Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della Fondazione Tedesca per la Ricerca (SFB / TRR57, Q3 e Q2). Gli autori ringraziano Mareike Schulz, Pascal Paschenda, e Klaudia Warzecha per il loro aiuto nella preparazione fotografie.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali dello Stato e uso comitato ufficiale (LANUV, Recklinghausen, Germania). I topi sono alloggiati in condizioni specifiche del-libera patogeni secondo le linee guida della Federazione per il laboratorio scientifico Associazioni animali (FELASA). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e &#39;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio&#39; (National Institutes of Health pubblicazione 8 ° edizione, 2011). 1. prechirurgica Preparazione NOTA: Eseguire tutte le operazioni in condizioni di pulizia, ma non sterili. Tutti gli strumenti e altre attrezzature riutilizzabili, come pinze chirurgiche, forbici, e Colibri divaricatore che vengono utilizzati per eseguire un intervento chirurgico devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso secondo protocolli che sono in stretta conformità con le linee guida istituzionali per l&#39;esecuzione di interventi chirurgici negli animali., Per un elenco dettagliato dei necessari reagenti, materiali e attrezzature, si prega di consultare l&#39;elenco dei materiali specifici / attrezzature. <ol><li> Durante la sperimentazione completa, mantenere l&#39;animale su una piastra di riscaldamento ad una temperatura di 37 ° C, permanentemente collegata ad un sistema di anestesia, e la copertura della zona operativa complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Correttamente organizzare tutti strumentazioni e le soluzioni che vengono utilizzati durante la sperimentazione prima della chirurgia (Figura 1). </li><li> Anestetizzare il mouse con inalazione di 4 vol% isoflurano in ossigeno al 100% con una portata di 4 l / min per l&#39;induzione di anestesia. La profondità di anestesia è sufficiente al raggiungimento dei seguenti criteri fondamentali: la respirazione regolare spontanea, senza il riflesso dopo aver impostato di stimoli del dolore tra le dita dei piedi, e nessuna risposta al dolore. </li><li> Accorciare il pelo addominale del mouse con un rasoio elettrico pelliccia e proteggere gli occhi dalla disidratazione da uso dell&#39;occhio e nose pomata. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra calda riscaldata 37 ° C, inserire il muso mouse nella maschera Fluovac del sistema di anestesia Fluovac, e fissare le gambe dell&#39;animale con strisce di nastro seta. </li><li> Mantenere anestesia del mouse per inalazione di 1,5-3% vol isoflurano in ossigeno al 100% ad una velocità di flusso di 1 l / min e induct analgesia perioperatoria tramite iniezione intraperitoneale di soluzione di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo sciolto in 0,9% soluzione di NaCl) . </li><li> Sterilizzare la pelle addominale rasata con un tampone di garza che viene inumidito con uno standard antisettico, pronta all&#39;uso soluzione alcolica per il trattamento pre-operatorio della pelle. Nota: Nei nostri protocolli usiamo una pelle antisepticum poli-alcool. Questo è in pieno accordo con la legge federale tedesca in materia di protezione degli animali e delle linee guida della Federazione per laboratorio scientifico Associazioni animali. Questo antisettica contiene il 70% (v / v) 2-propanolo, butan-1,3.diol e tracce di chinolina giallo, e perfume. </li></ol> 2. Procedure chirurgiche <ol><li> Aprire l&#39;addome con una laparotomia mediana di una lunghezza di circa 2 cm tagliando la cute più fascia allo stesso tempo con una forbice chirurgica 11,5 centimetri. </li><li> Sezionare il tessuto connettivo sopra del peritoneo utilizzando il forbice come spreader. </li><li> Tagliare il peritoneo lungo la linea alba per aprire la cavità peritoneale. </li><li> Ingrandire la cavità inserendo una sutura partecipazione in sterno, sollevando il filamento della sutura, e fissandolo in cima alla maschera Fluovac. </li><li> Distribuire la zona di operazione inserendo un riavvolgitore Colibri nella cavità peritoneale (Figura 2). </li><li> Sollevare il fegato con una idratata (0,9% NaCl soluzione) il tampone in modo che il lato ventrale si attacca alla membrana e l&#39;ilo è chiaramente visibile. </li><li> Esporre il dotto biliare dal movimento caudale dell&#39;intestino (Figura 3). </li><li> Separare con attenzione il dotto biliare dalaccompagnamento vena porta e dell&#39;arteria epatica utilizzando un micro-dentellature pinza (Figura 4A). </li><li> Posizionare il 5-0 sutura intorno al dotto biliare e fissarlo con due nodi chirurgici. Nel legare i nodi aumentano la forza di trazione continuamente per garantire ostruzione efficace senza recidere il dotto biliare (Figura 4B). </li><li> Aggiungere una seconda legatura cranica nello stesso modo, ma non sezionare il dotto biliare tra (Figura 