Questo progetto è stato finanziato dal Land Baden-Württemberg, nonché dall&#39;Unione Europea, Europäischer Fonds für die Entwicklung Regionale. Gli autori ringraziano Rainer Wittig (ILM Ulm) per fornire la linea cellulare U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 e Claudia Hintze per l&#39;assistenza tecnica abile.

1 Cella Coltivazione Spheroid e incubazione <ol><li> Esperimento 1: Cellulari sferoidi incubate con un farmaco chemioterapico <ol><li> Preparare agarosio 1,5% in terreno di coltura con l&#39;aggiunta di 0,45 g di agarosio a 30 ml di terreno di coltura (sufficiente per 6 piastre). </li><li> Scaldare la miscela dal punto 1.1.1 ad almeno 80 ° C agitando di tanto in tanto. </li><li> Riempire 50 ml di miscela riscaldata dal punto 1.1.2 in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e lasciare solidificare in 1-2 ore. Conservare le piastre chiuse e coperte in frigorifero a 5 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Seed circa 150 MCF-7 cellule di cancro al seno in ciascun pozzetto della piastra preparata a 96 pozzetti in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) con mezzo di F-12 cultura del prosciutto supplementato con 10% di siero fetale bovino (FCS) e 1% di penicillina / streptomicina . </li><li> Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 3776; C. </li><li> Incubare le sferoidi di cellule con antracicline doxorubicina cloridrato antibiotico per 6 ore ad una concentrazione compresa tra 2 e 8 mM mM (in terreno di coltura) in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C. </li><li> Lavare gli sferoidi cellulari con terreno di coltura o di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) prima di microscopia. </li></ol></li><li> Esperimento 2: processo di ossidazione in sferoidi che esprimono un sensore di redox <ol><li> Seed circa 400 cellule di glioblastoma U251-MG-L106 trasfettate stabilmente con il glutatione sensore redox verde fluorescente sensibile GRX1-roGFP2 in pozzi gel-rivestito agarosio (procedura descritta nei passaggi 1.1.1-1.1.3) di una piastra a 96 pozzetti in DMEM mezzo di coltura supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e igromicina B (150 mcg / ml). </li><li> Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C. </li><li> Aggiungere 10 &amp; #181, l di soluzione di perossido di idrogeno (purum pa, ≥ 30%) per 990 ml di acqua bi-distillata per creare una soluzione madre di 100 mM per essere utilizzato entro le 12 ore. </li><li> Diluire la soluzione stock a partire dal punto 1.2.3 a 50 micron di EBSS destra prima dell&#39;esperimento. </li><li> Incubare le sferoidi di cellule attraverso il sistema di microfluidica durante la misurazione con acqua ossigenata 50 micron di EBSS per l&#39;ossidazione del sensore di redox. </li></ol></li><li> Esperimento 3: Iniziazione e l&#39;etichettatura di necrosi cellulare all&#39;interno di sferoidi <ol><li> Seed circa 400 cellule (ad esempio, U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 cellule di glioblastoma) in pozzetti di gel-rivestito agarosio (procedura descritta nei passaggi 1.1.1-1.1.3) di una piastra a 96 pozzetti in terreno di coltura DMEM supplementato con 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina e igromicina B (150 mg / ml). </li><li> Crescere sferoidi per 5-7 giorni fino ad un diametro di circa 200-300 micron in un incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C. </li><li> Incubare la cellasferoidi con l&#39;mitocondriale di trasporto degli elettroni inibitore rotenone per 3 ore ad una concentrazione di 1 mM in mezzo di coltura per indurre necrosi cellulare. Inoltre, co-incubare con una citotossicità colorante verde per 3 ore ad una concentrazione di 1 ml in 1 ml di terreno di coltura per etichettare le cellule necrotiche. </li><li> Lavare gli sferoidi di cellule con terreno di coltura o EBSS prima di microscopia. </li></ol></li></ol> 2 Regolazione foglio leggero NOTA: Per ottenere i migliori risultati che è necessario garantire che la vita fascio del foglio luce è nel piano di messa a fuoco della lente dell&#39;obiettivo. La posizione della cintura fascio può essere allineato soltanto in base al foglio leggero in