Questo video dimostra la produzione e l'applicazione di fette di fegato tagliate con precisione come modello sperimentale ex vivo di biologia dei tessuti epatici. Le fette di fegato tagliate con precisione occupano una nicchia sperimentale che esiste tra studi sugli animali in vivo e metodi di coltura cellulare in vitro. Questa tecnica ha diversi benefici chiave rispetto agli studi sugli animali in vivo, tra cui la capacità di utilizzare campioni di controllo e trattamento dallo stesso fegato, l'isolamento del tessuto epatico per rimuovere gli effetti fuori bersaglio da altri sistemi di organi e la capacità di utilizzare reagenti che potrebbero avere un effetto negativo se applicati a un intero topo vivente, ad esempio inibitori tossici della via.
La tecnica prevede l'utilizzo di una lama vibrante lateralmente per tagliare fette di fegato ultrasottili di tessuto epatico vitale seguite da coltura tissutale di laboratorio. Le vibrazioni della lama prevengono lo strappo causato da sollecitazioni di taglio. In questo esempio, mostreremo le tecniche per i preparati di fette di fegato ex vivo vitali e dimostreremo l'utilità della coltura delle fette epatiche in esperimenti di esempio in cui questo tessuto ex vivo viene trattato con acidi biliari per stimolare la lesione epatica colestatica per valutare i meccanismi della fibrogenesi epatica.
Inserire la lama nel braccio di taglio. Disinfettare la lama e il braccio di taglio con una soluzione di etanolo al 70%. Fare sempre attenzione a evitare il contatto con la lama.
Disinfettare il vassoio tampone con una soluzione di etanolo al 70% e pulire con un tessuto sterile. Inserire il vassoio tampone nel vibratomo e stringere la vite di montaggio. Impostare il braccio di taglio sulla massima altezza disponibile.
Controllare l'angolo della lama. Sul nostro vibratomo, usiamo un angolo di 10 gradi dall'orizzontale, con la lama inclinata verso il campione. Assicurarsi che l'angolo della lama sia ben fissato.
Disinfettare il porta campioni, ancora una volta, con una soluzione di etanolo al 70%. Collegare l'acqua di raffreddamento per il dispositivo di raffreddamento termoelettrico Peltier, situato sotto il vassoio tampone. Alcuni modelli di vibratomo utilizzano invece un bagno di ghiaccio per il raffreddamento.
Fissare il tubo di scarico dell'acqua a uno scarico e accendere l'acqua. Impostare il dispositivo di raffreddamento a quattro gradi Celsius. Aggiungere il tampone Krebs-Henseleit ghiacciato al vassoio tampone.
Tutti gli strumenti chirurgici e i materiali dovrebbero essere sterili. I topi dovrebbero essere profondamente anestetizzati o eutanasiati. Le superfici della pelle sui topi sono state disinfettate bagnando con una soluzione di etanolo al 70%.
Fai un'incisione della linea mediana nella pelle dalla base della cavità addominale al diaframma. Utilizzando forcep e forbici pulite, aprire la cavità addominale. Rimuovere rapidamente il fegato, senza danneggiare i lobi.
Spingere il fegato verso il basso e tagliare il tessuto connettivo nella parte superiore del fegato. Spingere il fegato verso l'alto. Tenere l'area vascolare centrale del fegato con le forcep e tirare verso l'alto.
Tagliare i vasi sanguigni del tessuto connettivo. Fare attenzione a non danneggiare i lobi del fegato e, inoltre, fare attenzione a non tagliare nel tratto gastrointestinale. Mettere il fegato rimosso in un piatto sterile di tampone Krebs-Henseleit ghiacciato.
Separare il fegato in singoli lobi. Selezionare un lobo di fegato e posizionare il lato piatto verso il basso su un nuovo piatto sterile. Tieni altri lobi sul ghiaccio nel buffer Krebs-Henseleit.
Tagliare i bordi dei lobi epatici. Il taglio è importante, in particolare sul bordo che contatterà prima la lama da taglio, poiché avere un bordo tissutale relativamente perpendicolare alla lama di taglio impedirà la compressione tissutale che può verificarsi ad angoli poco profondi. Tagliare il tessuto intorno agli altri tre bordi rimuove gran parte delle capsule fibrose sul bordo del tessuto e in genere consente una rimozione più facile delle fette di tessuto.
Posizionare un sottile strato di colla cianoacrilato sul bordo anteriore del supporto del campione, leggermente più grande dei lobi epatici tagliati. Rimuovere eventuali residui di tampone dal tessuto utilizzando materiale assorbente sterile. Posizionare il lobo del fegato sulla colla cianoacrilato, con il bordo più grande rivolto verso la parte anteriore.
Lasciare curare in aria per uno o due minuti. Posizionare il tessuto attaccato al supporto del campione nel vibratomo. Imposta la velocità del vibratomo.
Abbassare la lama di taglio fino a quando non si trova appena sopra il lobo epatico. Eseguire il braccio di taglio vibrante sul campione. La vibrazione della lama su questa macchina viene attivata dal pedale.