4C). In caso contrario, vi è un notevole rischio che le perdite biliari se un nodo non è sicuro, e agli animali nessun colestasi ma sviluppano peritonite gravi. </li><li> Tagliare le estremità delle suture (Figura 4D), abbassare lo sterno, e rimuovere il riavvolgitore. </li><li> Risciacquare la cavità peritoneale con 0,9% di soluzione di NaCl e sostituire gli organi addominali alle posizioni fisiologiche. </li><li> Chiudere entrambi addominali strati (peritoneo e cute più plancia) con punti di sutura in esecuzione separati con 6-0 Mersilk. </li><li> Tagliare la postands delle suture e sterilizzare l&#39;area operazione con un tampone di garza inumidito con soluzione antisettica. NOTA: Quando si esegue l&#39;intervento chirurgico per la prima volta, eseguire tutte le procedure sotto un microscopio operatorio con un ingrandimento di 16X-20X. Questo permette un migliore riconoscimento del dotto biliare e chiaramente distingue dalla vena porta e l&#39;arteria epatica (figure 5 e 6). Alcuni laboratori raccomandano la dissezione del dotto biliare tra le due legature. Lasciare il dotto biliare intatto perché potenziali perdite in uno dei nodi si tradurrà in una grave peritonite acuta, ascite, e endotossemia sistemica quando il dotto biliare è sezionato. </li></ol> 3. postoperatoria trattamento e il follow-up <ol><li> Lasciare che il mouse per recuperare in una gabbia riscaldato da una lampada a infrarossi fino a quando il mouse è completamente sveglio e attivo. </li><li> Successivamente, spostare il mouse in una gabbia normale e fornire ad libitum accesso ad acqua e cibo. </li><li> Laopo l&#39;intervento chirurgico, controllare gli animali ad intervalli regolari ed effettuare il follow-up il trattamento post-operatorio con analgesia adeguata (ad esempio, la soluzione buprenorfina) in seguito alla raccomandazione locale della cura degli animali e l&#39;uso interno comitati. NOTA: Eseguire la terapia analgesica per 3 giorni. Qualsiasi comportamento anomalo può indicare complicanze rare come peritonite, sepsi o emorragie interne e deve essere trattato come endpoint umana di interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Gli animali vengono tenuti con libero accesso a cibo e acqua ad libitum fino alla fine dell&#39;esperimento. Non vi è alcuna necessità di prelievo di sangue dal fibrogenesi corso è indicato da ittero. </li><li> Quando gli animali vengono sacrificati, il sangue viene raccolto per la misura dei parametri clinici chimica (AST, ALT, bilirubina, ecc) e il fegato viene recuperato per l&#39;analisi istochimica e biochimica. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Danno epatico colestatica è uno dei principali fattori causali per lo sviluppo di fibrosi epatica e cirrosi nei pazienti con malattia epatica cronica. Sulla base del fatto che queste malattie producono costi sanitari imponderabili, è comprensibile che molti ricercatori stanno cercando di capire i meccanismi patogenetici della fibrosi epatica in corso. Pertanto, modelli sperimentali sono stati generati che imitano i vari aspetti dei complessi meccanismi che portano alla infiammazione epatica, fibrosi e cirrosi 1. Chirurgico BDL è uno dei più diffusi modelli sperimentali che viene utilizzato per indurre lesioni colestatico ostruttiva in topi e ratti 4,23,24. Nella maggior parte dei protocolli, gli animali sono anestetizzati e viene eseguita una laparotomia tronco. Successivamente, il dotto biliare è scoperto dalla cavità addominale e ligato due volte con spago chirurgica. Di conseguenza, i topi e ratti che hanno ricevuto questa chirurgia dEvelop una forte reazione fibrotica che in un primo momento provengono dai campi periportali 25. Nel corso degli anni sono state descritte diverse tecniche chirurgiche e modifiche diverse. Procedure speciali anche permettere riconnessione o reanastomosis dopo BDL 23. Altre tecniche sono basate sulla parziale BDL conseguente significativamente minore formazione di necrosi e conseguentemente epatociti proliferazione 24. Parziale BDL in combinazione con successiva rimozione della colecisti (colecistectomia), che impedisce la formazione di colecistite rappresenta anche un ottimo modello sperimentale per colestasi acuta. È stato proposto di essere un modello che è più vicino alla situazione umana 24. E infatti, durante la creazione di questo modello, si è già dimostrato che provoca riproducibile colestasi con solo il minimo danno tissutale istologico e di non luogo a colestasi cronica 25. Pertanto, è stato suggerito che questo modello è ideale per studiare late gli effetti di colestasi invertito 24. Anche metodi più sofisticati sono basati su microchirurgia e permettono un modo veloce e riproducibile per infliggere danno epatico colestatico solo in parti selezionate del fegato 26. Anche se queste modifiche sofisticati dal protocollo originale BDL sono stati dimostrati molto utili nelle indagini domande di ricerca