posizione verticale rispetto al capillare (vedi i punti 2,5-2,8). <ol><li> Utilizzare un microscopio invertito e montare il modulo di eccitazione SPIM, come descritto in rif. 16, alla piastra di base della tabella di posizionamento (vedere Figura 1A). </li><li> Dotare il microscopio con un 10X / o 20X 0,3 / 0,5 microscopio lente obiettivo e un appropriato filtro passa-lunga (ad esempio, λ ≥ 515 nm) nel percorso rilevamento del microscopio. </li><li> Montare una telecamera integrazione alla porta di rivelazione del microscopio. </li><li> Utilizzare un fascio collimato parallelo di un laser o un diodo laser con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 470 nm e preferenzialmente applicarlo al modulo SPIM. </li><li> Ruotare la lente cilindrica di 90 gradi, che trasferisce il foglio leggero in una posizione verticale per una regolazione assiale del fascio vita del foglio leggero. </li><li> Inserire un capillare contenente un liquido con un colorante fluorescente nel portacampioni. </li><li> Fissare il supporto del campione con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio e allineare la posizione del capillare tale che sia centrato e la vita fascio del foglio leggero è a fuoco. </li><li> Regolare la vita fascio tramite la variazione della posizione assiale della lente cilindrica stessa. Tornare indietro l&#39;obiettivo dopo annuncioalcuna regolazione. </li></ol> 3. cellulare Spheroid Applicazione e sincronizzazione feed Microscopio <ol><li> Posizionare le sferoidi di cellule separatamente o in gruppi all&#39;interno di borosilicato capillari di vetro rettangolare 16 con una sezione trasversale interna di 600 micron x 600 micron ed uno spessore di 120 micron. Due tecniche per l&#39;applicazione di uno sferoide cellule hanno dimostrato di avere successo. <ol><li> Prendete il capillare vuoto in posizione verticale con il pollice e il dito medio e sigillare l&#39;apertura superiore con il dito indice. Portare l&#39;apertura inferiore vicino al sferoide cellulare nel suo liquido circostante (EBSS o terreno di coltura). Rilasciare il dito indice dall&#39;apertura superiore. Liquido con la sferoide cellule in esso sarà messo a bagno in subito da forze capillari. Regolare la posizione dello sferoide all&#39;interno del capillare riempito da gravitazione nella rispettiva posizione verticale del capillare. </li><li> In alternativa, applicare il sferoide cella alla capillare mediante pipettaggio. Fate attenzione that l&#39;apertura della punta della pipetta è, da un lato, abbastanza grande per la dimensione sferoide e, dall&#39;altro, minore o uguale di dimensioni al diametro interno del capillare. </li></ol></li><li> Posizionare il capillare con la sferoide in in un supporto speciale campione per la microscopia. </li><li> Fissare il supporto del campione con il capillare al tavolo di posizionamento del microscopio e allineare la posizione dello sferoide cella tale che sia centrata e focalizzata. </li><li> Impostare la corrispondenza tra il foglio leggero ed il piano focale del microscopio lente obiettivo nel percorso rilevamento regolando la posizione dello specchio di riflessione e la lente cilindrica (vedi vite di regolazione nella Figura 1B). </li><li> Regolare la vite micrometrica (vedi Figura 1B) secondo gli indici di rifrazione e l&#39;apertura numerica della lente dell&#39;obiettivo per compensare l&#39;effetto di acquario. NOTA: diversi indici di rifrazione del campione e dei media t circostantiegli lente piombo obiettivo di una differenza tra lo spostamento della lente dell&#39;obiettivo e lo spostamento del piano focale. Poiché il foglio leggero viene spostato dalla torretta obiettivo, la mancata corrispondenza tra lo spostamento del foglio leggero (corrispondente allo spostamento della lente dell&#39;obiettivo) e lo spostamento del piano focale è compensata da un braccio di leva (vedere Figura 1B). La vite micrometrica viene utilizzata per adattare la distanza tra la parte superiore e il perno inferiore per regolare lo spostamento del foglio leggero secondo l&#39;apertura numerica della lente obiettivo e gli indici di rifrazione. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 (A) Immagine del singolo modulo illuminazione aereo montato sul basamento del tavolo di posizionamento di un microscopio invertito, (B) la configurazione del singolo piano di illuminazionemodulo e la sincronizzazione dei mangimi microscopio per compensare il sollevamento-mancata corrispondenza (effetto acquario) tra il piano focale e il piano di illuminazione. Az o indica lo spostamento della lente obiettivo e Az f lo spostamento del piano focale e il foglio leggero. L&#39;intarsio mostra sezioni di sferoidali contenenti capillari. A sinistra: capillare rettangolare con diametro interno di 600 micron (parete 120 micron). A destra: il programma di installazione utilizzato per la rotazione. Una capillare interno rotondo (diametro interno 400 micron, diametro esterno 550 micron) viene ruotato all&#39;interno del capillare rettangolare esterno. Lo spazio tra i due capillari è riempito con un liquido di immersione. 4 Misura in liquido dinamico Ambiente NOTA: Il precedente protocollo viene utilizzato per l&#39;incubazione statica prima di una misurazione in cui il sferoide cella è già stato incubato e poi tenuto in posto nel capillare per semplice gravità. Non vi è alcuna necessità di ulteriori fixatisu. Tuttavia, per misure in flusso multimediale in cui una incubazione dinamico e, quindi, un ambiente dinamico è auspicabile per misurare la cinetica di assorbimento, si può raggiungere questo sub-protocollo. I passaggi 4,5-4,9 sono fondamentali per evitare bolle d&#39;aria che raggiungono il campione. <ol><li> Riempire il capillare con FCS per 30 min a sostenere l&#39;adesione successiva cellulare di uno sferoide cella alla superficie del vetro interno. </li><li> Lasciate il rivestimento FCS rimanente nel capillare impoverito asciugare per almeno 12 ore. </li><li> Introdurre il sferoide cella alla capillare rivestito FCS come descritto al punto 3.2. </li><li> Lasciare il capillare in incubatore al 5% di CO 2 e 37 ° C per ulteriori 2-4 ore a causare adesione cellulare della sferoide. </li><li> Impostare la parte afflusso del sistema microfluidica (vedere Figura 2). Utilizzare una pompa peristaltica per riempire l&#39;afflusso del tubo (diametro interno: 0,89 millimetri) con mezzo di coltura contenente il colorante fluorescente, droga o l&#39;agente. </li><li> Connect parte afflusso del sistema microfluidica ad un gorgogliatore (vedi figura 2). </li><li> Innanzitutto serrare il capillare senza bolle al tubo afflusso e quindi serrare l&#39;altro lato del capillare al tubo di scarico. </li><li> Tune la temperatura del liquido della vasca dell&#39;acqua al valore desiderato (ad esempio, 37 ° C). </li><li> Regolare la pompa peristaltica alla velocità della pompa desiderata (ad esempio, portata: 9 ml / min; velocità pompa nel capillare: 25 mm / min). </li><li> Raccogliere il liquido pompato o in un recipiente (configurazione ad anello aperto), dargli da mangiare alla sua fonte (configurazione a circuito chiuso) o alimentarlo direttamente nel tubo della pompa peristaltica (configurazione a circuito chiuso a tenuta). </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 impostazione Microfluidic (anello aperto e stretto a circuito chiuso); intarsio: Illuminazione di un spheroid all&#39;interno di un micro-capillare mediante foglio leggero microscopia a fluorescenza basato accoppiato ad un microscopio invertito. 5. acquisizione dati e analisi <ol><li> Impostare la potenza del laser e il tempo di integrazione per l&#39;acquisizione delle immagini. </li><li> Fare attenzione che i parametri definiti al punto 5.1 non superano i valori di dose di luce circa 50-100 J / cm 2 per le cellule native o 10-20 J / cm 2 per le cellule incubate con un colorante fluorescente o transfettate con un plasmide codifica proteina fluorescente a evitare di fototossicità (per i dettagli vedi Rif. 12). </li><li> Impostare l&#39;incremento per la z-stack per Az = 5-10 micron, che è preferibile per l&#39;analisi dei dati 3-dimensionale, come lo spessore della lamiera della luce è di circa 10 micron. </li><li> Eseguire misurazioni di singole immagini o z-stack dalla variazione del piano focale all&#39;interno della sferoide cellulare. </li></ol>

