Il nostro protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di indagare il meccanismo molecolare dell'angiogenesi coronarica al di fuori di un organismo. Il principale vantaggio di questa tecnica è che modella accuratamente il processo di angiogenesi coronarica all'interno di un organismo, facilitando lo studio dei meccanismi dell'angiogenesi coronarica. Inizia spruzzando un topo incinta che trasporta embrioni del giorno embrionale 11,5 con il 70% di etanolo.
Sollevando la pelle sul ventre con le flessione, utilizzare le forbici per fare una pelle addominale e un'incisione peritoneale lateralmente e anteriormente fino al diaframma per esporre il corno uterino. Afferrando l'utero, tagliare il tessuto libero ed estrarre il corno uterino. Posizionare la stringa di embrioni in PBS sterile ghiacciato sotto un microscopio stereo e staccare il muscolo uterino, il sacco vitellino e la copertura di amnigio da ogni embrione.
Poiché ogni embrione è isolato, utilizzare un cucchiaio perforato per trasferire i tessuti in una nuova piastra di Petri contenente PBS sterile sul ghiaccio. Per raccogliere il tessuto cardiaco embrionale, trasferire il primo embrione ad essere sezionato in una nuova piastra di Petri al microscopio e posizionare l'embrione in lato ventrale verso l'alto. Utilizzare le forcep fini per fare una piccola incisione nel petto, leggermente sopra il diaframma, e inserire le forcep chiuse nell'incisione per ingrandire l'incisione.
Usando le forcep per tenere aperta la parete toracica per esporre il cuore e i polmoni, usa un secondo paio di forcep per muovere delicatamente il cuore anteriormente di 90 gradi per esporre l'aorta dorsale e la vena. Quindi, afferrando questi vasi alla base del cuore, estrarre con cura il cuore e i polmoni anteriormente e risciacquare i tessuti con PBS freddo. Quando tutto il tessuto cardiaco è stato raccolto, posizionare i campioni cardiaci al microscopio e rimuovere i lobi polmonari da ogni cuore.
Orientare il primo cuore sul lato dorsale, e tenendo il cuore alla sua base, utilizzare forcep fini per raschiare gli atri sinistro e destro nel tessuto adiacente che circonda la SV dal cuore. Per isolare l'SV, orientare il lato dorsale del cuore verso l'alto. Rimuovere con cura l'SV dal cuore e utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per posizionare il tessuto isolato in una nuova piastra di Petri di sei centimetri contenente PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio.
Per isolare l'intero ventricoli, rimuovere il tratto di deflusso e utilizzare una nuova pipetta di trasferimento sterile per posizionare i ventricoli in una piastra di Petri separata di sei centimetri contenente PBS sterile ghiacciato sul ghiaccio. Per impostare colture SV e ventricolari intere, rivestire prima le membrane di un inserto in PET di otto micrometri pore per pozzo di una piastra di coltura di 24 pozzi, con 100 microlitri di matrice extracellulare appena diluita per coltura per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quando la matrice si è solidificata, utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire un espianto su ogni inserto e spostare la piastra al microscopio.
Utilizzando forcep puliti, posizionare gli espianto al centro di ogni inserto per assicurarsi che non siano attaccati alle pareti laterali e rimuovere con cura eventuali PBS aggiuntivi. Successivamente, trasferire la piastra con il coperchio chiuso sotto una cappa di coltura tissutale a flusso laminare e aggiungere 100 microlitri di mezzo completo pre-riscaldato ad ogni inserto e 200 microlitri al pozzo sotto ogni inserto. Quindi aggiungere 300 microlitri di PBS a tutti i pozzi inutilizzati e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per cinque giorni.
Per il trattamento VEGF-A il secondo giorno di coltura, rimuovere il mezzo da entrambe le camere di ogni coltura e aggiungere 100 microlitri di PBS ad ogni inserto e 200 microlitri di PBS ad ogni pozzo. Dopo aver ruotato la piastra alcune volte, sostituire il PBS con 300 microlitri di mezzo basale integrati con siero bovino fetale all'1% per avviare le colture e riportare la piastra nell'incubatrice. Il terzo giorno dopo la fame, aggiungere 300 microlitri di mezzo basale fresco più siero ai pozzi di controllo e al mezzo basale più 50 nanogrammi per millilitro di VEGF-A ai pozzi di trattamento e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.
Il sesto giorno di coltura, lavare le camere con PBS come dimostrato e fissare le colture con 200 microlitri del 4% di paraformaldeide in ogni pozzo e 100 microlitri di fissatore in ogni inserto. Dopo 20 minuti a 4 gradi Celsius con dondolo, lavare le colture con 300 microlitri di PBS per 10 minuti per lavaggio con dondolo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale primaria ai pozzi e inserire per una coltura notturna a quattro gradi Celsius con dondolo.
La mattina seguente, lavare le colture 10 volte in tensioattivo non ionico in PBS con dondolo, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 10 minuti prima di etichettare le colture con 300 microlitri di un anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriato a quattro gradi Celsius durante la notte con dondolo. Il giorno dopo, lavare le colture 10 volte in PBS fresco con tensioattivo non ionico come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare forcep fini per sbucciare con cura la membrana da ogni inserto e posizionare le membrane su singoli vetrini al microscopio di vetro, esplantare il lato verso l'alto.
Coprire i campioni con il supporto di montaggio integrato DAPI in uno scivolo di copertura e sigillare i bordi del coperchio scivola con smalto chiaro. Quando lo smalto si è asciugato, immagini le diapositive con microscopia confocale. Man mano che le cellule SV iniziali crescono sul ventricolo cardiaco, smettono di produrre marcatori venosi come Coup-TF2.
Dopo cinque giorni di coltura, le cellule endoteliali SV germogliano e migrano sulla membrana. Come nel cuore embrionale, l'espressione di Coup-TF2 è ridotta man mano che i vasi migrano lontano dall'SV. Le colture stimolate con VEGF-A mostrano una maggiore crescita dei germogli angiogenici sia in densità che in lunghezza. Ulteriori colture SV stimolate da VEGF-A dimostrano un aumento quasi triplicato della lunghezza del germoglio rispetto ai controlli, suggerendo che i germogli endoteliali di SV ed endocardio rispondono a VEGF-A.
È importante non perdere il tessuto SV mentre si estraggono il cuore e i polmoni, rimuovendo gli atri e pulendo il tessuto adiacente che circonda l'SV. Gli esperimenti di imaging dal vivo possono essere eseguiti per visualizzare l'angiogenesi coronarica e catturare i dettagli della dinamica cellulare e molecolare durante il processo. Questa tecnica è estremamente utile per valutare potenziali meccanismi molecolari dell'angiogenesi coronarica e come sistema modello per lo studio dell'angiogenesi in generale.