specifiche, molti laboratori in tutto il mondo fondamentalmente lo scopo di impiegare il modello BDL come modello altamente riproducibile e affidabile per la fibrosi epatica colestatica. Tuttavia, molte complicazioni possono verificarsi che possa alterare sostanzialmente la riproducibilità e affidabilità dei risultati ottenuti da questo modello, se imprecisioni tecniche non sono evitati. Ad esempio, complicanze emorragiche legate a lesioni dei vasi sanguigni che accompagnano il dotto biliare (vedi figure 3 - 4) possono verificarsi durante o dopo l&#39;intervento chirurgico rapidamente. Sovradosaggio di anestesia con conseguente cardiodepression o rfallimento espiratory sono anche complicazioni evitabili della procedura. Infezioni gravi, che vanno da peritonite a sepsi, possono verificarsi durante l&#39;intero periodo dell&#39;esperimento, se le suture non vengono eseguite accuratamente e perdite biliari nella cavità peritoneale. Lesioni accidentali a livello intestinale durante l&#39;intervento chirurgico potrebbe anche portare alla peritonite. Pertanto, è evidente che sono fortemente necessari protocolli standardizzati che sono in conformità con le linee guida movimentazione rigorose. Questa clausola è stata anche recentemente chiesto nei paesi dell&#39;Unione europea, che ha recepito le nuove norme sul benessere degli animali nel 2013 1. I rispettivi requisiti che sono associati con questo regolamento non sono nuove e sono state già proposte nel 1959, quando Russell e Burch suggerito etico quadro per condurre esperimenti scientifici con animali che si basa principalmente su una sostituzione, miglioramento e riduzione (3R) Principio 27. Quando dopo la outlinprotocollo ed ci sono solo alcune complicazioni che potrebbero derivare da imprecisioni tecniche. Tre questioni specifiche potrebbero verificarsi in piuttosto bassa frequenza. Come per tutte le procedure chirurgiche, l&#39;overdose di anestetico è una potenziale fonte di pericolo per gli animali specialmente in combinazione con ipotermia. Se durante l&#39;intervento verificano complicanze cardiovascolari, la fornitura di anestetici deve essere immediatamente interrotto e l&#39;operatore deve cercare di fornire il più possibile di ossigeno al mouse. Questo può essere fatto per mezzo di una piccola siringa plastica che è riempito di aria e pompato nella bocca dell&#39;animale alterata. In alternativa, l&#39;uso di una piccola Peleusball per la ventilazione dell&#39;animale colpito è spesso utile per il processo di rivitalizzazione. Problemi di guarigione delle ferite Dopo l&#39;intervento chirurgico BDL, i topi possono mordere le loro giunture doloranti o quelli di altri animali. In questo caso, rispettivi topi dovrebbero essere distintamentegabbia. Gli animali con ferite aperte devono essere anestetizzati, la regione intorno alla ferita delicatamente sterilizzato con un antisettico standard e la ferita deve essere ricucita di nuovo. Durante i prossimi 3 giorni, la ferita di questi animali dovrebbero essere regolarmente ispezionati (due o tre volte al giorno). Distensioni dell&#39;addome o formazione di ascite sono indicativi per le infezioni batteriche. Questi potrebbero verificarsi a causa di lavoro non sterile durante l&#39;intervento chirurgico. Tutti i tipi di infezioni deve essere maneggiato senza eccezioni come endpoint umano e gli animali colpiti deve essere sacrificato. Abbiamo fornito un facile seguire protocollo che permette l&#39;esecuzione di BDL nei topi che è semplice da implementare e evoca la mortalità degli animali solo bassa combinata con una elevata riproducibilità. Tutti i protocolli chirurgici possono essere rapidamente fermati da scienziati qualificati. Durante la sperimentazione completa, gli animali sono mantenuti su una piastra riscaldante a 37 ° C e collegati permanentementea un sistema di anestesia minimizzare il dolore e angoscia. Per la chirurgia, l&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana e il dotto biliare doppia legatura senza analizzarlo. I risultati rappresentativi che sono state discusse qui dimostrano che le alterazioni fenotipiche in materia di morfologia del fegato (infiammazione, la fibrosi, cirrosi) sono altamente riproducibili e permettono di studiare diversi aspetti della fibrogenesi (ad es., L&#39;iniziazione, l&#39;infiammazione, la progressione, stadio terminale della malattia) in punti temporali definiti. Ci auguriamo che la sintesi del nostro protocollo contribuirà a ridurre la curva di apprendimento che è necessario stabilire con successo questo modello di fibrosi in altri laboratori e garantire risultati affidabili e riproducibili in luoghi diversi. In tal modo riteniamo che il protocollo presentato sostiene il principio 3R che avrebbe dovuto da Russell e Burch nel 1959 e rappresenta la base di nuove norme sul benessere degli animali che sono attualmente implementate in molti paesi wisottile il quadro europeo.