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Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il presente manoscritto descrive un foglio leggero o singola microscopia illuminazione piano (SPIM) dispositivo che è ottimizzato per sistemi cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Tre applicazioni esemplari sono (1) l&#39;assorbimento di un farmaco citostatico e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione (il cui contributo all&#39;efficacia chemioterapici rimane ancora da valutare), (2) le misurazioni dello stato redox mediante l&#39;uso di un sensore di...

Oltre ai metodi ben consolidati (confocale o multi-fotone microscopia a scansione laser 1-4, strutturato illuminazione microscopia 5,6) foglio di luce o di solo piano di microscopia illuminazione (SPIM) ha dimostrato di essere un metodo valido di imaging 3D 7,8, 9. Di particolare interesse è la sua applicazione di colture cellulari 3-dimensionale, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS), che vengono utilizzati sempre più per la ricerca di scoperta della droga 10,11. Inoltre, SPIM è un metodo preferenziale in cui anche in caso di esposizione a lungo termine o misurazioni ripetute dosi di scarsa luminosità sono tenuti a mantenere la vitalità del campione, dal momento che per la misura di ogni piano del campione solo questo piano è esposto alla luce. Questo è in contrasto con altre tecniche di microscopia, dove per la rilevazione di ciascun piano focale è illuminato l&#39;intero campione, in modo che dopo la registrazione di numerosi piani somme dose di luce e può danneggiare il campione 12. </p&gt; Microscopia foglio leggero o SPIM si basa sulla illuminazione del campione in direzione perpendicolare al percorso osservazione mediante l&#39;uso di una lente cilindrica o effettuando la scansione del fascio laser eccitante (per una rassegna vedi cod. 8). Questo spesso richiede camere di campioni speciali 13,14 o matrici, ad esempio, agarosio 7,15, realizzato in microscopi speciali ad alto costo. In alternativa a tali sistemi è stato sviluppato un semplice dispositivo di illuminazione comparabilmente per SPIM e adattato ad un microscopio invertito convenzionale 16 (vedi Figura 1). È costituita da un fascio laser espanso ad un diametro di 8 mm e focalizzato da una lente cilindrica (lunghezza focale: 50 mm, apertura numerica: 0.08) per un foglio leggero spessore di 6-10 micron su una profondità di campo di circa 100 micron . I campioni sono situati in un capillare rettangolare di 600-900 micron di diametro interno posizionato davanti al microscopio len obiettivos per il rilevamento della fluorescenza. Queste caratteristiche principali sono attualmente completate e ottimizzati mediante l&#39;uso di approcci micro-capillari avanzata per la tenuta e per ruotare i campioni, la regolazione sincrona del foglio leggero illuminante (in direzione assiale) e la lente obiettivo utilizzati per il rilevamento di fluorescenza (cammino ottico identico lunghezze di spostamento richiedono una correzione del trascinamento meccanico), e l&#39;adattamento di un sistema microfluidica per l&#39;applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci, minimizzando così i quantitativi e le spese richieste.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:243px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:201px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">&#160;Catalog Number</td>
			<td style="width:376px;">Comments/Description(optional)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microtiter plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430100</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">agarose&#160;</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3810.1</td>
			<td>for cell spheroid growing</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">MCF-7 cell line</td>
			<td>CLS Cell Lines Service GmbH</td>
			<td>300273</td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">U251-MG-L106 cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell line</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG0435</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">DMEM/Ham&#39;s F-12</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>FG4815</td>
			<td>culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">FCS</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>S0615</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">hygromycin B</td>
			<td style="width:201px;">PAA Laboratories&#160;&#160;</td>
			<td>P02-015</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">EBSS</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>E3024</td>
			<td>cell culture supplement</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">doxorubicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>D1515</td>
			<td>fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">green cytotoxicity dye</td>
			<td>Promega GmbH</td>
			<td>G8742</td>
			<td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>R8875</td>
			<td>cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">hydrogen peroxide (H2O2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Inc.</td>
			<td>95302</td>
			<td>reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">capillary</td>
			<td>VitroCom&#160;</td>
			<td>8260-050</td>
			<td>sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Jena</td>
			<td>Axiovert 200M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioCam MRc CCD-camera</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>426508-9901-000</td>
			<td>CCD-camera</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">AxioVision data aquisition software</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td>
			<td>version 4.8.2.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">laser diode</td>
			<td>Pico Quant GmbH</td>
			<td>LDH-P-C-470</td>
			<td>used with driver PDL800-B</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">perestaltic pump</td>
			<td>Ismatec Labortechnik</td>
			<td>MS-1 Reglo</td>
			<td>re-callibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">silicone tubes</td>
			<td>IDEX Health &#38; Science GmbH</td>
			<td>TYGON R3607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Un modulo per foglio leggero o solo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari in 3 dimensioni, ad esempio, sferoidi tumorali multicellulari (MCTS). Il modulo SPIM eccitazione forme e devia la luce in modo tale che il campione è illuminato da un foglio leggero perpendicolare al percorso rilevamento del microscopio. Il sistema è caratterizzato dall&#39;uso di un capillare rettangolare per la tenuta (e in una versione avanzata anche da un approccio micro-capillare per ruotare) i campioni, regolando sincrono del foglio leggero illuminante e la lente obiettivo utilizzato per la rilevazione della fluorescenza e da adattamento di un sistema microfluidica per l&#39;applicazione di coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci in piccole quantità. Un protocollo per lavorare con questo sistema è dato, e alcuni dettagli tecnici sono riportati. Risultati rappresentativi includono (1) misure del pianoprendere di un farmaco citostatico (doxorubicina) e la sua conversione parziale di un prodotto di degradazione, (2) misure redox mediante l&#39;uso di un sensore di glutatione geneticamente codificato dopo l&#39;aggiunta di un agente ossidante, e (3) l&#39;inizio e l&#39;etichettatura di necrosi cellulare su inibizione di la catena respiratoria mitocondriale. Differenze e vantaggi del presente modulo SPIM in confronto con i sistemi esistenti sono discussi.

