La tecnica consente la diagnosi di conferma delle malattie da prioni mediante la tecnica della scrapie PrP nei tessuti, analizzando i tipi di scrapie PrP e la distribuzione per valutare la deviazione punitiva al profilo noto di deposizione della scrapie PrP. La tecnica è standardizzata e utilizza anticorpi specifici contro la scrapie PrP, consentendo la visualizzazione della deposizione di scrapie PrP nei tessuti. La tecnica fornisce anche informazioni sull'area neuroanatomica e sul tipo di cellule.
Inizia posizionando i vetrini con le sezioni di tessuto in un cestello colorante in acciaio inossidabile. Far emergere il cesto in un bagno di xilene. Dopo tre minuti, rimuovere e immergere nuovamente il cestello.
Per rimuovere lo xilene e reidratare le sezioni, immergere il cestello in un bagno di etanolo assoluto. Dopo tre minuti, rimuovere e immergere nuovamente il cestello. Asciugare all'aria le sezioni prima di metterle in un bagno di etanolo al 90% per un minuto.
Quindi, trasferire la sezione in un bagno di etanolo al 70% per un altro minuto. Per ogni trattamento con bagno di etanolo, agitare delicatamente il cestello di scorrimento due volte e scolare il cestello prima del trasferimento successivo. Trasferire il cestello in un bagno di etanolo al 50% per un minuto.
Immergere accuratamente le sezioni di tessuto in acido formico al 98% a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare le sezioni in acqua di rubinetto per cinque minuti, quindi risciacquare due volte in acqua distillata. Utilizzare un contenitore di colorazione in acciaio inossidabile nella camera a pressione riempito con 500 millilitri di acqua distillata per pretrattare il tampone citrato da 10 millimolari a 98 gradi Celsius per 20 minuti.
Ai fini del controllo qualità, posizionare una sezione di nastro adesivo per autoclave sul cestello per monitorare la temperatura e la pressione. Una volta che l'allarme indica che l'apparecchiatura ha raggiunto il tempo e la temperatura del programma, immergere il cestello con le diapositive. Quindi, avviare il programma sulla camera di pressione per impostare il punto 2 e registrare la pressione iniziale e finale di questo programma.
Per l'inattivazione della perossidasi endogena, immergere il cestello del vetrino contenente le sezioni del campione in un bagno di perossido di idrogeno al 3% in metanolo per 30 minuti. Colmare le sezioni sotto l'acqua corrente per cinque minuti Dopo il drenaggio, immergere le sezioni in soluzione salina tamponata Tris per altri cinque minuti. Per il rilevamento immunologico, posizionare ogni vetrino su un supporto per piastra di copertura disponibile in commercio pre-inumidito con soluzione salina tamponata Tris con il lato del tessuto rivolto verso il supporto e i bordi del vetrino coincidenti con i due punti inferiori del supporto.
Assicurarsi di evitare bolle d'aria. Tenere il gruppo portaslitta tra il pollice e l'indice. Tenere un dito sulla parte superiore del vetrino campione e l'altro sul fondo del supporto, quindi posizionare l'assieme nella galleria del sistema.
Per garantire che il set sia ben assemblato, riempire il pozzetto tra il vetrino del campione e il supporto con soluzione salina tamponata Tris senza traboccare. Da questo punto, assicurarsi che circa 80 microlitri di soluzione salina tamponata Tris debbano essere trattenuti tra il supporto e il vetrino. Non lasciare asciugare le sezioni.
Ridurre la colorazione di fondo prima del trattamento con l'anticorpo primario pre-incubando i campioni di vetrino per 30 minuti con il 20% di siero normale della stessa specie dell'ospite anticorpale secondario nella soluzione salina tamponata Tris. Senza lavare le sezioni, applicare 200 microlitri della soluzione anticorpale primaria direttamente in ciascun pozzetto del set portavetrino e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Per lavare le sezioni, riempire i pozzetti con soluzione salina tamponata Tris e attendere cinque minuti.
Ripetere il lavaggio due volte. Quindi, diluire l'anticorpo secondario biotinilato a concentrazione da 1 a 200 in soluzione salina tamponata Tris con siero di cavallo al 10%. Riparare il volume richiesto in base al numero di sezioni da trattare.
Applicare 200 microlitri di soluzione anticorpale secondaria a ciascun pozzetto del set di portavetrini. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, ripetere il lavaggio salino Tris-buffered. Per l'incubazione con perossidasi del complesso avidina-biotina, preparare il reagente 30 minuti prima dell'uso e applicare 200 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto del supporto della piastra di scorrimento.
Una volta fatto, incubare il portapiastre impostato per 30 minuti a temperatura ambiente. Il livello di immunomarcatura non specifica in animali di controllo negativi alle encefalopatie spongiformi trasmissibili note è stato determinato per interpretare correttamente l'immunomarcatura delle proteine prioniche anomale specifiche. È stato notato che la marcatura non bersaglio da parte di anticorpi anti-PrP si verifica come colorazione intraneuronale discreta del particolato fine, fili lineari irregolari di colorazione nel neuropil, marcatura diffusa non particolata in alcune aree della sostanza grigia e bianca e marcatura citoplasmatica diffusa dei neuroni.
La tabella riassume la descrizione dei tipi di proteine prioniche anomale immunomarcate osservati nell'encefalopatia spongiforme bovina, nella scrapie classica e atipica e in una malattia da deperimento cronico dei cervidi per una diagnosi positiva e criteri stabiliti per risultati negativi, inconcludenti e inadatti. Tutti i passaggi sono molto importanti. Il pH delle soluzioni e la temperatura ambiente sono caratteristiche importanti per il successo di questa tecnica.
Lo sviluppo di immunoistochimica per rilevare sia la scrapie PrP che il tipo di cellule può fornire informazioni su ciascuna cellula coinvolta nella patogenesi primaria.