Fibrosi epatica è definita come la eccessiva produzione e l&#39;accumulo di matrice extracellulare (ECM) che proviene da una rete complessa di interazioni di cellule stellate epatiche matrice produttrici e una grande varietà di cellule del sangue fegato residente e cellule infiltranti 1,2. Anche se la fibrosi epatica può essere causata da una moltitudine di stimoli diversi meccanismi molecolari alla base della fibrosi sono generalmente molto simili. A seguito di danno epatico, viene avviato un programma altamente orchestrata di cambiamenti molecolari e cellulari. In questo programma di una stretta interazione tra segnali infiammatori, monociti / macrofagi e cellule stellate epatiche si verifica che i risultati finali di attivazione delle cellule stellate e transdifferenziamento di miofibroblasti, ECM deposizione e consecutivi alterazioni anatomiche e funzionali di integrità tessuto epatico 3. L&#39;attivazione delle cellule stellate epatiche è particolarmente guidato da segnali infiammatori e interazioni con il fegatomacrofagi residenziali (cioè le cellule di Kupffer). Modelli molecolari associati patogeni sono riconosciuti dai recettori di pattern recognition specializzati come i recettori Toll-like che quando il segnale attivato attraverso una complessa rete di percorsi diversi che attivano l&#39;espressione e la secrezione di una moltitudine di citochine infiammatorie e chemochine che guidano il processo infiammatorio 3. La risposta infiammatoria e l&#39;insulto epatica formato è solo temporaneo quando il fattore-malattia che producono viene rimosso. Al contrario, se la lesione persiste, infiammazione cronica evolve nel fegato e l&#39;espressione e l&#39;accumulo di folle ECM in primo piano con conseguente progressiva sostituzione del parenchima epatico normale dalla formazione di tessuto cicatriziale. Dal fibrogenesi epatica nell&#39;uomo è un problema clinico in tutto il mondo, diversi modelli di roditori sperimentali di insufficienza epatica acuta e cronica sono stati stabiliti nel corso degli ultimi decenni. Nelle muSistema rine per esempio, modelli comuni sono la somministrazione di una varietà di diversi epatotossine, la legatura del dotto biliare comune, induzione di danno epatico immuno-mediata, e l&#39;introduzione mirata di difetti genetici o viceversa la sovraespressione di transgeni che colpiscono critico vie di segnalazione coinvolte nella patogenesi della fibrosi epatica 4. Legatura del dotto biliare comune nei roditori è stata effettuata come procedura sperimentale ricerca per molti anni 5-8. Un primo protocollo altamente riproducibile per la legatura del dotto biliare prolungata (BDL) nei roditori è stato già presentato ormai più di tre decenni fa 9. In questo protocollo sia incannulamento / ostruzione e legatura indotto un alto rendimento di cirrosi nei ratti con cambiamenti morfologici che erano paragonabili a quelli osservati nella cirrosi biliare umano 9. Il rispettivo protocollo è semplice, la procedura chirurgica è relativamente rapidamente applicabile, E il tasso di sopravvivenza degli animali sono elevati con oltre il 95%. Nel protocollo di ratto incannulamento / ostruzione classica, una breve incisione di 2 cm è fatto sotto il processo xifoideo. Successivamente, una cannula viene inserito nella porzione prossimale del dotto biliare e fissato in posizione con suture di seta. In una fase successiva, la porzione distale della cannula è ostruita con 3 nodi, messo attraverso l&#39;estremità inferiore della incisione mediana e sepolto sottocutanea nel quadrante destro inferiore 9. Alla fine, l&#39;addome è chiusa e gli animali sono autorizzati a recuperare. Nel protocollo legatura, i ratti sono sottoposti a doppia legatura del dotto biliare comune con o senza dissezione del dotto biliare tra le legature 9. Questo modello sperimentale è ben accettata e utilizzata in tutto il mondo in centinaia di laboratori per indurre colestasi epatica e fibrosi. Induce intraepatica biliare proliferazione delle cellule epiteliali, differentiatio miofibroblasticon di fibroblasti portale attorno proliferanti cellule epiteliali biliari, con conseguente altamente riproducibile, espressione massiccia e deposizione di ECM 10,11. Pertanto, l&#39;applicazione di questo modello in ratti e topi è essere popolare tra gli scienziati che mirano a comprendere la patogenesi dell&#39;infiammazione epatica e fibrosi. Nel nostro laboratorio, abbiamo ampiamente utilizzato questo protocollo in passato nei ratti in diversi studi sperimentali volti ad indagare gli aspetti particolari molecolari e cellulari della fibrogenesi epatica e per testare nuovi concetti antifibrotici e farmaci 12-15. Recentemente, abbiamo adattato questa metodologia al sistema murino e ha scoperto che la chirurgia legatura del dotto biliare è anche un mezzo interessante per stabilire la fibrosi dipendenti dal tempo con una bassa variazione e mortalità nei topi 16-18. A causa delle dimensioni più piccole degli animali, tuttavia, alcune importanti modifiche per quanto riguarda l&#39;anestesia, interv chirurgicaenzione e di osservazione post-trattamento sono necessari per ottenere risultati affidabili e riproducibili in questo modello. L&#39;adattamento completo è riassunto nella seguente protocollo e nella documentazione video allegato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1185">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:263px;">Company</td>
			<td style="width:219px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:293px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:263px;">Forene Abbott</td>
			<td style="width:219px;">B 506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Shaver Favorita II</td>
			<td style="width:263px;">Aeskulap</td>
			<td style="width:219px;">GT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cutter head</td>
			<td style="width:263px;">Aeskulap</td>
			<td style="width:219px;">GT730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Bepanthen eye and nose ointment</td>
			<td style="width:263px;">Bayer Vital GmbH</td>
			<td style="width:219px;">6029009.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Warming plate and controller</td>
			<td style="width:263px;">Labotect</td>
			<td style="width:219px;">HP 062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Fluovac anesthesia system</td>
			<td style="width:263px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:219px;">34-1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser</td>
			<td style="width:263px;">Eickemeyer</td>
			<td style="width:219px;">4802885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scotch Tape</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Tissue paper</td>
			<td style="width:263px;">commercially available</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Durapore silk tape</td>
			<td style="width:263px;">3M</td>
			<td style="width:219px;">1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton Gauze swabs</td>
			<td style="width:263px;">Fuhrmann GmbH</td>
			<td style="width:219px;">32014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Poly-Alcohol Haut&#8230;farblos Antisepticum</td>
			<td style="width:263px;">Antiseptica GmbH</td>
			<td style="width:219px;">72PAH200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Raucodrape OR adhesive drapes</td>
			<td style="width:263px;">Lohmann &#38; Rauscher GmbH</td>
			<td style="width:219px;">33013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Scissor</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">14074-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Graefe forceps straight</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11050-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">6-0 Mersilk suture</td>
			<td style="width:263px;">Ethicon</td>
			<td style="width:219px;">K889H</td>
			<td>Silk, non-absorbable/Abdominal closure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Needle holder Mathieu</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">12010-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Colibri retractor</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">17000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton swabs</td>
			<td style="width:263px;">Noba Verbandmittel</td>
			<td style="width:219px;">974202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Cotton swabs</td>
			<td style="width:263px;">Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td>
			<td style="width:219px;">1032238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">25mL beaker</td>
			<td style="width:263px;">Schott Duran</td>
			<td style="width:219px;">50-1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Isotonic (0.9%) NaCl solution</td>
			<td style="width:263px;">DeltaSelect GmbH</td>
			<td style="width:219px;">PZN 00765145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Micro-serrations forceps Moria MC31</td>
			<td style="width:263px;">Fine Science Tools Inc.</td>
			<td style="width:219px;">11370-31</td>
			<td>Bile duct separation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">5-0 Mersilene suture</td>
			<td style="width:263px;">Ethicon</td>
			<td style="width:219px;">EH6731H</td>
			<td>Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">5mL syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Discardit II</td>
			<td style="width:219px;">300296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">1mL syringe</td>
			<td style="width:263px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:219px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Sterican needle 26 G x 1</td>
			<td style="width:263px;">B. Braun</td>
			<td style="width:219px;">4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:263px;">Essex Pharma</td>
			<td style="width:219px;">997.00.00</td>
			<td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:411px;">Infrared lamp</td>
			<td style="width:263px;">Petra Electric</td>
			<td style="width:219px;">IR 11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bile duct ligation in mice: induction of inflammatory liver injury and fibrosis by obstructive cholestasis

