge aufgrund der zahlreichen Änderungen, die in einem gegebenen Signalisierungs auftretenWegs zu verschiedenen Zeiten während Entwicklungen. Basierend auf dieser Grenze in der gegenwärtig verfügbaren Methoden, das Ziel dieses Verfahrens war es, ein Protokoll für die zuverlässige, ausreichende Mengen des Proteins aus den Entwicklungs embryonalen Maus Herzklappenbereiche für die quantitative Analyse der Änderungen, die in verschiedenen Signalwegen, die in wichtig auftreten entwickeln Die Reifung des Gewebes. Embryonale Ventile sind bereits häufig von Mäusen für die RNA-Isolierung und anschließende Genexpressionsanalyse 2-5 seziert. Allerdings haben diese Studien mit Gen-Expression als ein Auslesen der Signalwegs-Aktivierung, die nicht den Nachweis erkennen posttranslationalen Proteinmodifikationen, die nachgeschalteten Signal beeinflussen können zulässt beschränkt. Mit Hilfe der RNA-Isolierung Techniken als Ausgangspunkt, begannen wir mit sezieren die Regionen von Interesse. Da unser Interesse wurde phosphoryliert Proteine, die indikativ Erkennen von Signal pat warenHWAY Aktivität während einer bestimmten Zeit Aortenklappe Entwicklung (E13.5-14.5), führten wir alle Sektionen in phosphatfreien Tris-Puffer und die Ventile in einem Tris-Lyse-Puffer mit Phosphatase und Protease-Inhibitoren gesammelt. In unserem speziellen Fall nur die Aortenklappe Regionen wurden gesammelt, aber der Pulmonalklappe Bereich leicht zur gleichen Zeit erhalten werden. Die Ventilbereiche wurden dann homogenisiert und in Kombination mit einem Probenpuffer, der derzeit verwendet wird, um die Proteinexpression in adulten Herzklappen 7 zu untersuchen. Durch die Verwendung von kleinen Probenmengen (beispielsweise 2 ul) und Vereinigen Ventilbereiche von Embryonen mit dem gleichen Genotyp, waren wir in der Lage, phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Proteine ​​an embryonalen Tag 8 13,5 erfassen. Da die Ventilbereiche können eingefroren und in Lyse-Puffer gespeichert werden können, wenn Embryonen vor Pooling benötigt genotypisiert werden. Diese Technik erweitert den Satz von Tools, die für die Auswertung zur Verfügung stehen Zelle signaling Wege während der Entwicklung und eine quantitative Kompliment Immunhistochemie, die speziell für die Entwicklung von Herzklappen. Diese Technik sollte der Nutzen nicht nur für Entwicklungs Kardiologen, aber auch für alle Entwicklungsbiologen, die mit frühen Embryonen arbeiten, sind interessiert in Regionen, die begrenzte Gewebe enthalten sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:512px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Timed-pregnant mouse</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>To be dissected at the embryonic stage of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.1 M Tris, pH 7.6</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscissors</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine forceps, #5</td>
			<td style="width:125px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needle holders</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dissecting needles</td>
			<td style="width:125px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micropipette, 20 &#956;l, with tips</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysis buffer</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:125px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4906845001</td>
			<td>Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TissueLyser LT</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">85600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel beads</td>
			<td style="width:125px;">Qiagen</td>
			<td align="right">69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein isolation from the developing embryonic mouse heart valve region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Mit dieser Präparationstechnik, waren wir in der Lage, im Einzel Aortenklappe Regionen aus E13.5 Embryonen erkennen phosphoryliert Smad 1,5,8 (pSmad). Wie in 1A gezeigt, ist das Protein von sogar einer einzigen Ventilbereich isoliert ausreicht, um eine schwache pSmad Band zu erfassen. Signalintensität nimmt proportional zur Anzahl der Ventilbereiche, die gebündelt sind. Wichtig ist, bleibt die pSmad / β-Actin-Verhältnis in den verschiedenen Stichprobengrößen (Abbildung 1c)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region at JoVE.com

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Proteinisolierung aus den Entwicklungs embryonalen Mäuseherzklappen Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

protein-isolation-from-developing-embryonic-mouse-heart-valve

Research

JoVE Journal

Biology

9.2K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.