Esperimento 1: Cellulari sferoidi incubate con un farmaco chemioterapico Una scansione z-stack di una precedentemente incubate MCF-7 sferoidale celle (8 micron doxorubicina, 6 ore) è illustrato in Figura 3. Esso fornisce informazioni dettagliate circa l&#39;assorbimento cellulare e la distribuzione di doxorubicina 17 e del suo prodotto di degradazione 18,19. All&#39;interno della cella strato esterno della doxorubicina fluorescente ros...

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Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Un modulo per singolo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari 3-dimensionale. Il campione si trova all&#39;interno di un capillare rettangolare, e tramite un sistema di microfluidica coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci può essere applicato in piccole quantità.

Singolo Aereo Illuminazione Module e approccio micro-capillare per un microscopio a largo campo

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

9.6K Views.  Aalen University.  Un modulo per singolo piano di illuminazione microscopia (SPIM) è descritto, che si adatta facilmente ad un microscopio a largo campo invertito e ottimizzato per colture cellulari 3-dimensionale. Il campione si trova all'interno di un capillare rettangolare, e tramite un sistema di microfluidica coloranti fluorescenti, agenti farmaceutici o farmaci può essere applicato in piccole quantità. 

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Construction of a High Resolution Microscope with Conventional and Holographic Optical Trapping Capabilities

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular organelles 2,3, as well as for high spatial and temporal resolution readout of their position relative to the center of the trap. The system described herein has one such "traditional" trap operating at 980 nm. It additionally provides a second optical trapping system that uses a commercially available holographic package to simultaneously create and manipulate complex trapping patterns in the field of view of the microscope 4,5 at a wavelength of 1,064 nm. The combination of the two systems allows for the manipulation of multiple refractive objects at the same time while simultaneously conducting high speed and high resolution measurements of motion and force production at nanometer and piconewton scale.

The system described herein employs a traditional optical trap as well as an independent holographic optical trapping line, capable of creating and manipulating multiple traps. This allows for the creation of complex geometric arrangements of refractive particles while also permitting simultaneous high-speed, high-resolution measurements of the activity of biological enzymes.

Costruzione di un microscopio ad alta risoluzione con convenzionali e Holographic Capabilities intrappolamento ottico

High resolution microscope systems with optical traps allow for precise manipulation of various refractive objects, such as dielectric beads 1 or cellular ...