Riportare la lama all'indietro e abbassare l'altezza della lama di 250 micrometri. Ripetere questo processo fino a quando lo strato superiore del tessuto non viene rimosso. Scartare le prime una o due fette, poiché queste conterranno la capsula di Glisson e, quindi, non conterranno molto tessuto epatico funzionale.
Per tagliare le fette di fegato, far avanzare lentamente la lama vibrante nel tessuto ruotando il manico. Utilizzare un piccolo pennello per guidare delicatamente il tessuto durante il processo di taglio. Utilizzare il pennello per raccogliere la sezione del tessuto tagliato, quindi posizionare la sezione del tessuto in un tubo sterile contenente il tampone Krebs-Henseleit per la conservazione.
Quando non è in uso, tenere questo tubo sul ghiaccio. Alcune volte, il tessuto si strappa durante il processo di taglio, ma per la maggior parte degli scopi, il tessuto è ancora utilizzabile. Tagliare le fette di tessuto fino a vicino alla colla cianoacrilato.
Non tagliare nella colla. Ripetere con gli altri lobi epatici, che sono seduti sul ghiaccio, fino a ottenere il numero richiesto di fette di tessuto. Per pulire il supporto del campione, utilizzare una lama per raschiare la miscela colla-tessuto o la miscela può essere ammorbidita utilizzando solventi come acetone o solfossido di dimetile.
In una cappa di coltura tissutale, pipetta un mL di supporto Williams'E contenente il 10% di siero bovino fetale e antimicrobici in una piastra da 12 potte. Rimuovere le fette di tessuto ruotando delicatamente la miscela e la punta in un piatto sterile. Tagliare il tessuto in una dimensione approssimativamente uniforme.
In questo esempio, abbiamo mirato a fette di tessuto con una superficie di circa 50 millimetri quadrati. Fare attenzione ad esaminare le fette di tessuto per verificarne la consistenza. Le fette più scure suggeriscono che lo spessore del tessuto è aumentato e dovrebbe essere scartato.
Fette più leggere suggeriscono la presenza di colla cianoacrilato stagionata e devono essere scartate. Trasferire le fette di tessuto nella piastra da 12 pozzi contenente un millilitro di supporto. Incubare le fette di fegato in normali condizioni di coltura tissutale.
Se possibile, utilizzare metodi per migliorare la disponibilità di ossigeno per le fette di tessuto. Il giorno dopo, cambiare il supporto utilizzando una pipetta manuale per prevenire la perdita di tessuto per aspirazione. Le fette di fegato tagliate con precisione sono ora pronte per l'uso sperimentale.
Per la nostra applicazione, abbiamo trattato le fette di fegato con acidi biliari per due giorni e omogeneizzato nel tampone di lisi per l'estrazione dell'RNA messaggero e l'analisi qPCR. Per esaminare la fattibilità delle fette di fegato tagliate con precisione nel tempo, abbiamo usato i livelli di ATP come proxy per la vitalità delle cellule. I livelli di ATP sono stati normalizzati in proteine e sono stati misurati in più punti di tempo dopo l'isolamento.
I livelli di ATP sono diminuiti nei campioni immediati e di un'ora, tuttavia questo è stato recuperato di tre ore. In seguito, i livelli di ATP sono stati mantenuti per cinque giorni, anche se hanno fatto tendenza al ribasso nel tempo. La colorazione H&E è stata utilizzata per esaminare le fette di fegato tagliate con precisione che sono state mantenute in coltura per un massimo di cinque giorni.
La morfologia tissutale era indicativa di alcune necrosi che si verificavano al secondo giorno, con una grave necrosi che si verificava entro il quinto giorno. A causa della necrosi che si verifica tra i due e i cinque giorni, consigliamo che l'utilità sperimentale di questa tecnica sia limitata a circa tre giorni. Tuttavia, questo potrebbe essere migliorato utilizzando migliori tecniche di erogazione di ossigeno alle fette di tessuto.
Le fette di fegato tagliate con precisione sembrano anche avere un ispessimento delle fibre di collagene rispetto al tempo in coltura. Ciò è indicativo di processi fibrogenici spontanei che si verificano. Nell'esperimento di esempio, le fette di fegato tagliate con precisione sono state trattate con tre acidi biliari separati per due giorni, per imitare la colestasi epatica.
Osservando l'espressione dell'mRNA di tre geni specifici del colanogiocita, i due acidi biliari coniugati, acidi glicolico e taurocolico, hanno aumentato significativamente l'espressione sia della citocheratina-19 che della connexin-43. Questo è coerente con lo sviluppo dei conlangiociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare fette di fegato tagliate con precisione e come eseguire la coltura tissutale di base.
Le fette di fegato tagliate con precisione possono essere utilizzate per una vasta gamma di applicazioni, tra cui indagini sperimentali nell'espressione dell'RNA, espressione proteica, epigenetica, legame del DNA, metabolismo, meccanismi di infezione, invasione del cancro, farmacologia, biologia cellulare e studi di secrezione, solo per citarne alcuni.