Nella maggior parte dei vertebrati, il fegato produce bile che è necessario per emulsionare i grassi assorbiti e consentire la digestione dei lipidi nell&#39;intestino tenue e di espellere bilirubina e altri prodotti metabolici. Nel fegato, l&#39;ostruzione sperimentale del sistema biliare extraepatica innesca una complessa cascata di eventi patologici che porta a colestasi e infiammazione conseguente forte reazione fibrotica proveniente dai campi periportali. Pertanto, legatura chirurgica del dotto biliare comune è diventato il modello più comunemente usato per indurre lesioni colestatica ostruttiva nei roditori e di studiare gli eventi molecolari e cellulari che sono alla base di questi meccanismi fisiopatologici indotti da inadeguato flusso biliare. Negli ultimi anni, sono state descritte diverse tecniche chirurgiche che o permettono riconnessione o reanastomosis dopo legatura del dotto biliare (BDL), ad esempio, parziali BDL, o altri metodi di microchirurgia per domande di ricerca specifiche. Tuttavia, il modello utilizzato più frequentemente è la completa ostruzione del dotto biliare comune che induce una forte risposta fibrotica dopo 21 a 28 giorni. Il tasso di mortalità può essere elevato a causa di complicanze infettive o imprecisioni tecniche. Qui forniamo una procedura chirurgica dettagliato per il modello BDL nei topi che inducono una risposta fibrotica altamente riproducibile in base alla regola 3R per il benessere degli animali postulata da Russel e Burch nel 1959.