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Analysis of Contact Interfaces for Single GaN Nanowire Devices

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit a strong degradation after annealing due to the occurrence of void formation at the contact/SiO2 interface. This void formation can cause cracking and delamination of the metal film, which can increase the resistance or lead to a complete failure of the NW device. In order to address issues associated with void formation, a technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from the substrates to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN NW devices. This procedure determines the degree of adhesion of the contact films to the substrate and NWs and allows for the characterization of the morphology and composition of the contact interface with the substrate and nanowires. This technique is also useful for assessing the amount of residual contamination that remains from the NW suspension and from photolithographic processes on the NW-SiO2 surface prior to metal deposition. The detailed steps of this procedure are presented for the removal of annealed Ni/Au contacts to Mg-doped GaN NWs on a SiO2 substrate.

A technique was developed that removes Ni/Au contact metal films from their substrate to allow for the examination and characterization of the contact/substrate and contact/NW interfaces of single GaN nanowire devices.

Analisi di contatto Interfacce semplici dispositivi GaN nanowire

Single GaN nanowire (NW) devices fabricated on SiO2 can exhibit  a strong degradation after annealing due to the  occurrence of void formation at the ...

Measuring Material Microstructure Under Flow Using 1-2 Plane Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is presented. The SANS shear cell consists of a concentric cylinder Couette geometry that is sealed and rotating about a horizontal axis so that the vorticity direction of the flow field is aligned with the neutron beam enabling scattering from the 1-2 plane of shear (velocity-velocity gradient, respectively). This approach is an advance over previous shear cell sample environments as there is a strong coupling between the bulk rheology and microstructural features in the 1-2 plane of shear. Flow-instabilities, such as shear banding, can also be studied by spatially resolved measurements. This is accomplished in this sample environment by using a narrow aperture for the neutron beam and scanning along the velocity gradient direction. Time resolved experiments, such as flow start-ups and large amplitude oscillatory shear flow are also possible by synchronization of the shear motion and time-resolved detection of scattered neutrons. Representative results using the methods outlined here demonstrate the useful nature of spatial resolution for measuring the microstructure of a wormlike micelle solution that exhibits shear banding, a phenomenon that can only be investigated by resolving the structure along the velocity gradient direction. Finally, potential improvements to the current design are discussed along with suggestions for supplementary experiments as motivation for future experiments on a broad range of complex fluids in a variety of shear motions.

A shear cell is developed for small-angle neutron scattering measurements in the velocity-velocity gradient plane of shear and is used to characterize complex fluids. Spatially resolved measurements in the velocity gradient direction are possible for studying shear-banding materials. Applications include investigations of colloidal dispersions, polymer solutions, and self-assembled structures.

Misurare Materiale microstruttura Under flusso Utilizzo di 1-2 aereo Flow-Small Angle Neutron Scattering

A new small-angle neutron scattering (SANS) sample environment optimized for studying the microstructure of complex fluids under simple shear flow is ...

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) performed on thin sections of rodent tissues: kidneys and tumor, allows the detection of inorganic elements such as (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, and Fe, naturally present in the body and (ii) Si and Gd, detected after the injection of gadolinium-based nanoparticles. The animals were euthanized 1&#160;to 24 hr&#160;after intravenous injection of particles. A two-dimensional scan of the sample, performed using a motorized micrometric 3D-stage, allowed the infrared laser beam exploring the surface with a lateral resolution less than 100 &#956;m. Quantitative chemical images of Gd element inside the organ were obtained with sub-mM sensitivity. LIBS offers a simple and robust method to study the distribution of inorganic materials without any specific labeling. Moreover, the compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of the same biological tissue with different types of response:&#160;elemental, molecular, or cellular.

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle&#039;s Mapping and Quantification in Organ Tissue

Laser-induced breakdown spectroscopy performed on thin organ and tumor tissue successfully detected natural elements and artificially injected gadolinium (Gd), issued from Gd-based nanoparticles. Images of chemical elements reached a resolution of 100 &#956;m and quantitative sub-mM sensitivity. The compatibility of the setup with standard optical microscopy emphasizes its potential to provide multiple images of a same biological tissue.

Spettroscopia Laser-Induced Breakdown: un nuovo approccio per la mappatura di nanoparticelle e la quantificazione in Tissue Organ

Emission spectroscopy of laser-induced plasma was applied to elemental analysis of biological samples. Laser-induced breakdown spectroscopy (LIBS) ...

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. The aggressive scaling of feature sizes, both on devices and interconnects, leads to serious challenges to ensure the required product reliability. Standard reliability tests and post-mortem failure analysis provide only limited information about the physics of failure mechanisms and degradation kinetics. Therefore it is necessary to develop new experimental approaches and procedures to study the TDDB failure mechanisms and degradation kinetics in particular. In this paper, an in situ experimental methodology in the transmission electron microscope (TEM) is demonstrated to investigate the TDDB degradation and failure mechanisms in Cu/ULK interconnect stacks. High quality imaging and chemical analysis are used to study the kinetic process. The in situ electrical test is integrated into the TEM to provide an elevated electrical field to the dielectrics. Electron tomography is utilized to characterize the directed Cu diffusion in the insulating dielectrics. This experimental procedure opens a possibility to study the failure mechanism in interconnect stacks of microelectronic products, and it could also be extended to other structures in active devices.

In Situ Time-dependent Dielectric Breakdown in the Transmission Electron Microscope: A Possibility to Understand the Failure Mechanism in Microelectronic Devices

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. This paper demonstrates the procedure of an in situ TDDB experiment in the transmission electron microscope, which opens a possibility to study the failure mechanism in microelectronic products.

In Situ in funzione del tempo di rottura dielettrico nel Transmission Electron Microscope: A Con possibilità di capire il meccanismo Fallimento in dispositivi microelettronici

The time-dependent dielectric breakdown (TDDB) in on-chip interconnect stacks is one of the most critical failure mechanisms for microelectronic devices. ...

Compact Lens-less Digital Holographic Microscope for MEMS Inspection and Characterization

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and automotive. However, effective inspection and characterization metrology systems are needed to ensure the functional reliability of MEMS. This study presents a system based on digital holography as a tool for MEMS metrology. Digital holography has gained increasing attention in the past 20 years. With the fast development and decreasing cost of sensor arrays, resolution of such systems has increased broadening potential applications. Thus, it has attracted attention from both research and industry sides as a potential reliable tool for industrial metrology. Indeed, by recording the interference pattern between an object beam (which contains sample height information) and a reference beam on a CCD camera, one can retrieve the quantitative phase information of an object. However, most of digital holographic systems are bulky and thus not easy to implement on industry production lines. The novelty of the system presented is that it is lens-less and thus very compact. In this study, it is shown that the Compact Digital Holographic Microscope (CDHM) can be used to evaluate several characteristics typically consider as criteria in MEMS inspections. The surface profiles of MEMS in both static and dynamic conditions are presented. Comparison with AFM is investigated to validate the accuracy of the CDHM.

We present a compact reflection digital holographic system (CDHM) for inspection and characterization of MEMS devices. A lens-less design using a diverging input wave providing natural geometrical magnification is demonstrated. Both static and dynamic studies are presented.

Lens-meno compatta digitale olografico microscopio per MEMS di ispezione e caratterizzazione

A micro-electro-mechanical-system (MEMS) is a widely used component in many industries, including energy, biotechnology, medical, communications, and ...

Hand Controlled Manipulation of Single Molecules via a Scanning Probe Microscope with a 3D Virtual Reality Interface

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building blocks in a bottom-up approach is still open. The scanning probe microscope (SPM) could be a tool of choice; however, SPM-based manipulation was until recently limited to two dimensions (2D). Binding the SPM tip to a molecule at a well-defined position opens an opportunity of controlled manipulation in 3D space. Unfortunately, 3D manipulation is largely incompatible with the typical 2D-paradigm of viewing and generating SPM data on a computer. For intuitive and efficient manipulation we therefore couple a low-temperature non-contact atomic force/scanning tunneling microscope (LT NC-AFM/STM) to a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles. This setup permits &#34;hand controlled manipulation&#34; (HCM), in which the SPM tip is moved according to the motion of the experimenter&#39;s hand, while the tip trajectories as well as the response of the SPM junction are visualized in 3D. HCM paves the way to the development of complex manipulation protocols, potentially leading to a better fundamental understanding of nanoscale interactions acting between molecules on surfaces. Here we describe the setup and the steps needed to achieve successful hand-controlled molecular manipulation within the virtual reality environment.