In una sperimentazione tipica BDL è stata eseguita in 40 maschi C57BL / 6 topi wild-type pesando circa 18-20 grammi. Questo esperimento è stato fatto per indagare fibrogenesi epatica nella fase di apertura (3 e 7 giorni), durante la progressione (10, 14, e 20 giorni), e durante lungo termine (30 e 60 giorni) 16. In questo modello, la fibrosi persinusoidal ha già sviluppato il giorno 10 dopo l&#39;intervento chirurgico, mentre fibrosi periportale che l&#39;aumento permanente fino alla fine dell&#39;esperimento era pienamente sviluppata dopo 20 giorni. Nell&#39;esperimento menzionato, tutti gli animali che hanno ricevuto una semplice farsa-operazione sono sopravvissuti, e solo due dei 40 topi (5%) che hanno ricevuto BDL sviluppato scadenti condizioni generali e sono stati quindi prematuramente sacrificati prima del punto finale programmata dell&#39;esperimento. L&#39;attività di animali sham era senza eccezioni già normale un giorno dopo laparotomia, mentre la maggior parte degli animali sottoposti a BDL hanno mostrato una ridotta attività durante i primi tre giorni. Jpelle aundiced era già evidente in tutti gli animali BDL uno o due giorni dopo l&#39;impostazione del BDL 16. I valori di entrambi alanina aminotransferasi (ALT) e di aspartato transaminasi (AST) che rappresentano markers sierici consolidate di danno epatico aumentano rapidamente e ha raggiunto il picco durante il giorno 7 e il giorno 20 dopo BDL (Tabella 1). Successivamente, ALT e AST sono costantemente diminuiti fino al giorno 30 e sono rimasti stabili fino a 60 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. In linea con l&#39;infortunio colestatica, le concentrazioni sieriche di bilirubina totale sono stati costantemente elevato e ha raggiunto un plateau dopo 7 giorni 16. Decorso simile di attività di ALT e AST sierici sono stati anche segnalati per i ratti sottoposti BDL. In un recente studio è stato dimostrare che AST e ALT livelli aumentati fino a 5 o 10 volte di normale nella prima settimana dopo l&#39;intervento chirurgico BDL e diminuito dopo due settimane 19. In genere, i fegati di animali sham sembrano ancora smooth alla fine dell&#39;esperimento, mentre i fegati di animali che hanno ricevuto BDL mostrano alterazioni architettoniche caratterizzate principalmente dalla formazione di edema e fibrotiche noduli sulla superficie corrispondente fegato e idrope della cistifellea che viene riempito con grandi quantità di bile (Figura 7). Le caratteristiche alterazioni morfologiche del fegato che sono indotte dalla chirurgia BDL sono dimostrabili nella norma analisi istologica (figura 8). Nella stessa serie di esperimenti, lo sviluppo di fibrosi epatica era semi-quantitativamente valutati sulla base istologia epatica valutati da un patologo cieco utilizzando un sistema di punteggio in cui fibrosi periportale stato organizzato 0-4 e fibrosi perisinusoidale 0-2, con un massimo valore che era equivalente a cirrosi di 6. Come previsto, il punteggio di fibrosi media nel gruppo di animali sham era 0.00 ± 0.00. Al contrario, nel gruppo di animali tcappello ricevuto BDL, il punteggio è aumentato costantemente fino al giorno 60 per un valore di 4,83 ± 0,17. È stato raggiunto il massimo di 3 fibrosi periportale al giorno 20. In tutti gli animali analizzati, fibrosi perisinusoidale era assente durante i primi 10 giorni dell&#39;esperimento ed era evidente in primo luogo dopo due settimane. Successivamente, è aumentato costantemente fino alla fine dell&#39;esperimento a valori di 1,8 ± 0,17 (Tabella 1). Anche in diversi altri esperimenti su animali indipendenti che sono state eseguite, si è osservato che la formazione di fibrosi era altamente riproducibile aumento dipendente dal tempo proiezione di espressione collagene intraepatica e la deposizione in conseguenza di fibrogenesi in corso (Figura 9). Analogamente, il processo di fibrogenesi in corso è evidente in elevata espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) che rappresenta un marcatore di cellule fibroblastiche, cioè attivato epatica cellule stellate e miofibroblasti portali,e idrossiprolina epatica, un aminoacido abbondantemente trovato in collagene matrici 18 (Figura 9). Inoltre, l&#39;espressione di vimentina che indica quantità crescenti di miofibroblasti o fibroblasti aumenta dopo l&#39;impostazione della chirurgia BDL 20. La concomitanza di infiammazione in fegati feriti sono ulteriormente riflessa da una maggiore espressione di lipocalina 2 (Lipocalina-2), che è fortemente indotta durante lesioni epatiche acute e croniche e si evolve effetti epato-protettiva durante lesioni epatiche acute 21,22. Cellule infiammatorie che infiltrano i fegati di animali che hanno ricevuto BDL possono essere rilevati mediante colorazione con un anticorpo specifico che è specifico per CD45 (Figura 10). Questo marcatore superficie cellulare che è anche conosciuto come PTPRC (proteina tirosina fosfatasi, tipo recettore) è specificamente espresso in tutte le cellule ematopoietiche differenziate tranne eritrociti e plasmacellule. <table fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot; border = &quot;0&quot; cellpadding = cellspacing &quot;0&quot; = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo dopo legatura del dotto biliare (giorni) </td><td> Bilirubina totale </td><td rowspan="2"> AST (U / L) </td><td rowspan="2"> ALT (U / L) </td><td rowspan="2"> Fibrosi portale </td><td rowspan="2"> Fibrosi perisinusoidale </td><td rowspan="2"> Punteggio totale </td></tr><tr><td> (Mg / dL) </td></tr><tr><td> 0 (n = 3) </td><td> 0.17 ± 0.06 </td><td> 192,67 ± 30,50 </td><td> 50.33 ± 6.03 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 3 (n = 5) </td><td> 6.85 ± 2.21 </td><td> 1159,25 ± 319,27 </td><td> 566,50 ± 335,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 7 (n = 5) </td> &lt;td&gt; 14.38 ± 2.14 ± </td><td> 976,60 ± 477,16 </td><td> 448,20 ± 259,47 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0.60 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 10 (n = 5) </td><td> 15.92 ± 2.60 </td><td> 1916,60 ± 868,25 </td><td> 560,40 ± 80.88 </td><td> 1.40 ± 0.25 </td><td> 0.25 ± 0.25 </td><td> 1.67 ± 0.25 </td></tr><tr><td> 14 (n = 5) </td><td> 17.90 ± 3.84 </td><td> 1088,60 ± 276,32 </td><td> 505,00 ± 96.15 ± </td><td> 2.4 ± 0.25 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 3.40 ± 0.24 </td></tr><tr><td> 20 (n = 4) </td><td> 18.00 ± 2.12 </td><td> 1072,67 ± 364,27 </td><td> 404,00 ± 195,48 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.0 ± 0.0 </td><td> 4.0 ± 0.0 </td></tr><tr><td> 30 (n = 5) </td><td> 16.04 ± 4.79 </td><td> 446,40 ± 169,75 </td><td> 260,20 ± 126,97 </td><td> 2.8 ±; 0.2 </td><td> 1.4 ± 0.25 </td><td> 4.20 ± 0.20 </td></tr><tr><td> 60 (n = 6) </td><td> 16.02 ± 1.19 </td><td> 484,67 ± 117,79 </td><td> 257,17 ± 50.97 </td><td> 3.0 ± 0.0 </td><td> 1.8 ± 0.17 </td><td> 4.83 ± 0.17 </td></tr></tbody></table> Abbreviazioni utilizzate sono: ALT, alanina aminotransferasi; AST, aspartato aminotransferasi. Tabella 1: Fibrosi aver realizzato in un esperimento rappresentativo I dati di questa tabella è stata riprodotta da uno studio in cui la fibrosi epatica è stata indotta dal condotto biliare legatura in topi C57BL / 6 16.. In questo studio, il tasso di mortalità dopo l&#39;intervento chirurgico BDL era del 5% (2 su 40 animali sono stati prematuramente sacrificati perché alle norme di polizia cattive sviluppati). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig1highres.jpg" /> Figura 1: installazione sperimentale per l&#39;esecuzione di una bilecondotto di legatura. L&#39;animale è mantenuto su una piastra di riscaldamento alla temperatura di 37 ° C e la zona operativa è coperta complessiva con, tende autoadesive impermeabile al fluido. Durante l&#39;intervento completo, l&#39;animale è permanentemente collegata ad un sistema di anestesia. Tutte le strumentazioni e soluzioni (analgesici, anestetici, soluzione antisettica, 0,9% NaCl) sono disposti in modo chiaro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Preparazione dell&#39;area chirurgia apertura Prima della cavità peritoneale, la cute addominale deve essere rasato con un rasoio elettrico pelliccia e disinfettato con un tampone di garza antisettica. L&#39;area di intervento viene poi ricoperto con, tende autoadesive impermeabile al fluido. L&#39;addome è aperto con una laparotomia mediana (~ 2 cm di lunghezza). La cavità è allargata inserendo una sutura tenendo in sterno e l&#39;area funzionamento diffusa dal&#39;inserimento di un divaricatore Colibri permette la sperimentazione senza ostacoli durante l&#39;intervento chirurgico. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig3highres.jpg" /> Figura 3: Esposizione del dotto biliare. (A) Per condurre la legatura del dotto biliare, la parte ventrale del fegato viene sollevato in modo che possa aderire alla membrana e l&#39;ilo epatica diventa chiaramente visibile. (B) Per esporre meglio il dotto biliare, l&#39;intestino viene mosso con caudalmente un batuffolo di cotone inumidito. Il dotto biliare è contrassegnato da una freccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig4highres.jpg" /> Figura 4: legatura del dotto biliare. (A) In una prima fase, il dotto biliare è separato accuratamente dal fiancheggiamento vena porta e l&#39;arteria epatica usando un micro-dentatura pinze. (B) Successivamente, una sutura è disposto intornodotto biliare e fissata con un nodo chirurgico. (C) Successivamente, una seconda sutura è posizionata in prossimità della prima sutura e annodato intorno al dotto biliare. (D) La sutura viene accorciato, la cavità risciacquati con 0,9% di soluzione di NaCl , e tutti gli organi sostituiti alla loro posizione fisiologica. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig5highres.jpg" /> Figura 5:.. Rappresentazione precisa di annodatura Per documentare la collocazione delle suture e l&#39;impostazione dei due nodi che impediscono il flusso biliare, la stessa procedura descritta in figura 4 è stata documentata sotto binoculare (A) confinamento del dotto biliare con il (C) confinamento del dotto biliare con la seconda sutura prima sutura. (B) annodamento del primo suture.. (D) Knotting della seconda sutura. (E) a doppia legatura bile dUCT dopo accorciamento delle suture in eccesso. (E &#39;) Questo pannello raffigura uno schizzo di (E). Le posizioni della destra (rl), a sinistra (ll) e mediana (ml) lobi del fegato e del dotto biliare, stomaco e del duodeno sono da lettere. Nello schizzo del dotto biliare è doppia legatura da due punti di sutura. <img alt="Figura 6" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig6highres.jpg" width="400" /> Figura 6:. Anatomia del dotto biliare, vena e arteria epatica nei topi Per una migliore localizzazione anatomica del dotto biliare comune, vena porta e l&#39;arteria epatica sono raffigurati come schema. Contrassegnati sono anche le posizioni di destra (rl), a sinistra (ll) mediana (ml) e le caudato (cl) lobi del fegato. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig7highres.jpg" /> Figura 7: appeara Rappresentantence di fegatini di due settimane dopo l&#39;operazione sham e BDL. C57BL / 6 topi sono stati sottoposti a sham operazione o intervento chirurgico BDL. Dopo due settimane cavità viscerale è stato aperto. Mentre i fegati di animali sham hanno mostrato alcun segno di fibrosi, fegato di animali che ricevono legatura del dotto biliare avevano una struttura superficiale irregolare con formazione di edema e noduli fibrotici sulla superficie di fegati corrispondenti. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig8highres.jpg" /> Figura 8:. Ematossilina eosina macchia sezioni di fegato sono stati preparati da C57BL / 6 di tipo animali selvatici che erano sham-operated (A) o ricevuti BDL per tre settimane (B). Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina seguenti procedure standard. Si prega di notare le alterazioni tipiche nel fegato BDL che includono segni di infiammazione (infiltranti celle), parenchimale (epatocyte) necrosi, e la proliferazione dei dotti biliari. La barra di scala in ogni pannello figura rappresenta 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig9highres.jpg" /> Figura 9: letture istologici e biochimici per fibrogenesi epatica. (A) sezioni di fegato sono stati preparati da animali che hanno ricevuto operazione sham o BDL per 2 settimane e colorate con Sirius Red (pannello superiore, le fibre di collagene in rosso) o analizzati per l&#39;espressione di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) (pannello inferiore , α-SMA cellule positive in marrone) di immunoistochimica. La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 100 micron. (B) Gli estratti proteici da fegati sono stati sottoposti a Western Blot e analizzato per espresfissione di collagene di tipo I, α-SMA, e Vimentin che sono ben marcatori di fibrogenesi epatica stabilito. L&#39;espressione di lipocalin-2 (Lipocalina-2) indica la risposta infiammatoria associata con fibrogenesi in corso. In questa analisi, la parità di proteine ​​di carico è stata dimostrata sondando le macchie con un anticorpo specifico per β-actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig10highres.jpg" /> Figura 10:. Colorazione immunologica di infiltrarsi cellule infiammatorie sezioni di fegato seriali sono state preparate da un fegato di un animale che ha ricevuto condotto biliare legatura per 3 settimane. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (A) o con un anticorpo che è specifico per CD45 (B). Notare che,l&#39;elevato numero di cellule positive CD45 circondano i dotti biliari. Questi infiltrati massicce che indicano l&#39;infiammazione non sono visibili in sezioni di fegato derivati ​​da animali sham (non mostrato). La barra di scala in ogni pannello cifra rappresenta 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