We demonstrate the precise manipulation of individual organic molecules on a metal surface with the tip of a scanning probe microscope driven in 3D by the experimenter's hand using a motion capture system and fully immersive virtual reality goggles.

A mano controllata manipolazione di singole molecole attraverso un microscopio a scansione di sonda con una realtà virtuale 3D

Considering organic molecules as the functional building blocks of future nanoscale technology, the question of how to arrange and assemble such building ...

Demonstration of a Hyperlens-integrated Microscope and Super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and nanotechnology. Although near-field scanning microscopy and superlenses have improved the resolution in the near-field region, far-field imaging in real-time remains a significant challenge. Recently, the hyperlens, which magnifies and converts evanescent waves into propagating waves, has emerged as a novel approach to far-field imaging. Here, we report the fabrication of a spherical hyperlens composed of alternating silver (Ag) and titanium oxide (TiO2) thin layers. Unlike a conventional cylindrical hyperlens, the spherical hyperlens allows for two-dimensional magnification. Thus, incorporation into conventional microscopy is straightforward. A new optical system integrated with the hyperlens is proposed, allowing for a sub-wavelength image to be obtained in the far-field region in real time. In this study, the fabrication and imaging setup methods are explained in detail. This work also describes the accessibility and possibility of the hyperlens, as well as practical applications of real-time imaging in living cells, which can lead to a revolution in biology and nanotechnology.

The use of a hyperlens has been regarded as a novel super-resolution imaging technique due to its advantages in real-time imaging and its simple implementation with conventional optics. Here, we present a protocol describing the fabrication and imaging applications of a spherical hyperlens.

Dimostrazione di un microscopio Hyperlens-integrato e super-resolution Imaging

The use of super-resolution imaging to overcome the diffraction limit of conventional microscopy has attracted the interest of researchers in biology and ...

All-electronic Nanosecond-resolved Scanning Tunneling Microscopy: Facilitating the Investigation of Single Dopant Charge Dynamics

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new techniques capable of characterizing their dynamics. Investigating single dopants requires sub-nanometer spatial resolution, which motivates the use of scanning tunneling microscopy (STM). However, conventional STM is limited to millisecond temporal resolution. Several methods have been developed to overcome this shortcoming, including all-electronic time-resolved STM, which is used in this study to examine dopant dynamics in silicon with nanosecond resolution. The methods presented here are widely accessible and allow for local measurement of a wide variety of dynamics at the atomic scale. A novel time-resolved scanning tunneling spectroscopy technique is presented and used to efficiently search for dynamics.

We demonstrate an all-electronic method to observe nanosecond-resolved charge dynamics of dopant atoms in silicon with a scanning tunneling microscope.

Tutto-elettronico nanosecondo-risolto scansione microscopio a effetto tunnel: Agevolare le indagini di drogante singola carica dinamica

The miniaturization of semiconductor devices to scales where small numbers of dopants can control device properties requires the development of new ...

Single-Digit Nanometer Electron-Beam Lithography with an Aberration-Corrected Scanning Transmission Electron Microscope

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by employing an aberration-corrected scanning transmission electron microscope as the exposure tool. Here, we present results of single-digit nanometer patterning of two widely used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. The method achieves sub-5 nanometer features in poly (methyl methacrylate) and sub-10 nanometer resolution in hydrogen silsesquioxane. High-fidelity transfer of these patterns into target materials of choice can be performed using metal lift-off, plasma etch, and resist infiltration with organometallics.

We use an aberration-corrected scanning transmission electron microscope to define single-digit nanometer patterns in two widely-used electron-beam resists: poly (methyl methacrylate) and hydrogen silsesquioxane. Resist patterns can be replicated in target materials of choice with single-digit nanometer fidelity using liftoff, plasma etching, and resist infiltration by organometallics.

Cifra nanometri Litografia di fascio di elettroni con un microscopio elettronico di aberrazione-corretta scansione trasmissione

We demonstrate extension of electron-beam lithography using conventional resists and pattern transfer processes to single-digit nanometer dimensions by ...