Bile Duct Ligation in topi: Induzione infiammatoria epatica Lesioni e fibrosi da colestasi ostruttiva

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

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51.4K Views.  RWTH Aachen University. Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.

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3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

In organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is indispensable for proper physiological function, and the formation and maintenance of these structures is a highly regulated process. The analysis of these complex, 3-dimensional structures has greatly depended on either 2-dimensional examination in section or on dye injection studies. These techniques, however, are not able to provide a complete and quantifiable representation of the ductal or vascular structures they are intended to elucidate. Alternatively, the nature of 3-dimensional plastic resin casts generates a permanent snapshot of the system and is a novel and widely useful technique for visualizing and quantifying 3-dimensional structures and networks.
A crucial advantage of the resin casting system is the ability to determine the intact and connected, or communicating, structure of a blood vessel or duct. The structure of vascular and ductal networks are crucial for organ function, and this technique has the potential to aid study of vascular and ductal networks in several ways. Resin casting may be used to analyze normal morphology and functional architecture of a luminal structure, identify developmental morphogenetic changes, and uncover morphological differences in tissue architecture between normal and disease states. Previous work has utilized resin casting to study, for example, architectural and functional defects within the mouse intrahepatic bile duct system that were not reflected in 2-dimensional analysis of the structure1,2, alterations in brain vasculature of a Alzheimer's disease mouse model3, portal vein abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic mice4, developmental steps in rat lymphatic maturation between immature and adult lungs5, immediate microvascular changes in the rat liver, pancreas, and kidney in response in to chemical injury6.
Here we present a method of generating a 3-dimensional resin cast of a mouse vascular or ductal network, focusing specifically on the portal vein and intrahepatic bile duct. These casts can be visualized by clearing or macerating the tissue and can then be analyzed. This technique can be applied to virtually any vascular or ductal system and would be directly applicable to any study inquiring into the development, function, maintenance, or injury of a 3-dimensional ductal or vascular structure.

A method of visualizing and quantifying the 3-dimensional structure of mouse hepatic portal vein or intrahepatic bile duct is described. This resin cast technique can also be applied to other ductal or vascular systems and allows for in situ visualization or quantification of a system's intact communicating architecture.

3-Dimensional Casting resina e imaging di Vena mouse portale o sistema biliare intraepatica Duct

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

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Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Ischemia-riperfusione Modello di danno renale acuta e post Infortunio fibrosi nei topi

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Lesioni chirurgica al pancreas mouse attraverso la legatura del Dotto pancreatico come un modello per Endocrine e Esocrine riprogrammazione e la proliferazione

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

Il dimetilnitrosamina indotta fibrosi epatica modello nel ratto

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

Induzione di aterosclerosi accelerata nei topi: il modello "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Inducing Acute Lung Injury in Mice by Direct Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. Various approaches have been described, such as the inhalation of aerosolized LPS as well as nasal or intratracheal instillation. The presented protocol describes a detailed step-by-step procedure to induce ALI in mice by direct intratracheal LPS instillation and perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, and lung tissue. After intraperitoneal sedation, the trachea is exposed and LPS is administered via a 22 G venous catheter. A robust and reproducible inflammatory reaction with leukocyte invasion, upregulation of proinflammatory cytokines, and disruption of the alveolo-capillary barrier is induced within hours to days, depending on the LPS dosage used. Collection of blood samples, BAL fluid, and lung harvesting, as well as the processing for FACS analysis, are described in detail in the protocol. Although the use of the sterile LPS is not suitable to study pharmacologic interventions in infectious diseases, the described approach offers minimal invasiveness, simple handling, and good reproducibility to answer mechanistic immunological questions. Furthermore, dose titration as well as the use of alternative LPS preparations or mouse strains allow modulation of the clinical effects, which can exhibit different degrees of ALI severity or early vs. late onset of disease symptoms.

Presented here is a step-by-step procedure to induce acute lung injury in mice by direct intratracheal lipopolysaccharide instillation and to perform FACS analysis of blood samples, bronchoalveolar lavage fluid, and lung tissue. Minimal invasiveness, simple handling, good reproducibility, and titration of disease severity are advantages of this approach.

Indurre lesioni polmonari acute nei topi mediante instillazione diretta del lipopolioaccaride intracheale

Airway administration of lipopolysaccharide (LPS) is a common way to study pulmonary inflammation and acute lung injury (ALI) in small animal models. ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic fatty liver disease, metabolic liver disease, and liver cancer) requires experimental manipulation of animal models and in vitro cell cultures. Both techniques have limitations, such as the requirement of large numbers of animals for in vivo manipulation. However, in vitro cell cultures do not reproduce the structure and function of the multicellular hepatic environment. The use of precision-cut liver slices is a technique in which uniform slices of viable mouse liver are maintained in laboratory tissue culture for experimental manipulation. This technique occupies an experimental niche that exists between animal studies and in vitro cell culture methods. The presented protocol describes a straightforward and reliable method to isolate and culture precision-cut liver slices from mice. As an application of this technique, ex vivo liver slices are treated with bile acids to simulate cholestatic liver injury and ultimately assess the mechanisms of hepatic fibrogenesis.

This protocol provides a simple and reliable method for the production of viable precision-cut liver slices from mice. The ex vivo tissue samples can be maintained under laboratory tissue culture conditions for multiple days, providing a flexible model to examine liver pathobiology.

Murine Precision-Cut Liver Slices come un modello Ex Vivo di biologia del fegato

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, including ischemia-reperfusion injury (IRI) of extrahepatic organs. This model requires numerous experiments and devices. The duration of anhepatic phase is closely related to the time to develop IRI after transplantation. In this experiment, we used hemodynamic changes to induce extrahepatic organ damage in rats and determined the maximum tolerance time. The time until the most severe organ injury varied for different organs. This method can easily be replicated and can also be used to study IRI of the extrahepatic organs after liver transplantation.

This paper provides a detailed description of how to build an animal model of the anhepatic phase (liver ischemia) in rats to facilitate basic research into ischemia-reperfusion injury after liver transplantation.

Lesione da ischemia-riperfusione dell'organo simulando cambiamenti emodinamici nel modello di trapianto di fegato di ratto

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...